Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
100 разів підвищити ефективність трансгенезу і отримати стій
ку секрецію білка при введенні лише 1 мкг чистої плазмідної
ДНК (Rizzuto G. et. al., 1999). Для підвищення поглинання та
розподілу ДНК між клітинами іноді вводять разом з ДНК слаб
кі анестетики або розчин сахарози.
Для доставки ДНК до легенів у вакцинації був використа
ний макроагрегований альбумін. Вакцина потрапляла в легені
після внутрішньовенного введення. Для приєднання ДНК до
альбуміну використано поліетиленімін, після нагрівання з яким
утворювалися часточки розміром 25–100 мкм. Після введення
вони розподілялися в альвеолярній інтерстиціальній тканині. В
результаті була отримана системна імунна відповідь та відпо
відь на рівні легеневої тканини. «Гола» ДНК за цих умов викли
кала тільки системну імунну відповідь.
При ін’єкції ДНК в сольовому розчині вона розчиняється до
бажаної концентрації. Після цього сольовий розчин ДНК вво
диться за допомогою шприца в різноманітні ін’єкційні місця –
внутрішньом’язово, внутрішньошкірно, внутрішньовенно або
інтрафолікулярно (щитовидна залоза). Крім того, епідермальна
доставка супроводжується скарифікацією.
Одна з гіпотез пояснює обмеженість ефективної трансфек
ції ДНК еукаріотичних клітин низькою концентрацією молекул
ДНК на поверхні клітин. При підвищенні їх концентрації на по
верхні за допомогою кварцевих наночастинок (225 нм) ефек
тивність трансфекції зростала в 8,5 разів (Luo Dan., Saltzman W.
M., 2000).
При внутрішньом’язовому введенні ДНКвакцини велике
значення має вибір певного м’яза. Існує припущення (Vokoyama
M. et. al., 1997), що значну роль відіграє розмір м’яза: при іноку
ляції певного об’єму ДНК в менший м’яз зростає гідростатич
ний тиск всередині м’яза, що сприяє ефективному розподілу і
поглинанню ДНК.
Перспективним напрямом оптимізації методу введення
ДНКвакцини є спроба створення такого молекулярного векто
ра, який доставляв би рекомбінантну плазміду з геном протек
тивного білка тільки до клітинмішеней, захищав її від впливу
нуклеаз крові, а також мав би стимулятор для проникнення
ДНКвакцини в клітинимішені (Лебедев Л. Р. та ін., 2001).
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
370
16.4. МОДУЛЯЦІЯ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ
В сироватках крові інтактних тварин присутні в невеликих
титрах аутоантитіла проти ДНК, але вони мало специфічні. Мо
лекули ДНК є слабкими імуногенами внаслідок своєї рухливої
конформації в розчині, тому введення в тканини організму ре
комбінантних плазмід не впливає на титри антитіл проти ДНК.
Для багатьох антигенів інокуляція 50–100 мкг очищеної
плазмідної ДНК з/або без бустерного введення призводить до
сильної імунної відповіді на відповідний білок, ген якого
входить до складу ДНКвакцини. В численних дослідах на ла
бораторних тваринах було встановлено, що кількість рекомбі
нантної плазміди, необхідної для ДНКвакцинації, може коли
ватись у межах 0,001–10 мкг на 1 г маси тіла тварини, що
значною мірою визначається вибраним методом та місцем вве
дення плазмідної ДНК. Так, у деяких випадках внутрішньош
кірне введення ДНКвакцини дозволяє отримати імунну відпо
відь, рівну або більшу, ніж при внутрішньом’язовому введенні,
при використанні плазмідної ДНК в концентраціях, в сотні ра
зів нижчих. Це може пояснюватися тим, що шкіра та мембрани
слизових оболонок є анатомічними сайтами, в які потрапляють
більшість екзогенних антигенів. Лімфоїдні тканини, поєднані зі
шкірою, утримують спеціалізовані клітини, які підвищують
імунну відповідь. Кератиноцити продукують інтерлейкін1
(ІЛ1) та αфактор некрозу пухлин, які можуть активувати лім
фоцити, макрофаги та дендритні клітини. Клітини Лангерганса
шкіри переносять антиген від шкіри до лімфатичних вузлів
(рис. 16.2). Вони є потенційними активаторами нативних
Тлімфоцитів. Спеціальний підклас Тлімфоцитів, які цирку
люють (епідермотропні лімфоцити) прямують у шкіру і відігра
ють критичну роль у шкірному імунітеті. Дендритні клітини і
макрофаги дерми можуть також захоплювати антиген і ініцію
вати імунну відповідь. Таким чином, трансфекція за допомогою
генної рушниці епідермальних або дермальних клітин in vivo за
допомогою ДНК може вважатись ефективним шляхом генної
імунізації, що нагадує фізіологічну відповідь на патоген при ін
фекційному процесі або при використанні живих вакцин. Вод
ночас існують дані (Deruabin O. et al., 2003), що без докладання
Розділ16.ДНК-вацини
371
механічних зусиль для введення ДНК безпосередньо в клітини
досить ефективною є внутрішньом’язова імунізація, при якій
спостерігається найвищий рівень експресії антигену. Особливі
стю такого введення є формування клітинного імунітету з утво
ренням переважно специфічних цитотоксичних лімфоцитів
(ЦТЛ), а механізм індукції гуморальної імунної відповіді не
визначений до кінця, тому що кількість антигенпрезентуючих
клітин у м’язах незначна.
Формування імунної відповіді при введенні ДНКвакцини
має певні особливості. На прикладі вірусу кліщового енцефалі
ту було показано, що попри на низький рівень експресії віру
сних генів при генній імунізації, який становив 10
12
г, відбува
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
372
Рис. 16.2. Схема модуляції імунної відповіді при
внутрішньошкірному введенні ДНК–вакцини
лась індукція імунної відповіді і ефективний захист тварин, то
ді як імунізація розчиненими інактивованими білковими вак
цинами з концентрацією вірусних білків приблизно 10
9
г не ви
кликала утворення кількості антитіл, які б навіть виявлялися в
імуноферментному аналізі (Морозова О.В. та ін., 2000). Таким
чином, введення ДНКвакцини призводить до індукції специ
фічної клітинної та гуморальної відповіді.
16.5. ПІДВИЩЕННЯ ІМУНОГЕННОСТІ ДНК<ВАКЦИН
Для підвищення імуногенності ДНКвакцин існують різні
підходи:
• для одночасної експресії двох генів використовують бі
цистронні вектори або мультигенекспресуючі плазміди;
• для експресії білка, який секретується, використовують
лідерні послідовності, до складу яких можуть входити ре
гуляторні елементи;
• використання тканинноспецифічних промоторів для
спрямування експресії генів у певних тканинах;
• використання цитокінів для посилення імунної відповіді
можливе або за рахунок використання злитих генів цито
кін/антиген, або включенням генів цитокінів до мультиге
некспресуючих векторів;
• введення імуностимулюючих послідовностей (ІСП) CpG.
За останні роки значно збільшилася кількість даних про
імуностимулюючий ефект бактеріальної ДНК та синтетичних
олігонуклеотидів, що містять імуностимулюючі послідовності.
У плазмідних ДНК бактерій досить часто зустрічаються CpG
динуклеотиди (з частотою 1 на 16 основ, в еукаріотичній
ДНК – 1 на 50 основ), CpG фланкуються двома 5
′пуринами
(переважно GpA) та двома 3′піримідінами (переважно GрС або
GрТ). В прокаріотичній ДНК цей мотив метильований лише на
5 %, в той час як частота метилювання цитозинів в CpG еукаріо
тів складає 70–90 %. Дослідження показали, що ДНК, яка міс
тить неметильовані CpG мотиви, безпосередньо активує макро
фаги, натуральні кілери (НК) та лімфоцити, які починають
Розділ16.ДНК-вацини
373
секретувати цитокіни, хемокіни та/або імуноглобуліни, а також
сприяють розвитку імунних відповідей по типу Th1 (опосеред
кованих γінтерфероном). Кінетичні дослідження показали
(Krieg M. A. et al., 1995), що активація Вклітин визначалася вже
через 4 години, досягала максимуму через 24 години та поверта
лася до вихідного значення через 48 годин. Аналіз клітинного
циклу показав, що CpG олігонуклеотиди активують понад 95 %
Вклітин до залучення до клітинного циклу. До того ж вони сти
мулюють активність натуральних кілерів та захищають лінії
Вклітин від інгібіції росту, який викликаний антиIgM.
ДНКвакцини повністю відповідають вимогам до засобів
специфічної імунопрофілактики і мають багато переваг над ін
шими типами вакцин. Для їх широкого використання в профі
лактиці інфекційних хвороб людей і тварин необхідно виріши
ти дві основні проблеми: визначити найбільш ефективні
способи та місця введення ДНКвакцин і розробити засоби за
хисту ДНК від деградації всередині клітини.
Контрольні питання
1. Що таке ДНКвакцина?
2. Як забезпечуються антигенні властивості ДНКвакцин?
3. Що передбачає генна імунізація?
4. Основні характеристики ДНКвакцин.
5. Відмінності ДНКвакцин від класичних?
6. Хімічна будова ДНКвакцин.
7. Механізм імунної відповіді при застосуванні ДНКвакцин.
8. Методи та шляхи введення ДНКвакцин в організм.
9. Як забезпечується модуляція імунної відповіді?
10.Які існують підходи щодо підвищення імуногенності ДНК
вакцин?
11.Перспективи масштабного виробництва ДНКвакцин.
12.Конкурентоспроможність ДНКвакцин.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
374
Розділ 17.
БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ
ВІТАМІНІВ
Забезпечення потреб людини і сільськогосподарських тва
рин достатньою кількістю вітамінів є важливою проблемою, яку
в сучасних умовах неможливо вирішити лише за рахунок вико
ристання традиційних природних вітамінних ресурсів. Крім
того, вітаміни, їх коферментні форми і похідні дедалі ширше за
стосовуються як препарати для лікування різних форм гіповіта
мінозів і авітамінозів, а також інших захворювань.
Термін «вітаміни» був запропонований Функом ще на по
чатку минулого сторіччя. Сьогодні до вітамінів належить велика
група низькомолекулярних органічних сполук різної хімічної
природи, які присутні в організмі у незначних концентраціях, і
як компоненти ферментних систем, що каталізують відповідні
реакції. Вищі тварини і людина в основному потребують одер
жання готових вітамінів, а серед мікроорганізмів широко роз
повсюджена здатність до їх синтезу.
До вітамінів включають за прийнятою літерною класифіка
цією: в групу В (В
1
– тіамін, В
2
– рибофлавін, В
3
– пантотенова
кислота, В
5
– нікотинова кислота, В
6
– піридоксин, В
с
чи В
9
–
фолієва кислота, В
12
– ціанкобаламін, Н – біотин); вітамін С (ас
корбінова кислота); групи А – ретиноли і провітамін А – βкаро
тин; D (кальцифероли і провітаміни – ергостерин, холестерин);
Е (токофероли); К (нафтохінони); їх коферментні форми та різ
ні інші похідні.
Вітаміни групи В ще називають кофакторними вітамінами,
тому що вони входять у структуру коферментів. Ці вітаміни бе
руть участь в метаболізмі як вищих організмів, так і мікробних
клітин. Механізм дії інших вітамінів вивчений недостатньо.
Деякі з них, наприклад С, А, D, не функціонують в мікробних
клітинах, хоча провітаміни останніх двох – βкаротин і ергосте
рин – беруть участь у життєдіяльності певних типів мікроорга
нізмів і ними синтезуються.
Вітаміни одержують як хімічним, так і мікробіологічним
синтезом.
Практичне використання здатності мікроорганізмів до біо
синтезу вітамінів розпочалося в 30–40і роки минулого століт
тяя. В першу чергу звернули увагу на пивні і пекарські дріжджі
як джерело вітамінів — В
1
, D
2
, С тощо.
Однак широкі перспективи щодо використання мікроорга
нізмів для одержання вітамінів з’явилися пізніше завдяки вия
вленню у них здатності до так званого надсинтезу вітамінів, тоб
то до утворення і накопичення в культурах деяких видів
набагато більшої їх кількості, ніж потрібно для виконання ката
літичних функцій. На це явище вперше звернув увагу в 30х ро
ках XX ст. Гільєрмон, який виявив накопичення рибофлавіну в
культурі гриба Eremothecium ashbyii. Його роботи показали, що
мікроорганізми можуть бути такою собі фабрикою вітамінів, і
викликали в усьому світі посилений інтерес до питань їх мікро
біологічного синтезу.
Незабаром надсинтетики рибофлавіну були знайдені і се
ред інших груп мікроорганізмів — дріжджів, бактерій, міцелі
альних грибів. Потім була виявлена здатність до підвищеного
синтезу інших вітамінів — В
12
(у актиноміцетів, пропіоновоки
слих, метанових і деяких інших груп бактерій), каротиноїдів (у
гетероталічних мукорових грибів), ергостерину (у деяких саха
роміцетів).
У Радянському Союзі були створені виробництва кормово
го препарату вітаміну В
2
з використанням активного продуцен
та гриба E. аshbyii, медичного і кормового препаратів вітаміну
В
12
за участю пропіоновокислих і метанових бактерій, βкароти
ну з грибом Blakeslea trispora і каротиногенними дріжджами, а
також одержання дріжджів з підвищеним вмістом ергостерину.
Прогрес у вивченні хімізму біосинтезу вітамінів дав можли
вість використовувати для їх одержання не тільки активні про
дуценти, але й мікроорганізми, здатні здійснювати окремі етапи
синтезу. Наприклад, при виробництві вітаміну С оцтовокислі
бактерії використовуються для трансформації сорбіту в сорбозу.
Завдяки встановленню механізмів вітаміногенезу одержані
мутанти продуцентів спроможні до надсинтезу вітамінів, що
сприяло створенню більш економічних способів виробництва
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
376
продуктів порівняно з існуючими. Є дані про одержання мутан
тів, які накопичують у середовищі вітаміни В
1
, В
6
, біотин (Ді
канська Е.М., 1984).
Крім вітамінів, мікробіологічним шляхом одержують інші
речовини вітамінної природи, передусім коферменти. Дедалі
ширше їх застосовують у медичній практиці, а мікробіологіч
ний синтез в багатьох випадках єдиний або найбільш прийнят
ний спосіб їх одержання.
Нові перспективи практичного використання мікроорганіз
мів як синтетиків вітамінів відкриває використання в мікробіоло
гічній промисловості нетрадиційних видів вуглецевих субстратів
(вуглеводні, нижчі спирти і кислоти) – нехарчових субстратів.
Встановлено, що вуглець належить до факторів, задіяних у
регуляції процесів вітаміногенезу, і використання вуглецевих
субстратів забезпечує підвищення рівня синтезу цілої низки спо
лук вітамінної природи (рибофлавіну, ергостерину, пантотенової
кислоти, ФАД, НАД, вітаміну В
6
, коензиму Q, вітаміну В
12
).
На сьогодні існують такі напрями вирішення проблеми одер
жання вітамінів мікробіологічним синтезом:
1. Одержання вітамінів і коферментів з використанням мікро
організмівпродуцентів, в основному надсинтетиків, і спе
ціальних режимів їх культивування. До цієї категорії нале
жать уже існуючі біотехнології одержання вітамінів В
2
, В
12
,
каротиноїдів.
2. Одержання індивідуальних вітамінів і коферментів з біомаси
мікроорганізмів, яку вирощують у промислових масштабах
на різних вуглецевих субстратах, або використання її як ком
плексних вітамінних препаратів. Сьогодні, коли в усьому сві
ті існує крупнотоннажне виробництво білка одноклітинних,
цей напрям набуває великого значення, тому що мікробна
білкова біомаса може слугувати комплексним джерелом ві
тамінів у тваринництві, а також використовуватися для виді
лення деяких синтезованих продуцентами білка сполук віта
мінної природи.
3. Використання мікроорганізмів для здійснення окремих ста
дій процесу синтезу вітамінів. Можливості використання для
вирощування таких мікроорганізмів нових видів нехарчової
сировини розширюють межіі цього напряму.
Розділ17.Біотехнолоіяодержаннявітамінів
377
Варто наголосити, що багато вітамінів успішно одержують
хімічним синтезом. Однак для деяких вітамінів і багатьох ко
ферментів мікробіологічний спосіб їх одержання поки що зали
шається єдиним або найбільш ефективним. В деяких випадках
мікробіологічний синтез може успішно конкурувати з хімічним,
особливо коли немає необхідності виділяти окремі вітаміни, на
приклад при використанні їх у тваринництві.
Каротиноїди – це ізопреноїдні сполуки, які синтезуються
багатьма пігментними мікроорганізмами із родів Aleuria,
Blakeslea, Corynebacterium, Flexibacter, Fusarium, Halobacte
rium, Phycomyces, Pseudomonas, Rhodotorula, Sarcina та ін.
Всього описано майже 500 каротиноїдів.
З однієї молекули βкаротину при гідролізі утворюються
дві молекули вітаміну А
1
. Це відбувається, наприклад, у кишеч
нику людини.
ВІТАМІН А
1
Каротиноїди локалізуються у вигляді складних ефірів і глі
козидів у клітинній мембрані мікроорганізмів або у вільному
стані – в ліпідних гранулах у цитоплазмі. Каротиноїд «рети
наль», наприклад, у галофільного виду Halobacterium halobium
сполучений з білком через залишок лізину. Він бере участь в
синтезі АТФ завдяки генерації трансмембранного потенціалу.
В цілому основна функція каротиноїдів – захисна. Їхньому біо
синтезу в клітинах сприяє світло.
Як продуценти каротиноїдів можна використовувати бакте
рії, дріжджі, міцеліальні гриби. Найчастіше використовують зи
гоміцети Blakeslea trispora i Choanephora conjucta. При спільно
му культивуванні вони можуть утворювати 3–4 г каротину на
1 л середовища.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
378
Поживні середовища для них досить складні і включають
джерела вуглецю, азоту, вітамінів, мікроелементів і спеціальних
стимуляторів. Останні доцільно вносити в культуральне сере
довище в кінці трофази.
Спочатку штами вирощують порізно, а потім – спільно при
температурі 26
о
С і посиленій аерації з подальшим перенесен
ням в основний ферментер. Умови культивування зберігають
ся. Тривалість ферментації – 6–7 днів. Каротиноїди вилучають
ацетоном (можна будьяким іншим полярним розчинником) і
переводять у неполярний розчинник. У випадках вилучення
білковокаротиноїдних комплексів використовують поверхне
воактивні речовини в концентрації 1–2 %. З метою очищення і
більш тонкого розділення гомологів використовуються методи
хроматографії або зміни розчинників. Вітамін А
1
порівняно лег
ко можна одержати з βкаротину при гідролізі.
У разі виготовлення каротиновмісної біомаси для згодову
вання тваринам і птиці можливе поєднання використання її з
вітаміном А чи без нього. Для застосування вітаміну А з ліку
вальною метою його виготовляють в капсулах для перорально
го вживання.
ВІТАМІН D — це група споріднених сполук, в основі
яких знаходиться ергостерин, що виявлений в клітинних мем
бранах еукаріот. Тому, наприклад, пекарські чи пивні дріжджі
використовують для одержання ергостерину як провітаміну з
антирахітичною дією. Вміст ергостерину в дріжджових кліти
нах коливається у межах 0,2–11 %.
За нестачі в організмі гормона 1,25 — дігідроксіхолекальци
феролу, попередником якого є вітамін D
3
, у дітей розвивається
рахіт (аналогом рахіту в дорослих є остеомаляція).
Трансформація ергостерину у вітамін D
2
(кальциферол)
відбувається під впливом ультрафіолетового опромінення. При
цьому розривається зв’язок в кільці (позиції 9, 10) і утворюєть
ся подвійний зв’язок у бічному ланцюзі (позиції 22, 23). Остан
ній гідрований у вітаміні D
3
(холекальциферол). Фізіологічна
активність обох вітамінів (D
2
і D
3
) однакова.
Крім дріжджів продуцентами ергостерину можуть бути мі
целіальні гриби — аспергіли і пеніцили, в яких міститься
1,2–2,2% ергостерину. Виявлено, що поліенові антибіотики, які
Розділ17.Біотехнолоіяодержаннявітамінів
379