Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
340
Рис. 14.1. Схема одержання моноклопальних антитіл за
допомогою гібридомної технології (за Єліновим Н.П., 1995):
A3 — агент злиття клітин; 1 — В — клітини із селезінки імунної миші;
2 — культура мієломних клітин миші; 3 — гібридизація; 4 — гібридоми;
5 — селекція і клонування гібридом; 6 — гібридоми, які утворюють
моноклональні антитіла; 7 — введення гібридом, які утворюють
моноклональні антитіла, в організм сингенної миші; 8 — клітини гібридоми,
що утворюють моноклональні антитіла, які культивуються в культурі
тканини; 9 — вирощування гібридомних клітин, що утворюють
моноклональні антитіла, у ферментері; Igкp — імуноглобуліни в
культуральній рідині; ig ас — імуноглобуліни в асцитній рідині;
10 — висолювання Igів сульфатом амонію; 11 — стандартизація Igів;
12 — ліофілізація Igів.
ig
ig
обміну гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (ГГФРТ).
Це було використано як селективний фактор при відокремлен
ні пухлинних клітин, які не злилися з лімфоцитами, від утворе
них гібридом. Пухлинні клітини гинуть, а гібридоми, які одер
жали здатність засвоювати гіпоксантин від нормальних
лімфоцитів, виживають. Антитілоутворюючі клітини селезінки,
що не брали участі в утворенні гібридом, живуть в культурі
всього декілька днів і теж гинуть. В культурі залишаються гі
бридоми, і ті, які вижили, перевіряються на здатність синтезува
ти антитіла певної специфічності, а потім настає найбільш від
повідальний етап роботи — клонування. Необхідно виростити з
однієї клітини життєздатну популяцію гібридом (клон), які се
кретують антитіла необхідної специфічності. Зазвичай необхід
ну гібридому вдається відшукати серед тисячі до неї подібних.
Культивування виділеного клону (одержання масової
культури) проводиться наступними методами:
1) у культурі тканини – найкращий спосіб, тому що виді
лені імуноглобуліни мають високу чистоту;
2) в організмі сингенних тварин (мишей, щурів) – у вигля
ді асцитної пухлини після введення гібридомної клітин
ної зависі в черевну порожнину;
3) у ферментерах (суспензійна культура).
Асцитна пухлина — це злоякісна пухлина черевної порож
нини мишей у вигляді клітин, які знаходяться у зависі внутріш
ньочеревної рідини. Титр моноклональних антитіл в асцитній
рідині на 2–3 порядки перевищує ту кількість, яка міститься у
культуральному середовищі. Проте добування моноклональних
антитіл в умовах клітинної культури має переваги, обумовлені
більш сприятливими умовами контролю процесу біосинтезу ан
титіл, виділенням антитіл із культурального середовища і на
ступним їх очищенням.
Переведення гібридних клітин у великі об’єми середовища
при масштабному культивуванні супроводжується великими
труднощами, бо не кожен їхній клон виживає за таких умов. То
му на практиці проводиться розведення «маточних» клітин по
ступово, спочатку 1:2–1:3, а потім і більше, використовуючи
спеціальні культиватори (рис. 14.2).
Розділ14.Біотехнолоіяодержаннямонолональнихантитіл
341
Для вирощування гібридом у суспензійних культурах дуже
важливим є застосування спеціальних безсироваткових середо
вищ. Фірма Sigma (США) випустила у продаж таке середовище
(в сухому/рідкому стані) під назвою Hybry–Max, що не має си
роватки і білків. Усього в середовищі міститься 82 компоненти
(22 амінокислоти, 12 вітамінів, 27 неорганічних речовин і 21 –
решта сполук). Це амінокислоти, вітаміни, нуклеотидні попе
редники, глюкоза, ліпіди, прогестерон, неорганічні солі і мікро
елементи. Це середовище рекомендовано для злиття, клонуван
ня, вирощування гібридомних і мієлоїдних клітин, а також для
підтримки на відповідному рівні продукції антитіл.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
342
Рис. 14.2. Культиватор гібридомних клітин (загальний вигляд)
фірми ІВF biotechnics
(за Єліновим Н.П., 1995)
Розділ14.Біотехнолоіяодержаннямонолональнихантитіл
343
Моноклональні антитіла мають величезні переваги над
звичайними імунними сироватками, оскільки забезпечують уні
кальну специфічність, стандартність і високу точність дослі
джень, підвищують їх дозвільну спроможність та інформатив
ність.
Один із суттєвих недоліків звичайних антисироваток є їх
нестандартність. Від однієї тварини не можна одержати такої
кількості антисироватки, якої б вистачило для тривалого вико
ристання, а різні тварини через індивідуальні відмінності синте
зують до одного й того самого антигену різні за специфічністю і
спектром гетерогенності антитіла. Гібридоми ж продукують
необмежену кількість препарату з абсолютно стандартними
властивостями, тому що хімічна гомогенність моноклональних
антитіл не змінюється у процесі їх виробництва стабільним
гібридомним клоном. Крім того, у звичайній антисироватці спе
цифічні антитіла становлять у кращому випадку, 1–5 % від за
гальної кількості сироваткових білків. Решта — це баластні ре
човини, введення яких в організм часто призводить до
небажаних наслідків. При використанні моноклональних анти
тіл в організм вводиться невелика кількість чистого препарату,
достатнього для потрібного ефекту, але без побічних явищ.
Поряд з безперечними перевагами моноклональні антитіла
мають і недоліки, які створюють проблеми при їх практичному
використанні. Вони нестабільні при зберіганні у висушеному
стані, тоді як у суміші звичайних (поліклональних) антитіл зав
жди присутня група антитіл, стійких за вибраних умов зберіган
ня. Отже, неоднорідність звичайних антитіл дає їм додатковий
резерв стабільності при зміні зовнішніх умов, що відповідає од
ному з основних принципів надійності систем.
Моноклональні антитіла нерідко мають дуже низьку спо
рідненість з антигеном і надмірно вузьку специфічність. Це пе
решкоджає їх застосуванню проти мінливих антигенів, що ха
рактерно для інфекційних агентів і пухлинних клітин. Крім
того, моноклональні антитіла на світовому ринку мають дуже
високу вартість.
14.3. ЗАСТОСУВАННЯ МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ
Передусім їх застосовують у ветеринарії при створенні пре
паратів для діагностики вірусних інфекцій. Уже одержано гі
бридоми, в яких відбувається біосинтез моноклональних анти
тіл до епітопів вірусу венесуельського енцефаломієліту коней,
африканської чуми свиней, респіраторносинцибіального віру
су великої рогатої худоби, лейкозу, сказу, везикулярного стома
титу, грипу, парагрипу3 та інших хвороб. Заміна в традиційних
діагностикумах поліклональних антитіл на моноклональні зу
мовила створення діагностичних препаратів нового покоління.
Їх перевагами є висока специфічність дії і чутливість, що забез
печує ідентифікацію не тільки виду збудника, але і його сероти
пу. Їх можна стандартизувати, і на виготовлення діагностикумів
витрачається менше коштів. Завдяки використанню монокло
нальних антитіл вдалося підвищити ефективність таких діагно
стикумів, як імуноферментний аналіз (ІФА), реакція пасивної
гемаглютинації, імунофлуоресцентний метод.
Моноклональні антитіла використовуються також для про
ведення пасивної імунізації проти деяких вірусних захворювань
(сказу, кліщового енцефаліту та ін.).
Іммобілізовані моноклональні антитіла використовуються
як імуносорбенти, які забезпечують безперервність процесу при
очищенні інсуліну, інтерферону, соматотропного гормону та ін
ших біологічно активних речовин, біосинтез яких ґрунтується
на використанні технології рекомбінантних ДНК. Крім того,
моноклональні антитіла можуть забезпечити ефективний кон
троль ідентичності одержаних біотехнологічним шляхом у про
мислових масштабах біологічно активних білків і пептидів зі
зразками з натуральних джерел.
Моноклональні антитіла до антигенних детермінант мем
бранних білків сперматозоїдів, мічені флуоресцентними речо
винами, можна використовувати для розділення детермінова
них за статтю сперміїв для вирішення виробничих проблем.
За допомогою моноклональних антитіл можлива доставка
лікарських речовин у клітину, яка містить відповідний епітоп.
Такий підхід дає можливість підвищити ефективність лікарсь
ких препаратів проти інфекційних і ракових захворювань. Ви
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
344
Розділ14.Біотехнолоіяодержаннямонолональнихантитіл
345
користовуючи моноклональні антитіла, які одержані в резуль
таті імунізації тварин лікарськими препаратами, можна визна
чити дози цих ліків.
При аутоімунних хворобах, коли імунні клітини «повста
ють» проти власних органів і тканин, моноклональні антитіла
відповідної специфічності можуть зв’язувати антитіла, які зав
дають шкоди організму. Для лікування раку пропонують вико
ристовувати моноклональні антитіла, кон’юговані з токсични
ми для ракових клітин сполуками. Моноклональні антитіла
доставляють отруту точно за адресою, уникаючи зараження здо
рових клітин. Тому до моноклональних антитіл можна приєд
нати дуже сильні токсини.
Моноклональні антитіла викликають неабиякий інтерес
для створення антиідіотипічних вакцин, які належать до нових
вакцинуючих препаратів. У 1963 р. Г. Канкель зі співробітника
ми (США) і Ж. Уден (Франція), незалежно один від одного,
встановили, що одержані при імунізації тварин антитіла (Ат1)
після їх виділення із сироватки і введення іншим тваринам ін
дукують синтез нових антитіл — Ат2. Останні (Ат2) зв’язува
ли лише Ат1 і не вступали у взаємодію з іншими антитілами.
Це дало підставу Ж. Удену епітоп антитіла Ат1 назвати ідіо<
типом (грецьк. Idios — своєрідний і typos — відбиток, зразок,
форма), а антитіло Ат2, утворене в результаті індукованого
впливу антигенних детермінант ідіотипу (Ат1) — антиідіоти<
пом. В подальшому експериментально було встановлено схо
жість між Ат2 і антигеном. У зв’язку з цим виникла ідея про
можливість використання Ат2 як вакцинуючого препарату, що
має деякі переваги. Головна перевага полягає в тому, що, зали
шаючись препаратом високої специфічності, антиідіотипічні
вакцини ніколи не викликають захворювання, для захисту від
яких їх створено.
Цей метод є перспективним при роботі з небезпечними ві
русами, а також з вірусами, виробництво яких обмежене або
пов’язане зі значними труднощами. Метод має перспективу і то
ді, коли до складу антигенних детермінант входять вуглеводи
або ліпіди, які перешкоджають створенню вакцин за принципа
ми генетичної інженерії.
Використання відповідних антиідіотипів є високоефектив
ним для профілактики багатьох інфекційних захворювань і лі
кування деяких видів раку, а також хвороб, причинами яких є
дефекти імунної системи. Антиідіотип можна використати як
вакцину або терапевничний засіб для подолання синдрому на
бутого імунного дефіциту (СНІДу).
Контрольні питання
1. Як і які за складом антитіла одержують традиційним спосо
бом?
2. Які антитіла називаються моноклональними?
3. Що таке гібридома, технологія її одержання і властивості?
4. Які етапи включає технологія одержання моноклональних
антитіл?
5. Якими методами проводиться культивування виділеного
клону?
6. Які переваги мають моноклональні антитіла над звичайними
імунними сироватками?
7. Де застосовуються моноклональні антитіла?
8. Які вакцини називають антиідіотипічними?
9. Яка роль моноклональних антитіл у створенні антиідіотипіч
них вакцин?
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
346
Розділ 15.
БІОТЕХНОЛОГІЯ І ВАКЦИНИ
МАЙБУТНЬОГО
Відомо, що імуногенність або здатність індукувати в орга
нізмі біосинтез антитіл визначається присутністю на поверхні
білкової молекули так званих епітопів або антигенних детермі
нант. Вони утворені тільки 6–10ма амінокислотними залишка
ми (зазвичай гідрофільними амінокислотами), що мають най
більшу спорідненість з активним центром антитіла і оточені
5–10ма амінокислотними залишками (зазвичай це гідрофобні
амінокислоти). Епітопи у складі імуногенної білкової молеку
ли, що знаходиться на поверхні вірусної частинки чи бакте
ріальної клітини, або у вигляді синтезованого тим чи іншим
шляхом олігопептиду, пізнаються певними клонами специфіч
них лімфоцитів, які забезпечують надалі біосинтез антитіл про
ти даного набору антигенних детермінант (епітопу).
З цього погляду вакцина, що використовується в повсяк
денній практиці, — це малоконтрольована надкомплексна
суміш з великою кількістю баластних, у тому числі високото
ксичних забруднюючих компонентів з мікробних клітин, жи
вильного середовища, з клітин, у яких вирощуються віруси. В
ідеалі для створення імунітету необхідні одиндва епітопи, що
не містять забруднюючих баластних речовин, токсичних некон
трольованих домішок. А в організм при вакцинації вводяться
сотні найскладніших комплексів, унаслідок чого виникають
важкі поствакцинальні ускладнення, настає алергезація осіб,
яким зроблено щеплення (Петров Р.В., Хаітов Р.М., 1986).
З огляду на вищевикладене цілком реальною є ідея оптимі
зації вакцини в напрямку усунення тих негативних наслідків,
які супроводжують їхнє використання. Насамперед це високо
ефективні вакцини, за допомогою яких, незважаючи на власти
ві їм негативні моменти, вдалося перевести в розряд переможе
них низку інфекцій, що викликали колись спустошливі епідемії
й епізоотії, які заподіювали населенню численні лихоліття.
Необхідність нетрадиційних підходів виникла особливо
гостро при конструюванні нових вакцин, покликаних забезпе
чити ефективний захист від інфекцій, проти яких на сьогодні
такого захисту немає. До категорії так званих непереможених
інфекцій належать вірусні захворювання людини і тварин (ге
патит А, гепатит В, грип, ящур, африканська чума свиней й інші
заразні хвороби). У людини і тварин відсутній надійний захист
від інфекційних захворювань кишечника, а також від стафіло
коків, стрептококів, пневмококів і паразитарних інфекцій, у то
му числі малярії та інших.
Досягнення молекулярної біології і генетичної інженерії
повинні бути використані для одержання насамперед противі
русних вакцин.
В опублікованих протягом останнього часу роботах вітчиз
няні і закордонні дослідники у своїх спробах одержати антиві
русні вакцини виходили насамперед з необхідності виділення з
геному гена, що кодує у вірусній частинці поверхневий білок,
який має антигенні властивості. Потім за участю ізольованого
гена конструювали рекомбінантну молекулу ДНК, що після
трансформації експресувалась у бактеріальній чи дріжджовій
клітині. Передбачалося, що отриманий біотехнологічним шля
хом і відповідним чином очищений капсидний білок з його ан
тигенними властивостями може бути використаний як ефек
тивний вакцинальний препарат субодиничного типу. Ген, що
несе інформацію про білок поверхні вірусу грипу (поверхневий
гемаглютинін), гепатиту в людини, поліомієліту й інших захво
рювань, удалося змусити експресуватись у прокаріотичній
бактеріальній клітині чи в такому одноклітинному еукаріотич
ному організмі, як дріжджі. Залишалося очистити отрима
ний імуногенний білок і застосувати його як вакцинальний
препарат.
Труднощі, що виникають на цьому етапі, як вважає Тихо
ненко Т.І. (1984), навряд чи можна подолати. Річ у тім, що пара
зитування багатьох вірусів у клітинах вищих еукаріотичних ор
ганізмів передбачає використання ферментних систем останніх
для здійснення функції відтворення вірусів, у тому числі фор
мування капсидних вірусних білків. Однак ферментні системи,
що забезпечують утворення функціонально активних молекул
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
348
РНК (процесинг) за допомогою посттранскрипційної модифі
кації первинної РНК, що полягає в елімінації полінуклеоти
дних фрагментів, які відповідають інтронам, і наступному
лігіруванню фрагментів РНК, що несуть інформацію і відпові
дають екзонам (сплайсинг), а також посттрансляційні модифі
кації синтезованих білкових молекул у бактеріальних і дріж
джових клітинах істотно відрізняються від тих умов, у яких
відбувається відтворення вірусу при його паразитуванні в клі
тинах вищих еукаріот (людини і тварин насамперед). Так, у
бактеріальній і дріжджовій клітинах, де експресуються гени,
що кодують капсидні вірусні білки, відсутні необхідні умови
для процесингу, не відбувається посттрансляційне протеолі
тичне розщеплення і глікозування білка вірусної оболонки, що
перешкоджає формуванню такої третинної і четвертинної
структури, яка утвориться при інфікуванні вірусом клітин ви
щих еукаріот.
Відхилення в конформації білкових молекул призводять до
того, що амінокислотні залишки, з набору яких формується епі
топна ділянка, екрануються іншими атомними групами. У тих
випадках, коли антигенна детермінанта створюється відповід
ними конформаційними перебудовами за рахунок просторово
го зближення вилучених ділянок поліпептидного ланцюга при
формуванні третинної структури або мономерних поліпептидів
при утворенні надмолекулярної четвертинної структури, відпо
відні амінокислотні залишки взагалі не можуть бути зібрані у
відповідну епітопну групу.
Незалежно від причин, що обумовили конформаційні від
хилення, синтезований у бактеріальній чи дріжджовій клітині
білок позбавлений головної властивості — він неімуногенний.
Синтезований за допомогою технології рекомбінантних ДНК у
дріжджовій клітині НВSантиген вірусу гепатиту В мав 50 %
імуногенності порівнянно з аутентичними частками 22 нм.
Створенню біотехнологічного виробництва НВSантигену і
вакцини чи діагностичного препарату перешкоджають відсут
ність посттрансляційного глікозування при експресії гена, що
кодує антигенний білок вірусу гепатиту В в дріжджах, а також
необхідність руйнування дріжджових клітин для одержання ан
тигену, тому що той у середовище не виділяється.
Розділ15.Біотехнолоіяівацинимайбтньоо
349