Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

до складу комплексної молекули штучного антигену, знаходить

клітини зі специфічними рецепторами на їхній поверхні. Ділян

ки полііонної структури, що перебувають у складі комплексної

молекули і вільні від зв’язку з антигеном, вступають у взаємо

дію з поверхнею імунокомпетентної антигенспецифічної кліти

ни. Агрегація мембранних білків, що відбулася в результаті та

кої взаємодії, підвищує іонну проникливість останньої. Усього

цього достатньо для індукування процесу розподілу і диферен

ціації Влімфоцитів даної специфічності в антитілоутворюючі

клітини без участі Тхелперів.

Оскільки Ir і Isгени реалізують свою участь у контролі

імунної відповіді переважно через Тлімфоцити, використання

антигенів чи антигенних детермінант у комплексі з полііонними

носіями дозволяє забезпечити незалежність імунних реакцій

від впливу Тлімфоцитів та Irгенного контролю, у зв’язку з чим

особини, що генетично не реагують або реагують на визначений

антиген слабко, дають повноцінну як первинну, так і вторинну

імунну відповідь. На основі цього принципу можливе створен

ня ефективних вакцин проти інфекцій, що раніше належали

до категорії непереможених, а також, можливо, проти раку й

алегрій.

Ідея конструювання штучних вакцин нового типу реалізо

вана колективом під керівництвом Петрова Р.В. (1986), що

створили препарат, який захищає тварин від сальмонельозної

інфекції. У ході розробки штучної протисальмонельозної вак

цини було встановлено, що кон’югати поліцукристого компо

нента, виділеного з Оантигену, і білкового компонента флаге

ліну (Нантиген) з такими носіями, як поліакрилова кислота,

полі4вінілпіридин чи сополімер акрилової кислоти і Nвініл

піролідона, у вигляді двокомпонентних (Ополіцукор–полі

електроліт або флагелін–поліелектроліт) чи трикомпонентних

(Ополіцукор–флагелін–поліелектроліт) штучних антигенів

забезпечують захист мишей при зараженні їх надлетальними

дозами (100 LD

) збудника S. typhimurium такого інфекційно

го захворювання, як мишачий тиф. Одночасно була підтвер

джена раніше висловлена думка про те, що поліелектролітний

носій без відповідної антигенної детермінантної ділянки навіть

у великих дозах не може захистити при інфікуванні тварин.

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

360

Крім того, у низькореагуючих на Ополіцукристий антиген і

флагелін (Нантиген) генотипів при введенні кон’югатів наз

ваних антигенів з полііонними макромолекулами стимулюван

ня проліферації Влімфоцитів і утворення антитіл було ви

ражено сильніше, ніж в індивідуумів з більш високим вихід

ним рівнем імунної відповіді. Як стверджують Петров Р.В. і

Хаітов Р.М. (1981), за допомогою полііонних носіїв можливо

здійснювати фенотипічну корекцію генного контролю імунної

відповіді.

Відмінною рисою штучних комплексних антигенних препа

ратів є їх високий протективний ефект: введені одноразово, во

ни забезпечують необхідний рівень набутої стійкості до сальмо

нельозної інфекції. Проте, штучні вакцинуючі препарати при

повторному введенні О і Нантигенів сальмонел здатні розви

вати високу імунну відповідь. Це свідчить про те, що створені

штучні імуногени забезпечують прояв добре вираженої імуно

логічної пам’яті. Найбільш високий захисний ефект одержува

ли при імунізації мишей трикомпонентним штучним антигеном

Ополіцукор–флагелін–полііон.

З огляду на вищевикладені дані є підстава зарахувати наз

вані штучні антигенні комплекси до принципово нового типу

вакцинуючих препаратів з контрольованими структорую і іму

ногенністю (Петров Р.В., Хаітов Р.М., 1987).

Розроблена ідея виявилася плідною і при вирішенні питан

ня про можливість конструювання протигрипозної вакцини.

Епітопи з імуногенними властивостями входять до складу ос

новних антигенів вірусу – гемаглютиніну і нейрамінідази. Під

впливом антигенних детермінант, локалізованих у гемаглюти

ніні і нейрамінідазі, при проникненні вірусу в організм відбу

вається біосинтез специфічних віруснейтралізуючих антитіл.

На відміну від поверхневих антигенів (гемаглютиніну, нейрамі

нідази), первинна структура яких у процесі антигенного дрейфу

зазнає значних змін, що створюють часом нездоланні труднощі

при виготовленні ефективної протигрипозної вакцини, вну

трішні антигени, зосереджені в матриксному білку (Мбілку)

вірусної частки, характеризуються сталістю своєї первинної

структури, яка у всіх різновидів вірусу однакова, і в ході анти

генного дрейфу практично не зазнають змін.

Розділ15.Біотехнолоіяівацинимайбтньоо

361

Однак Мбілок є слабким антигеном, і антитіла, що утворю

ються під його впливом, не здатні захистити організм від вірусної

інфекції. Консервативність первинної структури, що передбачає

сталість його епітопних ділянок, у поєднанні з ідентичністю

структури в багатьох різновидів серотипів вірусу грипу була по

кладена в основу конструювання штучних антигенів, що забезпе

чують біосинтез протективних антитіл, ефективних проти дея

ких різновидів вірусу грипу.

Для виготовлення вакцин необхідні антигенні препарати.

Еліміновані з вірусних штамів гемаглютинін і нейрамінідаза,

введені в організм тварини порізно чи разом, сприяють збіль

шенню кількості антитілоутворюючих клітин, які синтезують

IgM, у 2–2,5 раза, чого недостатньо для забезпечення вірусней

тралізуючої функції і захисту тварин (мишей) від грипу (вижи

вало не більше 14 % мишей). При цьому слід зазначити, що в по

пуляції антитілоутворюючих клітин не було виявлено тих,

котрі синтезують IgG.

Зовсім іншими виявилися результати імунізації мишей

кон’югатами гемаглютинін–полііон, нейрамінідаза–полііон і ге

маглютинін–нейрамінідаза–полііон. Одноразове введення

штучних антигенів на поліелектролітній основі у визначеному

дозуванні забезпечувало абсолютну стійкість до вірусу.

Трикомпонентні штучні антигени (гемаглютинін–нейраміні

даза–поліелектроліт) виявилися ефективнішими за антигени, до

складу яких входили гемаглютинін і полііон. Штучні антигени,

сконструйовані на полііонній основі, підвищують також інтен

сивність гіперчутливості уповільненого типу, тобто Тклітинної

імунної відповіді. Сконструйований штучний антиген, що вклю

чає виділений з віріонів Мбілок і поліелектролітний носій, при

імунізації тварин забезпечує виражений віруснейтралізуючий

ефект, що дає підставу вважати реальною можливість створення

штучної поліспецифічної вакцини, яка складається з константно

го Мбілка і поліелектролітної частини компонента.

Принцип використання константної антигенної детермі

нанти був покладений в основу конструювання цілком штучної

протигрипозної вакцини. Для цього була синтезована констант

на антигенна детермінанта, ідентична за будовою до Nкінцево

гоу фрагменту, що включає 11 амінокислотних залишків, легко

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

362

го ланцюга (НА

–субодиниці) гемаглютиніну вірусу грипу А.

Потім до Скінця олігопептидного фрагмента був приєднаний

гліцин, внаслідок чого отриманий додекапептид (пептид акти

вації злиття F/A) такої амінокислотної послідовності:

Глі–Лей–Фен–Глі–Ала–Іле–Ала–Глі–Фен–Іле–Глу–Глі.

Кон’югати синтезованого додекапептиду з полііонними носіями

мали добре виражену імуногенну активність. Вони індукували

біосинтез протективних антитіл ізотипу IgG, що реагують як з

гомологічною антигенною детермінантою, так і з гемаглютині

нами різних серотипів вірусу грипу А. Значний вірусонейтралі

зуючий ефект із широким протективним спектром при однора

зовому введені дає підставу зарахувати сконструйований

препарат до цілком штучної протигрипозної вакцини. При цьо

му біосинтез антипептидних, антигемаглютинінових і проти

грипозних антитіл не був виявлений у жодному з досліджень, у

яких пептид F/A вводили в організм з різними носіями, що не є

речовинами полііонної природи.

Ідентифікація деяких ракових антигенів (αфетопротеїн, що

виявляється при захворюванні первинною карциномою печінки,

а також карциноембріональний антиген, поява якого позв’язана

з аденокарциномною патологією органів травлення) і одержан

ня їх у чистому вигляді (Петров Р.В. і ін., 1972–1987) дозволя

ють порушувати питання про створення протиракової вакцини.

Синтезований за кордоном ундекапептид, що відповідає за

амінокислотною послідовністю Nкінцю карциноембріонально

го антигену, при з’єднанні його з поліамінокислотним носієм і

бичачим сироватковим альбуміном в організмі тварин індуку

вав синтез антитіл, які взаємодіяли з нативним карциноембріо

нальним антигеном (R. Arnon et al., 1976). У лабораторії

Р.В. Петрова (1983) було отримано комплексне з’єднання, скла

довими якого є αфетопротеїн і полііонний носій, які належать

до класу полібетаїнів. Порівняння результатів, отриманих при

застосуванні одного αфетопротеїну і кон’югату αфетопро

теїн–полібетаїн, показало, що в другому випадку інтенсивність

утворення антитіл майже в 100 разів вища, ніж у першому. Цей

напрямок також є перспективним.

Використання поліелектролітних носіїв при створенні

штучних антигенів і штучних вакцинуючих препаратів дало

Розділ15.Біотехнолоіяівацинимайбтньоо

363

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

364

можливість забезпечити тимуснезалежність імунної відповіді і

пов’язаної з ним здатності скасовувати ефект конкуренції анти

генів, обхід Irгенного контролю сили імунного реагування,

одержати ефективну імунну відповідь в особин з генетично де

термінованим низьким рівнем імунної відповіді на той чи інший

антиген. Це створює широкі можливості для конструювання

вакцин проти інфекцій, що дотепер належали до категорії непе

реможених, дозволяє розраховувати на успіх при розробці по

ліспецифічних препаратів із включенням у кон’югат епітоп –

поліелектроліт консервативного пептиду і створенні ефектив

них вакцин для захисту людини і тварин від протозойної інвазії,

штучних протиракових і алерговакцин. Особливе значення епі

топполіелектролітні кон’югати мають в умовах Тклітинного

дефіциту. Незважаючи на унікальність властивостей поліелек

тролітів, що застосовуються, триває робота над зниженням

їхньої токсичності, підвищенням процесу біодеструкції і виве

денням з організму, а також підвищеннюям здатності полііоних

молекул виконувати функцію Тхелперів, спонукаючи Влім

фоцити до проліферації. Це досягається за допомогою приєд

нання до комплексу іонофорів мурамілдипептиду й інших ком

понентів. Специфічність взаємодії штучного імунізуючого

комплексу з Влімфоцитом може бути підвищена за рахунок

більш адекватного синтезу антигенних детермінант.

Генноінженерний підхід у поєднанні із застосуванням по

ліелектролітів спроможні вже сьогодні значно поліпшити

якість існуючих вакцин.

У світі проводяться широкі дослідження зі створення висо

коефективних вакцин для профілактики хвороб тварин за допо

могою методів генетичної інженерії. Інактивовані вакцини, що

застосовуються у ветеринарній практиці, мають порівняно

низьку імуногенність, тому вдаються до допомоги ад’ювантів.

Використання вакцин з атенуірованих штамів викликає усклад

нення. Загальним недоліком тих чи інших вакцинуючих препа

ратів є наявність великої кількості баластового матеріалу.

Методи генетичної інженерії найбільш прийнятні для виго

товлення вакцин проти вірусних захворювань. Сучасний підхід

базується на використанні в складі вакцини тільки тих антиген

них детермінант, що індукують антитілоутворення. Вигото

влення вакцини включає такі етапи: виділення збудника і його

розмноження; установлення структури вірусу; елімінація спе

цифічно активної структури, яка індукує антитілогенез; синтез

цього фрагмента в лабораторних умовах; визначення генетич

ного коду синтезованого поліпептиду; конструювання рекомбі

нантної ДНК і укладання рекомбінантної ДНК у бактерію.

Вмонтовуванням вірусних генів, що кодують відповідні ан

тигенні детермінанти в геном бактерії чи еукаріотичної клітини,

які знаходяться в культурі, передбачається одержувати вакци

ни належного складу. Необхідно довести нову технологію до то

го рівня, що дозволило б вакцинам нового покоління успішно

конкурувати з вакцинуючими препаратами, які створюються

традиційними методами.

Контрольні питання

1. Чим зумовлена імуногенність або здатність індукувати в ор

ганізмі біосинтез антитіл?

2. Що таке антигенна детермінанта (епітоп)?

3. Роль епітопа у забезпеченні імунної відповіді.

4. У чому полягає механізм генетичного контролю сили імунної

відповіді?

5. Чому виникла необхідність використання генноінженерних

підходів при отриманні вакцин?

6. Що покладено в основу при створенні генноінженерних

вакцин?

7. У чому сутність концепції створення штучних макромолеку

лярних вакцинуючих препаратів?

8. Які підходи використовуються при конструюванні штучних

антигенів нового типу?

9. Назвіть основні параметри штучних генноінженерних вакцин.

10.Які етапи включає процес виготовлення генноінженерних

вакцин?

11.Напрями створення штучних вакцин.

Розділ15.Біотехнолоіяівацинимайбтньоо

365

Розділ 16.

ДНК–ВАКЦИНИ

Явище трансдукції in vivo при введенні очищеної ДНК спо

стерігали ще кілька десятиліть тому, однак тривалий час цьому

не надавали належної уваги. В 1960 році Ito (1960) показав

можливість індукції папілом на шкірі кролика при ін’єкції ек

страгованих фенолом нуклеїнових кислот з вірусу папіломи

кроликів Шоупа, а в 1990 році в США з’явилося перше повідо

млення про можливість генної імунізації тварин очищеною «го

лою» (naked) ДНК або РНК, коли Джон Вольф зі співробітни

ками зафіксував експресію хлорамфеніколацетилтрансферази,

люциферази і βгалактозидази після інєкцій у скелетні м’язи

миші ДНК та РНКекспресуючих векторів, які несли відповід

ні гени (Wolff I. A. еt al., 1990).

Генна імунізація передбачає введення очищеної плазмідної

ДНК, що містить гени вірусних або бактеріальних патогенів, в

тканини організму з наступною експресією чужорідних генів,

презентацією антигенів клітинами організму для індукції імун

ної відповіді, яка б забезпечувала протективний ефект (Tang D.

еt al., 1992, Cohen I., 1993).

Основні характеристики ДНКвакцин порівняно з класич

ними вакцинами наведені в табл. 16.1.

16.1. СТРУКТУРА

Конструктивно під ДНКвакциною мають на увазі плазмід

ну ДНК (кільцеву ковалентнозамкнену молекулу довжиною

від 4 до 6 тис. пар нуклеотидів), в яку вбудовані гени, що коду

ють найбільш важливі для імуногенності білки вибраного пато

гену і які експресують ці білки під контролем еукаріотичного

промотору (ділянки ДНК, відповідальної за зв’язування РНК

полімерази, що ініціює транскрипцію). При конструюванні мо

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

368

На сьогодні розроблені і більш ефективні системи, які здат

ні реалізовувати експресію не тільки окремих генів антигенів, а

і їх сполучення (Feltquate D. M., 1998), або, включивши додатко

во до конструкції гени термінальних повторів аденоасоційова

ного вірусу, інтегрувати молекулу ДНКвакцини до хромосоми

клітини (Deryabina O. et al., 2003), рис. 16.1.

145

2301100

200

620 180 715

neo

PCMV

Плазміда

6,2&B

Amp

ORI

3,4В(асета)

E2CSFV

POenh

PTK pA2

Рис. 16.1. Схема рекомбінантної плазміди ВКЧС<pTR<UFneo<:

TR – кінцевий повтор аденоасоційованого вірусу (AAV), PcMv – промоторна

область цитомегаловірусу, SD/SA – донор/акцептор сплайсингу,

E2 CSFV – ген білка Е2 вірусу класичної чуми свиней, pA

– сигнал

поліаденілювання, pA

– сигнал поліаденілювання, neo – ген резистентності

до неоміцину (селективний маркер), Amp – ген резистентності до ампіциліну

(селективний маркер)

16.2. ВИБІР ГЕНІВ

Вибір генів для ДНКвакцинації може бути виконаний

шляхом конструювання генної бібліотеки (наприклад, за допо

могою полімеразної ланцюгової реакції з рандомними олігону

клеотидними праймерами), включаючи клонування рестрик

ційних фрагментів геному патогену в різних рамках зчитування

і послідовний відбір отриманих рекомбінантних плазмід, що за

безпечують протективний захист. Це дозволяє визначити окре

мий ген, білки яких забезпечують захист організму від інфекції.

У випадку, коли відомо, який білок є протективним, його ген от

римують за допомогою полімеразної ланцюгової реакції зі спе

цифічними до нього олігонуклеотидними праймерами.

Нарешті, для розширення антигенного спектру ДНКвак

цин створені вектори, до складу яких включені бібліотеки

кДНК окремих патогенів. Інокуляція пулом таких векторів з ек

спресією бібліотеки після імунізації забезпечили ефективний

захист мишей проти зараження патогеном навіть у тому випад

ку, коли не були відомі їх протективні антигени.

Гени для конструювання ДНКвакцин мають бути консер

вативними.

16.3. МЕТОДИ ТА ШЛЯХИ ВВЕДЕННЯ

Існує декілька методів доставки ДНК для трансфекції клі

тин. Найбільш вивченими є ін’єкції ДНК в сольовому розчині

та введення ДНК за допомогою генної рушниці («gene gun»),

коли клітини бомбардують часточками або мікроскопічним

дротом із золота ( ~ 0,95–3 мкм) з адсорбованими на поверхні

молекулами ДНК (Pokholenko Y. et al., 2003, Fynan E. F. et. al.,

1993). Інші методи, які використовуються, це інкапсуляція

ДНК в ліпосоми, комплекси ДНК з кохлеатом та використання

атенуйованої шігели (Shigella flexneri) як транспортного засобу

(Fennelly G. I. et. al., 1999). Досліджено також, що ефективне

перенесення в клітини скелетних м’язів трансгену можна вико

нати електропорацією з високою частотою і низькою силою

електричних імпульсів. Електропорація дозволяє більш ніж в

Розділ16.ДНК-вацини

369