Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
при цьому знижується на 20 %, тобто становить 80 % від розчин
ного. При використанні 1 кг іммобілізованої аміноацилази
одержують 400 кг Lтриптофану, вартість якого порівняно з
вартістю його виробництва за участю розчинного ферменту ста
новить 60 %.
Мікробний синтез Lтриптофану у промислових обся
гах здійснюється як за допомогою спороносних штамівмутан
тів бактерій Вас.subtilis, недостатніх по тирозину і фенілаланіну
(одноступінчастий спосіб), так і шляхом трансформації різних
попередників в Lтриптофан під дією ферментних систем дея
ких дріжджів (двоступінчастий спосіб).
Одноступінчастий спосіб включає наступні етапи: культи
вування вихідного штамупродуцента, виділення і очищення
одержаного триптофану та виробництво на його основі кормо
вих і високоочищених препаратів.
Продуктивність мутантапродуцента складає до 10 г трип
тофану в 1 л культуральної рідини.
Кормовий концентрат триптофану (ККТ) одержують без
відокремлення біомаси продуцента шляхом вакуумвипарюван
ня культуральної рідини до 30–40 % вмісту сухих речовин з по
дальшим висушуванням.
Висококонцентровані препарати триптофану одержують з
фільтрату культуральної рідини після відділення клітин проду
цента. Таким чином одержують технічний препарат триптофа
ну з вмістом амінокислоти до 45 % від вмісту в культуральній
рідині. Одержують також високоочищені препарати триптофа
ну з вмістом амінокислоти до 99 %.
Двоступінчастий шлях мікробного синтезу Lтриптофану
грунтується на проведенні трансформації антранілової кислоти
(попередника) під дією ферментних систем Candidia utilis в
Lтриптофан і одержанні культуральної рідини з вмістом його
до 6 г/л.
Крім цього, розроблена технологія виробництва культу
рального триптофану за допомогою технологій рекомбінантних
ДНК. Суть методу полягає в тому, що при конструюванні ре
комбінантної (гібридної) ДНК на базі плазміди E.coli, до складу
останньої вводиться не один ген, а триптофановий оперон. Йо
го клонування у складі рекомбінантної молекули ДНК, яка
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
410
складається із фрагменту ДНК з триптофановим опероном і
плазмідного вектора E.coli, супроводжується експресією. У
триптофановому опероні міститься п’ять генів, що кодують
п’ять ферментів, які беруть участь в утворенні з хоризмату (по
передника) через такі проміжні сполуки, як антранілат,
N5
′фосфорибозилантранілат, 1(0карбоксифеніламіно)1де
зоксирибулозо5фосфат, індол3гліцерофосфат, незамінної
амінокислоти Lтриптофану.
Розділ19.БіотехнолоіїодержанняL-аміноислот
411
Концентрація ферментів, які кодуються генами триптофа
нового оперона, що входить до плазмідного вектора Со1Е1,
орієнтовно в 20 разів перевищує їхній вміст у звичайних кліти
нах E.coli. Це пов’язано з тим, що кількість гібридних молекул
плазміди Со1Е1 у клітині E.coli може досягати кількох десятків
копій.
19.4. БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ LЛІЗИНУ
За вмістом лізину визначається біологічна цінність білка.
Він сприяє секреції харчотравних ферментів і транспорту каль
цію у клітини, покращує загальний азотний баланс в організмі.
Хімічний метод. Незамінну амінокислоту Lлізин можна
одержувати шляхом хімічного синтезу із циклогексанону з по
дальшим розділенням рацемічної суміші і виділенням Lформи.
Розділення рацемічної суміші із D і Lформ лізину грунтується
на різній розчинності солей, одержаних при взаємодії рацемату з
Lвинною кислотою. Сіль Dлізину і винної кислоти найменш
розчинна. Після розділення D і Lізомерів лізину солі руйну
ють, Lформу звільняють від Lвинної кислоти за допомогою
іонного обміну на колонках, а Dлізин через стадію утворення
аддукту з саліциловим альдегідом направляють на рацемізацію.
Комбінований або хімікоензиматичний метод
запропонований у 70і роки минулого століття японською фір
мою «Тойо Рейон» («Торей»). Технологія включає в себе орга
нічний синтез D, Lαаміно
εкапролактама із циклогексанона
і подальший його ферментативний гідроліз. Процес відбуваєть
ся за участю двох ферментів – Lгідролази і Dрацемази. Пер
ший селективно гідролізує D, Lαаміно
εкапролактам з утво
ренням Lлізину і Dα
−аміноεкапролактаму. Останній в
результаті впливу другого ферменту – рацемази (Dαаміно
ε
капролактамрацемази) піддається рацемізації і знову вводить
ся в реакцію:
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
412
Продуцентами гідролази Lαаміноεкапролактаму є шта
ми дріжджів роду Criptococcus, Candidia, Trichosporon, а актива
торами ферменту є двовалентні іони марганцю і цинку. Фермент
рацемазу Dαаміно
εкапролактаму можна одержати при куль
тивуванні бактерій родів Achromobacter, Flavobacterium та ін.
Обидва ферменти, які використовуються в технології, іммо
білізовані методом адсорбції на іонообмінному цукрі.
Мікробіологічний метод. В усьому світі при отриманні
кормового лізину перевагу надають мікробіологічному методу.
Перше підприємство з виробництва лізину за допомогою мікро
організмів було створене у Японії в середині 50х років мину
лого сторіччя. В подальшому аналогічне виробництво нала
годжено в Голландії і США. У Франції була створена велика
промислова фірма з виробництва цієї амінокислоти — «Євролі
зин».
Lлізин синтезується мікроорганізмами двома принципово
різними шляхами.
Мікроводорості, гриби, дріжджі синтез лізину здійснюють
із αкетоглутарової кислоти через αаміноадипінову кислоту –
аміноадіпінатний (АА) шлях. Регуляція активності ферментів
цього шляху досліджена недостатньо, тому мутантів, здатних до
надсинтезу лізину, серед цих мікроорганізмів не одержано.
Розділ19.БіотехнолоіїодержанняL-аміноислот
413
Для бактеріальних культур, вищих рослин, деяких водоро
стей характерний інший шлях біосинтезу лізину – через αдіа
мінопімелінову кислоту — діамінопімеліновий (ДАП) шлях,
який починається з аспарагінової кислоти. Крім лізину, із ас
партату утворюються також інші незамінні амінокислоти – ме
тіонін, треонін і ізолейцин (рис. 19.1). Продуценти лізину – глу
таматпродукуючі коринебактерії Corynebacterium glutamicum,
Brevibacterium flavum, мають мутантні форми, які здійснюють
надсинтез Lлізину.
Ще в 50і роки минулого сторіччя японські вчені в резуль
таті впливу мутагеном (ультрафіолетовим промінням) на сус
пензію бактеріальних клітин Microcoсcus glutamicus одержали
надпродуценти лізину. В колишньому Радянському Союзі над
продуценти лізину були одержані в 1964 р.
У промисловому виробництві лізину методом мікробного
синтезу, де як продуцент використовується Сorynebacterium
glutamicum, відбувається інгібування продуктами реакції —
лізином і треоніном, які, накопичуючись одночасно, за принци
пом зворотного зв’язку пригнічують активність аспартаткінази,
що каталізує перетворення аспарагінової кислоти в семіальдегід
аспарагінової кислоти, а отже, інгібує подальші етапи біосинте
зу лізину. Для зняття обумовленої регуляторними механізмами
заборони на надсинтез лізину був одержаний ауксотрофний
штам (мутант), у якого відсутній фермент гомосериндегідроге
наза, що каталізує утворення із семиальдегіда аспарагінової
кислоти гомосеріну, який інгібував біосинтез треоніну. Для рос
ту мутанта (ауксотрофного штаму) необхідно екзогенне надхо
дження у поживне середовище треоніну. Повільне введення в
середовище екзогенного треоніну попереджувало включення
механізму інгібування аспартаткінази продуктами реакції і біо
синтез лізину у цього мутанта відбувався з максимальною
швидкістю. Щоб примусити продуцент виробляти лізин і метіо
нін одночасно, ушкоджують механізм, який здійснює інгібуван
ня аспартаткінази продуктами реакції. Мутація гена, який
кодує синтез аспартаткінази, приводить до його функціонуван
ня навіть при надлишковій кількості лізину у середовищі. У
цьому випадку відбувається максимальне накопичення треоні
ну і лізину.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
414
Виробництво лізину включає чотири головних етапи:
підготовка поживних субстратів і їх стерилізація;
вирощування посівного матеріалу;
головна ферментація;
зневоднення продуктів ферментації шляхом вакуумно
го випарювання з подальшим висушуванням упареного
розчину у розпорошувальній сушарці або видалення
кристалічного лізину.
Основною сировиною для виробництва кормового лізину є
патока і кукурудзяний екстракт. Культивування продуцентів і
біосинтез лізину проводиться у промислових біореакторах
(ферментерах) об’ємом 50, 63 і 100 м
3
. Після закінчення фер
ментації готова культуральна рідина містить, крім лізину й
Розділ19.БіотехнолоіїодержанняL-аміноислот
415
Гомосериндеідроеназа
Гомосерин
Аспартатіназа
Аспараіноваислота
Ізолейцин
Треонін
МетіонінЛізин
Семіальдеід
аспараіновоїислоти
Діідропіолінова
ислота
Рис. 19.1. Схема біосинтезу лізину
(за Івлей Д., 1984)
інших продуктів метаболізму, біомасу продуцента і залишки по
живного середовища. Вміст сухої речовини у ній становить
10–13 %, в т. ч. лізину 2–3 % і 0,8–1,8 % бактеріальної біомаси.
Залежно від конкретної мети виробництва на основі куль
туральної рідини можна одержати такі препаративні форми лі
зину: рідкий концентрат лізину (РКЛ), сухий кормовий кон
центрат лізину (ККЛ), а також висококонцентровані кормові і
високоочищені кристалічні препарати для харчової і медичної
промисловості.
Рідкий концентрат лізину отримують шляхом стабілізації
культуральної рідини без відокремлення біомаси продуцента з
подальшим вакуумвипарюванням до 35–40 % сухих речовин.
Вміст лізину в ньому складає 7–12 %.
Сухий кормовий концентрат лізину одержують шляхом
зневоднення рідкого концентрату. Він містить лізину від 10 до
20 %, залежно від використання наповнювачів.
Кристалічні препарати лізину одержують з культуральної
рідини після відокремлення бактеріальної біомаси з вмістом
97–98 % Lлізину.
Такі товарні форми, як РКЛ і ККЛ містять, окрім лізину, і
інші біологічно активні речовини – вітаміни В
1
, В
2
, В
3
, В
4
, РР то
що, які підвищують цінність кормових добавок.
19.5. БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ LТРЕОНІНУ
Однією з найбільш важливих незамінних амінокислот є
треонін, який був відкритий і виділений в 1935 р. при вивченні
гідролізатів фіброїну:
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
416
Треонін синтезується у клітинах мікроорганізмів і рослин.
При цьому він утворюється з аспарагінової кислоти. В організ
мі людини і тварини біосинтезу треоніну не відбувається. Через
те, що продукти рослинництва, які складають основу раціону
сільськогосподарських тварин, містять мало треоніну, його
необхідно додавати в корм. При дефіциті амінокислоти у тва
рин спостерігається ожиріння печінки, зниження приростів жи
вої маси і погіршується засвоєння інших амінокислот.
Треонін широко використовується також у багатьох біотех
нологічних процесах. В медичній промисловості ця амінокисло
та необхідна для одержання деяких напівсинтетичних антибіо
тиків. Треонін додається у поживні середовища, призначені для
культивування клітин.
Одержувати треонін можна різними шляхами: гідролізом
природних білків, методом хімічного синтезу з ацетальдегіда і
гліцину, а також мікробіологічним шляхом. Перші два методи
не можуть задовольнити потребу народного господарства у цій
амінокислоті.
Для мікробіологічного виробництва треоніну як продуцен
ти використовують корінебактерії і ентеробактерії. Однак корі
небактерії, які інтенсивно продукують глютамінову кислоту і
лізин, синтезують треонін з невисокою швидкістю, що робило
його промислове виробництво нерентабельним.
Кишкова паличка здійснює біосинтез треоніну із аспарагі
нової кислоти через низку перетворень (рис. 19.2). Крім треоні
ну, з аспарагінової кислоти утворюються лізин, метіонін та ізо
лейцин, які за нормальних умов витрачаються на синтез білків і
їх концентрація в клітині незначна.
Промисловий надпродуцент треоніну одержаний на основі
мутантів, виділених з вихідної культури E. coli К–12, шляхом
використання методів генетичної інженерії, зокрема явища
ампліфікації генів. Коли будьякий ген повторюється в геномі
декілька разів, то кількість продукту, синтез якого він забезпе
чує, збільшиться пропорційно кількості його копій. Для культу
ри E.coli встановлено, що гени, які кодують синтез ферментів,
відповідальних за синтез треоніну, складають треоніновий опе
рон, який містить три гени. Отже, шляхом збільшення у клітині
кишкової палички треонінових оперонів можна забезпечити
пропорційний ріст синтезу амінокислоти.
Розділ19.БіотехнолоіїодержанняL-аміноислот
417
Використання цього методу дало можливість одержати
штам кишкової палички, який синтезував треонін на порядок
інтенсивніше порівняно з корінебактеріями – основними про
дуцентами амінокислот. Випробування одержаного треоніну в
тваринництві підтвердили його високу якість. При використан
ні біотехнологічного треоніну як компонента поживних середо
вищ з’ясувалось, що він забезпечує більш інтенсивний ріст клі
тин порівняно з треоніном, одержаним хімічним синтезом.
19.6. БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ
LАСПАРАГІНОВОЇ КИСЛОТИ
Аспарагінова кислота не належить до числа незамінних, але
виробляється у світі у великих кількостях. Вона використову
ється у харчовій промисловості разом з амінокислотою гліци
ном і надає кондитерським виробам і напоям різні відтінки ки
слого і солодкого смаку.
Аспарагінову кислоту одержують за допомогою внутрішньо
клітинного ферменту мікробного походження аспартази, який
синтезується E. coli. Вихідними речовинами для ферментатив
ного синтезу використовуються фумарова кислота і аміак –
крупнотоннажні продукти органічного і неорганічного синтезу.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
418
Рис. 19.2. Схема біосинтезу треоніну
(за Артамоновим В.І., 1989)
Аспарагінова
кислота
аспартил
фосфат
аспартатна
півальдегід
гомосерин
... треонін
дігідродіпі
колінат
осукциніл
гомосерин
αоксо
бутірат
лізин метіонін ізолейцин
...
...
...
Цей процес одностадійний. В присутності ферменту моле
кула аміаку приєднується до фумарової кислоти з утворенням
оптично активної Lаспарагінової кислоти.
У цьому процесі вперше в технологічній практиці були ви
користані іммобілізовані клітини в природній мікробній обо
лонці. Цей процес розроблено японською фірмою «Танабе Сей
яку» в 1973 р.
Спочатку японські технологи спробували використовувати
як каталізатор мікробну масу, що складалась із живих клітин
мікроорганізмів, які містять аспартазу. Однак період напівінак
тивації ферменту в цих умовах складав всього 10 днів і був не
придатним для технології. Після виділення аспартази з клітин
та іммобілізації в гелі час напівінактивації збільшився до 30
днів. Але як внутрішньоклітинний фермент аспартаза і в іммо
білізованому стані є малостабільною. Позитивних результатів
досягли після того, як іммобілізували цілі клітини E.coli в полі
акріламідному гелі. Період їх напівінактивації при температурі
37
о
С за звичайних умов становить 120 діб.
Стабільність аспартази в складі E.coli, іммобілізованих у
каррагінановому гелі, збільшується до 600 діб. Для іммобіліза
ції клітин E.coli 40 л фізіологічного саліну змішують з 10 кг во
логої клітинної маси, додаючи при цьому 7,5 кг акриламіду,
0,4 кг метиленбісакриламіду, 5 л 5 %ного диметиламінопропіо
нітрилу і 5 л 2,5 %ного персульфату калію. Через 10–15 хв при
температурі 40
о
С з гелю формують 2–3міліметрові кубики, на
повнюють ними колонку і пропускають через неї розчин фума
рату амонію.
Вихід Lаспарагінової кислоти становить 95 % теоретично
го. Процес безперервний і повністю автоматизований. Вартість
Lаспарагінової кислоти, видобутої із застосуванням іммобілі
зованих клітин, на 40 % нижча, ніж при традиційному методі.
Розділ19.БіотехнолоіїодержанняL-аміноислот
419