Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

діють на клітинну мембрану дріжджів, помітно стимулюють

вміст ергостерину в біомасі.

При одержанні ергостерину у виробничих умовах можна

виділити такі етапи: розмноження вихідної культури і накопи

чення інокулята; ферментація; сепарування клітин; опромінен

ня клітин ультрафіолетовими променями; висушування і упа

кування цільового продукту.

Так, стосовно дріжджів інокулят одержують на середови

щах, які забезпечують повноцінний розвиток клітин. Після цьо

го основне середовище з ацетатом (активатором біосинтезу сте

ринів), яке містить знижену кількість азоту, але збагачене

джерелом вуглецю (високе значення С:N), засівають порівняно

великим об’ємом інокулята. Культивування дріжджів (фермен

тацію) проводять при температурі, наближеній до максималь

ної для конкретного штаму, і належній аерації (2 % О

в газовій

фазі). Через 3–4 доби, залежно від ростових характеристик і

біосинтетичної активності культури, клітини сепарують і підда

ють вакуумвисушуванню. Потім сухі дріжджі опромінюють

ультрафіолетовими променями – УФП (довжина хвилі

280–300 нм) протягом оптимального часу за необхідної темпе

ратури і з урахуванням домішок.

Опромінення дріжджів можна проводити до сепарації клі

тин у тонкому шарі 5 % суспензії, враховуючи невелику прони

кну здатність УФП.

Опромінені сухі дріжджі використовують у тваринництві.

У промисловості їх випускають під назвою «кормові гідролізні

дріжджі, збагачені вітаміном D

». У такому препараті міститься

не менше 46 % сирого білка, незамінні амінокислоти (лізин, ме

тіонін, триптофан) і 5000 МО вітаміну D

/г.

У випадку одержання кристалічного вітаміну D

клітини

продуцента гідролізують соляною кислотою при температурі

110

С. Потім температуру знижують до 75–78

С і додають ета

нол. Суміш фільтрують при 10–15

С і масу, яка залишилася пі

сля фільтрації, промивають водою, висушують, подрібнюють,

нагрівають до 78

С і двічі обробляють потрійним об’ємом ета

нолу. Спиртові екстракти об’єднують і упарюють до 70 %го

вмісту сухих речовин. Одержаний «ліпідний концентрат» обро

бляють розчином їдкого натрію. Ергостерин кристалізується з

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

380

неомиленої фракції концентрату при 0

С. Його можна очисти

ти повторними перекристалізаціями. Кристали висушують,

розчиняють у сірчаному ефірі, опромінюють УФП, ефір відга

няють, а розчин вітаміну D

концентрують і кристалізують.

«Кислотний фільтрат» зазвичай упарюють до 50 %го вмі

сту сухих речовин і використовують як концентрат Dвітамінів.

Виробляють також масляний концентрат вітаміну D

Рибофлавін або ВІТАМІН В

. Міститься в клітинах різ

них мікроорганізмів, будучи коферментом у складі флавопроте

їнів (перш за все відповідних ферментів класу оксидоредуктаз –

ФМН, ФАД). Продуцентами рибофлавіну (флавопротеїнів)

можуть бути бактерії, дріжджі і нитчасті гриби. Однак найбільш

перспективними є штами, які утворюють на рідких середови

щах 0,5 г і більше рибофлавіну в 1 л середовища. До таких орга

нізмів належать Ashbyii gossypii, Eremothecium ashbyii i Candida

guilliermondii. Враховуючи мінливість активних продуцентів

названих видів за здатністю синтезувати вітамін В

, необхідний

систематичний підтримувальний відбір культур у процесі їх ек

сплуатації на виробництві. Зазвичай активні продуценти пер

ших двох видів формують яскравооранжеві колонії на агаризо

ваних середовищах.

Методами генетичної інженерії вдалось одержати штам сін

ної палички, яка утворює приблизно 6 г рибофлавіну в 1 л куль

турального середовища, що містить патоку, білкововітамінний

концентрат і його гідролізат.

Високий вихід рибофлавіну у E. ashbyii корелює з азотом

пуринів та іншими азотистими джерелами, вміст яких у середо

вищі має бути достатнім. Як джерело вуглецю використовують

глюкозу або цукрозу, дріжджовий або кукурудзяний екстракт,

соєву муку, масла (жири).

Рідкі поживні середовища для одержання інокуляту і для

основної ферментації можуть дещо відрізнятися між собою. На

приклад, для одержання посівного матеріалу відоме середови

ще, яке містить цукрозу, пептон, кукурудзяний екстракт, калію

дигідрофосфат, магнію сульфат, рослинну олію. Час вирощу

вання продуцента на цьому середовищі — 2 доби при температу

рі 27–30

С (залежно від штаму). Ферментаційне середовище

Розділ17.Біотехнолоіяодержаннявітамінів

381

зазвичай включає кукурудзяну і соєву муку, цукрозу, кукуруд

зяний екстракт, калію дегідрофосфат, кальцію карбонат, натрію

хлорид і ненасичений жир.

Зазвичай тривалість ферментації становить 5 діб при

рН 5,5–7,7. Після використання цукрози (приблизно через 30

годин) починає помітно накопичуватися вітамін В

, спочатку —

в міцелії, а потім — у культуральній рідині.

Для використання в годівлі тварин всю біомасу висушують

і в одержаному сухому продукті вологістю 8 % міститься

1,5–2,5 % рибофлавіну, 20 % білка, тіамін, нікотинова кислота,

піридоксин, ціанкобаламін, мікроелементи та інші речовини.

У випадку високих вихідних показників за рибофлавіном

вітамін можна виділяти індивідуально і разом із синтетичним

рибофлавіном використовувати в медицині.

Для Сandidia guilliermondii дуже важливо регулювати вміст

заліза в поживному середовищі, оптимальна концентрація яко

го коливається в середньому від 0,005 до 0,05 мкг/мл. При цьо

му певні штами дріжджів можуть утворювати за 5–7 днів понад

0,5 г/л вітаміну. Однак для промислового виробництва рибо

флавіну перевагу надають більш продуктивним видам і штамам

грибів – E.ashbyii i Ashbyiі gossypii.

Аскорбінова кислота, або ВІТАМІН С. Це протицин

готний вітамін, який міститься у всіх вищих рослинах і твари

нах. Тільки людина і мікроби не синтезують її, але людям вона

вкрай необхідна, а мікроби не потребують цього вітаміну. Однак

певні види оцтовокислих бактерій синтезують напівпродукт ас

корбінової кислоти — Lсорбозу. Таким чином, весь процес

одержання аскорбінової кислоти є змішаним, тобто хімікофер

ментативним.

Біологічна стадія процесу каталізується мембранозв’яза

ною поліолдегідрогеназою, а остання (хімічна) включає послі

довно такі етапи: конденсація сорбози з діацетоном і одержання

діацетонLсорбози; окислення останньої до діацетон2кетоL

гулонової кислоти, яку в подальшому піддають гідролізу з одер

жанням 2кетоLгулонової кислоти; останню піддають еноліза

ції з наступною трансформацією в Lаскорбінову кислоту

(рис. 17.1).

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

382

Ферментацію G.oxydans проводять на середовищах, які мі

стять сорбіт (20 %), кукурудзяний або дріжджовий екстракт,

при інтенсивній аерації (8–10 г О

/л/год). Вихід Lсорбози мо

же сягнути 98 % за одну–дві доби. При досягненні культурою

logфази можна додатково вводити в середовище сорбіт, дово

дячи його концентрацію до 25 %. Також установлено, що

G.oxydans може окислювати і вищі концентрації поліспирту

(30–50 %), який утворюється на останніх стадіях процесу. Фер

ментацію бактерій проводять в періодичному або безперервно

му режимі. Доведена можливість одержання Lсорбози із сорбі

ту за допомогою іммобілізованих у поліакриламідному гелі

бактеріальних клітин.

Аскорбінову кислоту використовують як антиоксидант у

медицині, а також у харчовій промисловості.

Ціанкобаламін, або ВІТАМІН В

. Одержують тільки

мікробіологічним синтезом. Його продуцентами є прокаріоти і

перш за все пропіоновокислі бактерії, які в природних умовах

утворюють цей вітамін. Мутанти Propionibacterium shermanii

Розділ17.Біотехнолоіяодержаннявітамінів

383

Рис. 17.1. Схема хіміко<ферментативного методу одержання

аскорбінової кислоти

(за Єліновим Н.П., 1995)

M82 і Pseudomonas denitrificans M2436 продукують на рідко

му середовищі до 58–59 мг/л ціанкобаламіну.

Враховуючи важливу функцію вітаміну в організмі людини

(він є протианемічним фактором), його світове виробництво до

сягло 10 т на рік, з яких 6,5 т витрачають на медичні потреби, а

3,5 т — у тваринництві (Єлінов Н.П., 1995).

Вітчизняне виробництво ціанкобаламіну базується на вико

ристанні Р. freudenreichii Var. shermanii, яка культивується у пе

ріодичному режимі без доступу кисню. Ферментативне середо

вище зазвичай містить глюкозу, кукурудзяний екстракт, солі

амонію і кобальту. pН близько 7,0 підтримують додаванням

ОН. Тривалість ферментації 6 діб. Через 3 доби у середови

ще додають 5,6–диметилбензімідазол — попередник вітаміну

і продовжують ферментацію ще 3 доби.

Ціанкобаламін накопичується в клітинах бактерій, тому

операції з виділення вітаміну полягають у наступному: сепару

вання клітин, ектрагування водою при рН 4,5–5,0 і температурі

85–90

С за присутності стабілізатора (0,25 %й розчин натрію

нітриту). Екстракція відбувається протягом години, після чого

водний розчин охолоджують, нейтралізують розчином NaOH,

додають коагулянти білка (хлорид заліза тривалентного і алю

мінію сульфату) з подальшою фільтрацією. Фільтрат упарюють

і додатково очищують, використовуючи методи іонного обміну

і хроматографії, потім проводять кристалізацію вітаміну при

температурі 3–4

С з водноацетонового розчину.

Кристалічний ціанкобаламін можна одержати за допомо

гою резорцину або фенолу, що утворюють з ним аддукти, які по

рівняно легко розкладаються на складові компоненти.

При реалізації даного біотехнологічного процесу потрібно

зважати на високу чутливість до світла вітаміну В

. Через це усі

операції необхідно проводити в умовах затемнення (або при

червоному світлі).

На ацетонобутиловій або спиртових бардах з додаванням

солей кобальту і метанолу одержують кормовий препарат

КМБ

– концентрат, який містить вітамін В

та інші ростові

біологічно активні речовини. Біооб’єктом є змішана культура

метаногенних бактерій.

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

384

Контрольні питання

1. Якими методами одержують вітаміни?

2. У якому випадку мікробіологічний синтез вітамінів перева

жає над хімічним?

3. Які існують напрями вирішення проблеми одержання вітамі

нів мікробіологічним синтезом?

4. Які продуценти та поживні середовища використовуються

для одержання каротиноїдів?

5. Як отримують вітамін D?

6. Які етапи біотехнології отримання ергостерину у виробни

чих умовах?

7. Яким методом отримують рибофлавін (вітамін В

8. Які особливості методу отримання аскорбінової кислоти?

9. Яким синтезом отримують вітамін В

10.Які мікроорганізми є продуцентами вітаміну В

та склад по

живного середовища для їх культивування?

Розділ17.Біотехнолоіяодержаннявітамінів

385

Розділ 18.

БІОТЕХНОЛОГІЇ ОДЕРЖАННЯ

БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ ПРОДУКТІВ

НА ОСНОВІ МЕТАЛОКОМПЛЕКСНИХ

СПОЛУК

Розробка наукових основ створення і використання біоло

гічно активних металокомплексних сполук передбачає одер

жання фундаментальних знань щодо механізмів регулювання

біохімічних окисновідновних процесів із застосуванням ком

плексів перехідних металів з біолігандами. При конструюванні

біохелатів використовуються принципи одержання ефективно

діючих біонеорганічних комплексів, які функціонують у кліти

нах іn vivo. Є можливості моделювати властивості складних

біокомплексів, шляхом створення спрощених аналогів, які ха

рактеризують найбільш суттєві ознаки вихідних сполук. Для

цього необхідне проведення порівняння створюваного біоком

плексу і моделі з використанням структурного і (або) функціо

нального підходу при конструюванні, тобто модель за структу

рою має бути аналогічною біокомплексу, що моделюється, чи

його головного активного компонента; або модель, яка не має

структурної ідентичності з вихідним біокомплексом, здатна ви

конувати аналогічні біологічні функції.

При створенні аналогів можливе одержання структур, які за

своїми характеристиками перевищують вихідні біокомплекси,

оскільки останні синтезуються в клітинах при невисоких кон

центраціях реагуючих речовин, температурах, тиску, у вузькому

інтервалі рН. При конструюванні модельних систем є можли

вість для широкого варіювання цих параметрів.

Сконструйовані моделі біокомплексів спроможні виконува

ти різноманітні біологічні функції і мати значні переваги сто

совно структур, утворених in vivo. В процесі конструювання

біомоделей перш за все необхідно використовувати сучасні дані

про шляхи утворення і транспорту біосистем, які моделюються,

Розділ18.Біотехнолоіїодержаннябіолоічноативнихпродтівнаоснові...

387

проформи, у яких вони елімінуються з оточуючого середовища,

транспортуються крізь мембрани клітин і досягають кінцевого

пункту, де утворюють відповідні біокомплекси. Біокомплекси

металів – це їх координаційні сполуки, які виконують певні

функції в організмі.

Металопротеїни – комплекси металів з білками, які відігра

ють важливу роль у накопиченні, транспорті й активації моле

кулярного кисню з використанням його в різних окислюваль

них процесах. Під час метаболізму енергетичні потреби клітин

задовольняються за рахунок енергії, яка вивільнюється при

окисленні біосполук за участю кисню.

Одним з перспективних напрямів досліджень є моделюван

ня ферментних систем, які беруть участь в окисновідновних

процесах, для вивчення механізмів біоактивації молекулярного

кисню. Окисновідновні процеси в організмі каталізуються

ферментамиоксидоредуктазами.

Для вищих форм життя велике значення має молекулярний

кисень, реакція відновлення якого щодо води – основа біоенер

гетики клітин. Молекулярний кисень в основному стані є біра

дикалом, у якого два неспарених електрони з паралельними спі

нами знаходяться на різних розпушуючих π

і π

молекулярних

орбіталях. Саме тому молекулярний кисень є відносно інерт

ною молекулою, бо за законом зберігання спіну в результаті

взаємодії О

з речовинами, якими заповнені орбіталі, повинен

з’явитися бірадикал, але для такої реакції потрібна висока енер

гія активації (заборона за спіном). Таким чином, органічні мо

лекули існують у кисневому оточенні завдяки забороні за спі

ном. Спінову заборону для реакцій триплетного кисню

можливо подолати послідовним додаванням електронів:

+ е → О

•

; О

•

→ HO

•

; HO

•

+ H

+ е → H

Крім цього, О

активно взаємодіє з органічними радикала

ми, у яких є неспарені електрони. Ці реакції мають важливе зна

чення для клітин у ланцюгових радикальних процесах перекис

ного окислення ліпідів (ПОЛ). Кисень не вступає в прямі

неферментативні реакції з органічними речовинами, але в клі

тинах є сформовані високоспеціалізовані ферментні системи,

які беруть участь у відновленні кисню шляхом перенесення на

нього одного, двох або чотирьох електронів. Ферменти, які відно

влюють О

, є металопротеїдами, що мають активний центр з од

ним або декількома атомами перехідних металів (заліза, цинку,

міді, марганцю, кобальту, молібдену). Ферментний контроль ре

акцій окислення за участю кисню зумовлюється слабкими вну

трішніми магнітними збурюваннями та перемішуванням спіно

вих станів діючих речовин у процесі окислення під впливом

обмінних взаємодій з парамагнітними іонами металів. Метали

активного центру виконують роль донорів електронів для кисню.

Процеси енергетичного забезпечення життєдіяльності клі

тин еукаріот підтримуються завдяки окисновідновним реакціям

за участю багатьох ферментних систем під контролем спінових

ефектів. Проте навіть за умов високої специфічності процесів

окислювального фосфорилювання в мітохондріях, або мікросо

мального окислення за участю монооксигеназ у всіх таких реак

ціях, де беруть участь металопротеїди і кисень, відбувається утво

рення активних метаболітів кисню — супероксиданіонрадикалу,

гідроксилрадикалу, пероксиду водню, синглетного кисню та про

дуктів радикальних окислювальних реакцій: перекисних сполук,

дієнових кон’югатів, малонового диальдегіду та інших.

У клітинах для захисту від токсичних метаболітів кисню і

продуктів їх діяльності сформовані високоспеціалізовані систе

ми ферментних антиоксидантів. Розрізняють чотири лінії фер

ментного захисту клітин від активних метаболітів кисню: 1) су

пероксиддисмутаза (СОД); 2) глутатіонпероксидаза (ГПО) і

каталаза (КТ); 3) ГПО і глутатіонтрансфераза; 4) глутатіон

трансфераза, формальдегіддегідрогеназа, гліоксилаза, хінонре

дуктаза, епоксигідратаза.

Для окремих ферментів антиоксидантного захисту харак

терні специфічність дії клітинної і органної локалізації і вико

ристання як каталізаторів елементів Zn, Сu, Fe, Mn, Se. З метою

зменшення токсичного впливу активних метаболітів кисню в

експериментальній терапії використовують антиоксидантні

ферменти СОД і каталазу. При введенні препарату СОД спо

стерігається накопичення пероксиду водню, що призводить до

інактивації ферменту. При спільному введенні каталази, яка

ферментативно перетворює токсичний Н

на нешкідливі Н

і О

, СОД не втрачає активності навіть після дисмутації більше

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

388

радикалів О

–

на моль ферменту. Оскільки супероксидради

кал частково інгібує КТ, стає зрозумілим, що спільне викори

стання комплексу антиоксидантних ферментів значно збільшує

їх ефект і попереджує утворення найбільш токсичного гідрок

сильного радикалу.

Одним з перспективних напрямів є використання в клініч

ній практиці препаратів СОД і КТ, що є ефективним при різних

патологіях, пов’язаних з надлишковою індукцією високотоксич

них активних форм кисню. Для попередження швидкої інакти

вації ферменту при потраплянні в біорідини є спроби викори

стання іммобілізованих форм ферменту, що значно збільшує

тривалість дії біокаталізатора. Другим практичним напрямом є

моделювання низькомолекулярних комплексів антиоксидант

них металоферментів, які є високоефективними каталізаторами

і, на відміну від аналогів, можуть мати набагато вищу активність.

Комплекси металів з біолігандами – одна із форм найбільш

наближених до оригіналу моделей металоферментів. Крім того,

для низькомолекулярних моделей не існує проблеми щодо пе

реносників і транспорту. Одним з таких прикладів є моделю

вання каталазної активності хелатами міді (ІІ) з поліамінами.

Так, для прояву каталітичної активності комплексу в ньому ма

ють бути два вільних координаційних місця, натомість як мета

лохелати, у яких усі координаційні місця зайняті, не проявля

ють специфічної активності.

Розділ18.Біотехнолоіїодержаннябіолоічноативнихпродтівнаоснові...

389