Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
Найбільший обсяг робіт було здійснено на бактерії E. coli.
Для того щоб забезпечити синтез чужорідного білка (у кон
кретному випадку інтерферону) в бактерії, необхідно: 1) ввести
ген цього білка у векторну бактеріальну ДНК, наприклад, плаз
міду; 2) приєднати до цього гена бактеріальні регуляторні еле
менти, які програмують його транскрипцію і трансляцію у бак
терії.
Введення гена інтерферону в плазміду, вилучену з E. coli,
відбувається аналогічно до гена інсуліну, соматотропіну тощо.
Проводиться обробка рестрикційною ендонуклеазою (рестри
ктазою) кінців кДНК, а також плазміди, яка в результаті набу
ває лінійної форми з липкими кінцями. Це дозволяє приєднати
кДНК до плазміди і за допомогою ДНКлігази утворити кільце
видну рекомбінантну плазміду з синтезованою кДНК, в якій є
ген, що кодує біосинтез інтерферону. Потім рекомбінантну
плазміду вводять у бактеріальну клітину.
Експресія будьякого еукаріотичного гена з метою одержан
ня білка вимагає використання структурної частини гена в по
єднанні з відповідними нуклеотидними послідовностями, які
розпізнаються ферментами клітинигосподаря як ефективні
сигнали ініціації транскрипції і трансляції (рис. 13.2). Для
експресії генів інтерферонів у клітинах E. coli широко застосо
вують регуляторні елементи триптофанового (trp) і лактозного
(lac) оперонів.
Складним є також процес виділення інтерферону, який на
копичується у бактеріальній клітині. Кишкова паличка «не вміє»
секретувати білки, і необхідний білок потрібно виділяти та очи
щати від усієї маси білка бактерії. Для цього використовуються
моноклональні антитіла до інтерферону, тобто імуноглобулін,
який зв’язувався тільки з αінтерфероном. Ці антитіла пришива
ли до поліцукристих кульок, через які пропускали суміш білків.
У результаті інтерферон захоплювався антитілами і утримував
ся на кульках. Потім його змивали і отримували готовий препа
рат, який у 5000 разів краще очищений, ніж вихідний. Таким
складним і багатоетапним шляхом у колишньому Радянському
Союзі був одержаний продуктивний штам – продуцент E. coli:
1 л суспензії цих бактерій давав понад 10 мг αінтерферону, тоб
то в 5000 разів більше, ніж одержували з 1 л крові донорів.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
330
Бактерії, які містять таку плазміду, синтезують інтерферон
і стійкі до дії антибіотиків
Аналогічним шляхом нині продукуються й інші класи ін
терферонів – β і γ, а також гібридний інтерферон, який складе
ний з половинок молекул різних інтерферонів.
Однак інтерферон, синтезований у бактеріях, не містить
необхідних за нормою вуглеводних груп, приєднаних до білка,
тобто неглікозільований. Це наслідок того, що в клітинах прока
ріот немає відповідних ферментів глікозілювання.
У 1981 р. у США був синтезований лейкоцитарний інтер
ферон з використанням генетично сконструйованої клітини
дріжджів. Згодом таким методом були одержані β і
γінтерфе
рони. Гени цих інтерферонів у складі рекомбінантної ДНК,
введені в дріжджову клітину (найчастіше Sacharomyces cerevi
siae), дають змогу у 10 разів інтенсифікувати біосинтез інтерфе
рону порівняно з бактерією. До того ж інтерферон у дріжджовій
Розділ13.Біотехнолоіявиробництваінтерферонів
331
Рис. 13.2. Схема рекомбінантної плазміди, яка обумовлює синтез
інтерферону людини в Е. соlі
(за Дебабовим В.Г., Лівшіцом В.А., 1988)
клітині зазнає глікозілювання. Крім дріжджових клітин, для от
римання глікозільованих інтерферонів використовуються клі
тини вищих еукаріот.
Сьогодні α, β і γінтерферони з успіхом отримують шляхом
використання генноінженерних штамів E.coli, дріжджів, куль
тивованих клітин комах (Drosophila) і ссавців. Щодо отриман
ня
γ і βінтерферонів, то краще використовувати еукаріотичні
продуценти, тому що прокаріоти не глікозілюють білки. Деякі
фірми, наприклад Bioferon, використовують не генноінженерні
мутанти, а культивовані in vitro фібропласти людини.
13.4. ОДЕРЖАННЯ ВДОСКОНАЛЕНИХ ІНТЕРФЕРОНІВ
Незважаючи на спільні ознаки, кожен інтерферон має свої
особливості. Наприклад, інтерферони αтипу певною мірою
відрізняються за дією на клітини різного походження.
Досягнення у сфері технологій рекомбінантних ДНК і мо
лекулярної біології відкривають можливості до покращення те
рапевтичних властивостей інтерферонів шляхом направлених
змін їх генів. Якщо кожен з відповідних генів розрізати в певній
ділянці однією і тією самою рестрикційною ендонуклеазою, ви
ділити N i Cкінцеві фрагменти генів, а потім до Nкінцевого
фрагмента одного гена приєднати Скінцевий фрагмент іншого
і навпаки, то одержимо гібридні гени. Після їх введення в бакте
рії, дріжджі або іншу клітинугосподар, вони програмуватимуть
синтез гібридних інтерферонів.
Такі гібридні інтерферони були отримані для інтерферонів
αА і αD швейцарськими і американськими дослідниками, а в
колишньому Радянському Союзі (Свердлов Е.Д., 1984) – інтер
ферони αА, αD і αF. З’ясувалося, що властивості гібридів і
вихідних індивідуальних інтерферонів дуже відрізняються.
Отже, з’являється нагода створення абсолютно нових ме
дичних препаратів. Крім одержання гібридних генів інтерферо
нів, методами генетичної інженерії можна змінювати будьяку
ділянку гена так, як це необхідно. Крім того, методами хіміко
ферментативного синтезу можна здійснити синтез повністю но
вих генів інтерферонів.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
332
13.5. ВИКОРИСТАННЯ ЕКЗОГЕННОГО ІНТЕРФЕРОНУ
У ВЕТЕРИНАРНІЙ МЕДИЦИНІ І ТВАРИННИЦТВІ
У США в 1982 р. запатентовано спосіб регулювання апети
ту і споживання кормів тваринами за допомогою інтерферону.
З цією метою використовували інтерферон, добутий з крові
або носового секрету великої рогатої худоби. Для стимулюван
ня процесу утворення інтерферонів корів вакцинували віру
сом ринотрахеїту. Інтерферон крові великої рогатої худоби
при введенні в організм свиней також позитивно впливає на
апетит.
Велике практичне значення має встановлений у 1982 р.
Н.К. Гумеровим, Н.Я. Зуєвою і Г.Г. Нурієвим факт передачі
інтерферону від порісних свиноматок плоду через плаценту і
позитивний вплив на стан неспецифічної резистентності ново
народжених. Причому антитіла таким шляхом в організм плода
не можуть надходити. Вони вводяться в організм новонародже
ного тільки з молозивом.
Виявлено можливість захисту інтерфероном телят від аде
новірусної і риновірусної інфекцій. Є дані про те, що інтерфе
рон, синтез якого індукований вірусом інфекційного ринотра
хеїту, певний час захищає телят від аерогенного зараження
аденовірусною інфекцією. Стійкість проти зараження ринові
русом виробилась у телят, в носовому секреті яких містилися
антитіла й інтерферон, що нейтралізують вірус. Встановлено
гальмуючий вплив інтерферону на реплікацію вірусу. Незва
жаючи на видоспецифічність інтерферону, є приклади запобі
гання інфекційному ринотрахеїту при щоденному інтраназаль
ному чи внутрішньом’язовому введенні 2–3місячним телятам
протягом 7 днів αінтерферону людини у дозі 5 • 10
7
Од. В ін
терферонізованих телят підвищення титру антитіл до вірусу
інфекційного ринотрахеїту і початок виділення вірусу відбува
ються в більш віддалені від початку зараження строки порівня
но з тваринами контрольної групи. Встановлено можливість
утворення інтерферону в клітинній культурі і в організмі лабо
раторних і сільськогосподарських тварин під впливом різних
індукторів.
Розділ13.Біотехнолоіявиробництваінтерферонів
333
Доведено можливість застосування інтерферону людини,
продукованого за допомогою технології рекомбінантної ДНК,
проти рота і коронавірусів великої рогатої худоби. Тваринам
при виявленні перших ознак захворювання щоденно під час на
пування протягом 3–4 днів давали по одній желатиновій капсу
лі, що містить 10
7
–2 • 10
7
Од. рекомбінантного інтерферону.
При ротавірусній інфекції 88,9 % хворих телят одужували. У
решти телят (11,1 %) стан здоров’я поліпшувався. Випадків за
гибелі молодняка не встановлено.
Ефективними індукторами у телят є комплекси полічетвер
тинного амонію з природною двонитковою РНК. Доцільність
активної інтерферонізації тварин для стимулювання захисних
сил організму є прийнятним ветеринарним заходом, широке ви
робниче застосування якого гальмується нестачею інтерферо
нів і задовільних модуляторів.
Про ефективну лікувальну дію людського рекомбінантного
αінтерферону свідчать також результати дослідів у культурі
клітин, попередньо заражених рота і коронавірусною інфекці
єю. Доведено, що добутий біотехнологічним шляхом інтерфе
рон у культурі клітин свиней інгібує реплікацію вірусу трансмі
сивного гастроентериту свиней і вірусу везикулярного
стоматиту. Факт високої антивірусної активності рекомбінант
ного інтерферону в культурі клітин можна вважати доведеним.
Для прояву високої антивірусної активності у тонкому відділі
кишечника інтерферон, мабуть, потребує захисту від деградую
чого впливу травних ферментів.
В Україні на Ладижинському державному підприємстві
«Ензим» були освоєні технології виробництва і налагоджений
промисловий випуск генноінженерних інтерферонів для
людей і тварин. Біаферон має антивірусні, антипроліферативні
та імуномодулюючі властивості й використовується для ліку
вання людей. Ринал – для лікування і профілактики вірусних і
віруснобактеріальних інфекцій великої рогатої худоби (пара
грип, паратиф, кишкові інфекції, в основі яких лежать вірусні
антигени), пушних звірів (Алеутська хвороба), птиці (хвороба
Ньюкасла, Гамборо).
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
334
Контрольні питання
1. Що таке інтерферони?
2. Де застосовуються інтерферони?
3. Які є класи і типи інтерферонів?
4. Які традиційні шляхи отримання інтерферонів: лейкоцитар
ного, фібробластного та імунного? Недолік цих методів.
5. У чому суть генноінженерного методу одержання інтерфе
ронів?
6. Які переваги генноінженерного методу одержання інтерфе
ронів над традиційними?
7. Які шляхи одержання генів інтерферонів?
8. Як проводиться експресія генів інтерферонів у клітинах?
9. З якою метою використовується екзогенний інтерферон у
ветеринарній медицині і тваринництві?
Розділ13.Біотехнолоіявиробництваінтерферонів
335
Розділ 14.
БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ
МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ
(АНТИТІЛ ОДНОГО ЕПІТОПУ)
14.1. ТРАДИЦІЙНИЙ СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ АНТИТІЛ
Традиційно для одержання антитіл використовуються тва
рини (кролики, кози, барани), яким вводиться антиген. На по
яву в крові чужорідного антигену імунна система тварин реагує
активацією розмноження Влімфоцитів, в яких розпочинається
біосинтез антитіл.
Але антиген — це не вся молекула біополімера, а антигенни
ми є лише його окремі «активні» ділянки, так звані антигенні
детермінанти або епітопи, яких на поверхні антигену може бути
дуже багато. Кожен із епітопів у складі молекули того чи іншо
го антигену індукує синтез Вклітинами імунної системи специ
фічних антитіл проти себе, тобто при імунізації тварини виро
бляються різні за специфічністю антитіла. За сучасними
даними різноманітність антитіл сягає 10
7
. Це означає, що орга
нізм тварини здатний синтезувати і секретувати у кровоток не
менше 10 млн молекул антитіл, які специфічно взаємодіють з
різними антигенними детермінантами.
Синтезовані антитіла за допомогою своїх функціонально
активних груп (рецепторів) розпізнають розміщені на поверхні
молекули антигену епітопні ділянки і взаємодіють з ними. Про
цес взаємодії приводить до прикріплення антитіла до відповід
ного епітопу антигену за допомогою рецепторів і утворення
нейтралізуючого біологічну активність чужорідної речовини
комплексу антиген<антитіло.
Синтез і секреція антитіл здійснюється спеціалізованим ти
пом лімфоїдних клітин – Влімфоцитами. У кожному Влімфо
циті синтезуються антитіла тільки одного типу, які здатні взає
модіяти лише з одним епітопом. У результаті утворюється
Розділ14.Біотехнолоіяодержаннямонолональнихантитіл
337
стільки різних видів антитілоутворюючих Вклітин, скільки в
антигена детермінант.
В організмі вищих хребетних міститься майже 10 млн різ
них ліній Влімфоцитів, які сприймають сигнали від епітопів
антигену і тільки з одного Влімфоцитапопередника утворю
ється клон плазматичних клітин, які виробляють моноклональ
ні антитіла. Але при утворенні антитіл навіть на один епітоп ви
никає стимуляція і розмноження різних клонів Влімфоцитів,
які синтезують різні антитіла. Таким чином, одержують гетеро
генні антитіла в імунній сироватці (антисироватці), тобто суміш
антитіл до різних епітопів. Такі антитіла називають поліспеци
фічними, а частіше – поліклональними.
14.2. МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА І ГІБРИДОМНА
ТЕХНОЛОГІЯ
Традиційним способом практично неможливо одержа
ти моноспецифічні або моноклональні антитіла. Для цього
необхідно розділити суміш антитіл або Влімфоцити на окремі
види.
Для одержання моноклональних антитіл проти певного епі
топу антигену після імунізації тварини необхідно відповідну ан
титілоутворюючу плазматичну клітину ізолювати, а потім роз
множити її за межами організму в клітинній культурі. Але
перешкодою є нездатність плазматичних клітин, які виробля
ють антитіла, до розмноження і тривалого життя поза організ
мом, в умовах клітинної культури через генетично обумовлену
обмеженість кількості поділів (50–100 поділів і клітина гине).
Подолати цю перешкоду вдалося шляхом створення гібридної
клітини (гібридоми), яка утворює певні антитіла.
Вчені звернули увагу на те, що клітини злоякісних пухлин
кісткового мозку (мієлом) продукують величезну кількість ано
мальних імуноглобулінів (антитіл). Ці клітини мають здатність
до необмеженого росту (тобто утворюють клони) і продуковані
ними імуноглобуліни ідентичні за структурою. По суті це моно
клональні антитіла, однак антиген, проти якого вони виробля
ються, невідомий.
Одержання гібридом. Спосіб одержання гібридом роз
роблено вченими Г. Келером і Ц. Мільстейном у Великій Бри
танії в 1975 р. Перш ніж опублікувати результати досліджень,
вони звернулися до британського уряду з пропозицією запатен
тувати гібридомні технології, але отримали відмову. Після цьо
го результати були опубліковані у журналі Nature, а Велика
Британія втратила право на відкриття, яке було визнане одним
із найважливіших у період з 1970 по 1980 роки.
Вченим удалося одержати в умовах пробірки гібридому
шляхом злиття клітин мієломи і антитілоутворюючих клітин
(лімфоцитів) селезінки миші, імунізованої еритроцитами барана.
Точність щодо кількості клітин мієломи не дуже важлива і їх
співвідношення з клітинами селезінки може коливатися від 1:10
до 1:1. Гібридизація клітин здійснюється за допомогою поліети
ленгліколю, який розчиняє оболонки клітин. Утворена гібрид
на клітина успадкувала від батьківських клітин їх корисні вла
стивості. Як і вихідні лімфоцити, вона синтезує антитіла, а
подібно до пухлинних клітин має здатність до практично нес
кінченного розмноження у клітинній культурі.
Заслуга Келера і Мільстейна полягає в тому, що вони при
мусили індивідуальну Вклітину (Влімфоцит) виробляти анти
тіла поза організмом, в умовах культури клітин. Такі антитіла
одержали назву моноклональних через те, що вони синтезують
ся нащадками однієї Вклітини, яка стала «безсмертною» завдя
ки гібридизації з пухлинною мієломною клітиною.
Донедавна для гібридизації використовували мієломні клі
тини і Влімфоцити мишей і щурів. Продуковані ними моно
клональні антитіла мають обмежене терапевтичне застосуван
ня, тому що вони є чужорідним білком для людського
організму. На сьогодні одержані гібридоми на основі імунних
клітин людини і відповідні моноклональні антитіла. Але гібри
доми людини ростуть повільно, досить нестабільні і в деяких
випадках теж викликають імунні реакції. Проте людські моно
клональні антитіла мають здатність розпізнавати тонкі відмін
ності в структурі антигену, які не розпізнаються моноклональ
ними антитілами миші або щура.
Для збереження одержаних гібридних клітин широко засто
совується метод глибинного заморожування, завдяки чому став
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
338
можливий обмін гібридомами, отриманих у різних лабораторіях
світу, а також створення банків гібридом для наукової мети.
Гібридомна технологія відкрила нову еру в імунології, а ро
бота Келера і Мільстейна була удостоєна Нобелівської премії.
Нині на будьякий агент можна одержати гібридоми у необхід
ній кількості. Гібридомна технологія перетворилася в одну із
найбільш розвиненихх галузей біотехнології.
Одержання моноклональних антитіл. Монокло
нальні антитіла – це однорідні за хімічним складом, структурою
і специфічністю антитіла, синтез яких здійснюється в клоно
ваних гібридних клітинах (гібридомах).
Технологія одержання моноклональних антитіл включає
такі етапи: І – імунізація тварин; ІІ – гібридизація, підготовка
клітин до злиття (фузії) та злиття; ІІІ – селекція – відбір гібри
дом, які утворюють антитіла потрібної специфічності; ІV – кло
нування гібридомних клітин; V – культивування – одержання
культуральної рідини або асциту, які містять антитіла, і виді
лення антитіл (рис. 14.1). Вся процедура від початку імунізації
тварин до виділення антитіл триває в середньому 3–4 місяці.
Біотехнологія виробництва моноклональних антитіл гаран
тує елімінацію пухлинних клітин, що не злилися, а також гібри
дів, утворених злиттям мієломних клітин і Влімфоцитів.
На першому етапі здійснюється імунізація тварин антиге
ном певного епітопу. Потім із суспензії клітин селезінки твари
ни виділяється відповідна антитілоутворююча клітина (АУК)
та проводиться підготовка мієломних клітин.
Для гібридизації використовуються в основному мієломні
клітини миші і щура, а останнім часом з’явилися повідомолення
про використання мієломних клітин людини. Мієломні клітини
мають бути генетично марковані так, щоб вони гинули на пев
ному селективному середовищі.
При одержанні перших гібридом Г. Келер і Ц. Мільстейн
партнерами для злиття вибрали клітини селезінки мишей, іму
нізованих еритроцитами барана, і клітини мієломної лінії РЗ,
які адаптовані до росту в культурі. Клітини цієї лінії, на відміну
від нормальних лімфоцитів, не могли засвоювати гіпоксантин із
поживного середовища через відсутність ферменту пуринового
Розділ14.Біотехнолоіяодержаннямонолональнихантитіл
339