Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
ультрафіолетове опромінювання, азотистий іприт у сполученні
зі спонтанними мутаціями й відбором найкращих продуцетнів.
Завдяки цьому концентрація пеніциліну в культуральній ріди
ні була доведена до 2 %, тобто збільшена в 10 тис. разів (20 г/л
культуральної рідини).
Метод підвищення продуктивності штамівпродуцентів ан
тибіотиків, який грунтується на безладних мутаціях, незважаю
чи на великі затрати праці й часу, використовується й нині. Це є
наслідком того, що біосинтез антибіотика відбувається в резуль
таті сумісної дії 10–30 різних ферментів, кодованих відповідною
кількістю генів. Полігенний механізм, покладений в основу біо
синтезу антибіотика, є причиною того, що зміни окремих генів
не дають бажаних результатів. Крім того, для багатьох антибіо
тиків, мікробіологічне виробництво яких налагоджено, молеку
лярні механізми їх біосинтезу дотепер не з’ясовані.
Для масштабного виробництва пеніциліну G використову
ють високопродуктивний промисловий штам Penicillium chry
sogenum, який був одержаний у результаті послідовних циклів
мутагенезу і селекції. Вирощують його глибинним методом у
ферментерах за допомогою фенілоцтової кислоти, яка є попе
редником бензильного бокового ланцюга молекули антибіоти
ка. Інтенсивний синтез пеніциліну розпочинається за наявно
сті великої кількості біомаси міцелію при повному
використанні глюкози і молочної кислоти в середовищі, при
рН, наближеному до нейтрального. Мікробіологічна стадія при
виробництві пеніциліну триває близько 200 год. Після закін
чення ферментації культуральну рідину фільтрують, а клітини
плісені промивають. З фільтрату і промивок за допомогою
бутанолу й іонів калію у спеціальних установках – кристаліза
торах одержують кристалічну калієву сіль пеніциліну G (чи
стота – 99,5 %), яка є вихідним матеріалом для наступних хі
мічних модифікацій.
До цього часу пеніцилінові антибіотики становлять най
важливішу групу хіміотерапевтичних засобів. Ядром пені
цилінів є 6амінопеніциланова кислота, або 6АПК, яку вико
ристовують для отримання напівсинтетичних пеніцилінів
(рис. 11.1).
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
300
Рис.11.1. Будова молекули пеніциліну
Отримання антибіотиків цефалоспоринового ряду.
Цефалоспорини – друга велика група екстрацелюлярних
βлактамних антибіотиків, у яких шестичленне дигідротіазино
ве кільце з’єднане з βлактамним кільцем. Завдяки цьому ядром
цефалоспоринів є 7αаміноцефалоспоринова кислота або
7АЦК (цефемове ядро), вперше виділене у процесі очищення
цефалоспорину С.
При виробництві цефалоспорину С поєднують мікробіологічний
метод з подальшою хімічною модифікацією. Як продуцент анти
біотика використовується Cephalosporium acremonium. У цього
антибіотика поєднується антибактеріальна активність як проти
грампозитивних, так і грамнегативних мікроорганізмів. Проте
для досягнення лікувального ефекту потрібні високі концентра
ції цефалоспорину С. Він є матеріалом для подальших хімічних
модифікацій.
Розділ11.Біотехнолоіявиробництваантибіотиів
301
Рис. 11.2. 7<аміноцефалоспоринова кислота (7АЦК)
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
302
11.2. МОДИФІКАЦІЯ
ββ
<ЛАКТАМНИХ АНТИБІОТИКІВ
За декілька десятиліть використання антибіотиків з ліку
вальною метою нагромадилась велика кількість патогенних мі
кроорганізмів, які набули спадкової стійкості до препаратів, що
раніше викликали їх загибель. Вихід зі складного становища
був знайдений завдяки хімічній і ферментативній трансформа
ції природних антибіотиків.
В результаті одержали так звані напівсинтетичні антибіоти
ки, в структуру яких внесені деякі зміни, які не займають основ
ного угруповання атомів, відповідальних за антибіотичний
ефект. Таким чином модифікували природні пеніциліни і цефа
лоспорини за допомогою іммобілізованого ферменту пеніцилі
намідази.
Одержання нових, більш ефективних аналогів пеніциліну
пов’язане зі зміною його бічного ланцюга при збереженні цілі
сності решти частини, так званого «ядра» антибіотика – 6амі
нопеніциланової кислоти.
Це відкрило доступ до широкомасштабного виробництва
напівсинтетичних пеніцилінів, стійких в кислому середовищі,
які володіють високою активністю по відношенню до великої
кількості мікробів, низькою токсичністю, а також стійкістю до
ферменту βлактамази, яка гідролізує лактамне кільце, що приз
водить до повної втрати антибіотичної активності. Остання вла
стивість дуже важлива, тому що багато мікроорганізмів, які мі
стять βлактамазу, стійкі до дії бензилпеніциліну і деяких
інших пеніцилінів.
11.2.1. Одержання 6<амінопеніциланової кислоти
(6<АПК).
Це ключовий продукт синтезу нових пеніцилінів. Похідни
ми 6АПК є напівсинтетичні пеніциліни. Одержують їх шляхом
гідролізу бензилпеніциліну (пеніциліну G). Оброблений фер
ментом пеніцилінамідазою, продуцентом якого є спеціальний
бактеріальний штам E. coli, пеніцилін G в результаті вибірково
го видалення з молекули бензильної групи при 37
о
С у водному
середовищі перетворюється на 6амінопеніциланову кислоту.
Другим компонентом, який утворюється в процесі гідролізу, є
фенілоцтова кислота:
пеніцилінамідаза
Бензилпеніцилін + Н
2
О 6АПК + фенілоцтова кислота.
На ранніх етапах (1976 р.) 6АПК одержували шляхом об
робки бензилпеніциліну бактеріальною масою E.coli, тобто ін
тактними клітинами, які містять фермент пеніцилінамідазу, що
без побічних реакцій розщеплював саме той амідний зв’язок,
необхідний для утворення 6АПК.
В результаті використання іммобілізованих бактеріальних
клітин (E.coli), які містять пеніцилінамідазу, а потім і самої
іммобілізованої пеніцилінамідази, значно підвищилася продук
тивність і економічність промислового процесу одержання
6АПК. У 1975 р. процес одержання 6АПК з використанням ім
мобілізованої пеніцилінамідази впроваджено у тодішньому Ра
дянському Союзі, і це було першим процесом інженерної ензи
мології.
В кожній країні іммобілізацію проводять різними шляхами.
Італійська компанія використовує іммобілізовану пеніциліна
мідазу шляхом включення ферменту в порожнисті нитки
триацетату целюлози, що забезпечує загальний вихід 6–АПК на
рівні 85 % з чистотою 96 %. За технологією японської компанії
«Танабе Сейяку» використовуються іммобілізовані в поліакри
ламідному гелі цілі бактеріальні клітини (з часом напівінакти
вації 42 доби при 30
о
С або 17 діб при 40
о
С). Загальний вихід
6АПК – приблизно 80 %.
У колишньому СРСР весь об’єм 6АПК вироблявся за до
помогою пеніцилінамідази, іммобілізованої включенням у полі
акриламідний гель, модифікований глутаровим альдегідом.
Отримана 6АПК має слабку антибактеріальну активність і
не використовується самостійно як лікувальний засіб. Однак
ядро 6АПК є зручною основою для модифікацій, в результаті
яких при приєднанні бічних груп антибактеріальна активність
препарату значно підвищується. Наприклад, при заміні бічних
груп дістають метицилін, стійкий проти інактиваційної дії бак
теріальних ферментів, а також ампіцилін, який діє на грампози
тивні бактерії.
Розділ11.Біотехнолоіявиробництваантибіотиів
303
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
306
З пеніциліну G можна одержати 6АПК і хімічним шляхом,
вдаючись до багатостадійних хімічних перетворень при досить
жорстких умовах (низька температура, наявність певних роз
чинників і видалення із середовища, де відбувається реакція, на
віть слідів вологи). Через складність хімічного методу перевагу
надають ферментативному, який, крім того, має менше етапів.
11.2.2. Одержання 7<
αα−−
аміноцефалоспоринової кисло<
ти – 7<АЦК.
Пеніцилінамідазі властива унікальна субстратна специфіч
ність, яка дозволяє здійснювати гідроліз не тільки пеніциліну,
але й цефалоспорину, причому відщеплюється тільки бічна гру
па (R
1
або R
2
), βлактамний цикл лишається незмінним (рис.
11.2).
Із виробленого мікробіологічним шляхом цефалоспорину С
під дією пеніцилінамідази проводиться елімінація бічного амід
ного ланцюга і отримується 7АЦК, яка є ключовою сполукою
для синтезу нових цефалоспоринів. Приєднуючи до неї різні
бічні ланцюги, отримують активні антибактеріальні напівсинте
тичні препарати цефалоспоринового ряду. Відомо майже 20 це
фалоспоринів, створених методом напівсинтезу з АЦК: цефа
лоспоридін (цепорин), цефуроксим, цефокситин, цефалотин,
цефацетрил, цефалексин, цефазолін, цефаридин, цефотаксим
тощо.
11.3. СТВОРЕННЯ НОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ
ВИРОБНИЦТВА І ЗАСТОСУВАННЯ АНТИБІОТИКІВ
Нова біотехнологія ґрунтується на досягненнях молекуляр
ної біології, молекулярної генетики і генетичної інженерії. Сьо
годні розробляються перспективні напрями, що грунтуються на
знаннях шляхів біосинтезу антибіотиків або їхніх окремих клю
чових структур. Для створення нової біотехнології масштабно
го виробництва антибіотиків передбачається використання різ
них прийомів або напрямів.
1. Генноінженерний напрям передбачає конструювання проду
центів з використанням плазмід E.coli як вектора для ство
рення рекомбінантних ДНК. Вони містять гени, які контро
люють біосинтез ферментів, які каталізують лімітуючі етапи
біосинтезу антибіотика.
2. Виділення лімітуючих реакцій і за допомогою генетичної ін
женерії конструювання генів «вузьких місць» та одержання
відповідного штамупродуцента, який виробляє достатню
кількість первинного метаболіту, що раніше лімітував швид
кість біосинтезу антибіотика. Реалізація цього прийому дала
змогу підвищити продуктивність продуцента цефалоспорину.
3. Введення в геном мікроорганізму інформації про фермент,
який необхідний для модифікації продукованого антибіоти
ка, наприклад, його метилювання за допомогою метилаз.
4. Використання сильних індукторів біосинтезу нуклеїнових
кислот і білківферментів для збільшення концентрації пер
винних метаболітів, з яких за наявності відповідних фермен
тів утворюються антибіотики.
5. Збільшення продуктивності продуцентів шляхом викори
стання специфічних ферментів, які визначають перехід мік
робної культури із стадії трофофази до ідіофази, а також
пригнічують процеси ретроінгібування.
6. Мутаційний біосинтез (мутасинтез). За допомогою мутацій
мікроорганізмів одержують штамимутанти, у яких блокова
но утворення окремих фрагментів молекули антибіотика.
При мутасинтезі відповідні мутантні штами використовують
для завершення синтезу антибіотичної молекули. В резуль
таті отримують модифіковані або так звані гібридні антибіо
тики.
7. Нова технологія, за якої використовуються штамисуперпро
дуценти антибіотиків, у яких передбачено вдосконалення за
хисту продуцента від синтезованого ним антибіотика.
8. Використання при виробництві антибіотиків іммобілізова
них ферментів, що каталізують як реакції гідролізу, так і син
тезу на деяких стадіях виробництва нових пеніцилінів і цефа
лоспоринів. Перспективним є використання іммобілізованих
на полімерному носії цілих клітинпродуцентів, що дає змогу
здійснити повний синтез антибіотичних препаратів.
Розділ11.Біотехнолоіявиробництваантибіотиів
307
9. Багатообіцяючим підходом є інкапсулювання антибіотиків і,
зокрема, їх включення в ліпосоми, що дає можливість забез
печити цільову доставку препарату в органимішені (хворі
органи) і знижує їх побічну дію.
10.Замість антибіотика в організм може вводитися його проду
цент, який є антагоністом збудника захворювання. Цей під
хід бере початок з робіт І.І. Мечникова про пригнічення
гнильної мікрофлори в товстому кишечнику людини за до
помогою молочнокислих бактерій.
Так, виникненню карієсу зубів сприяє дикий патогенний
штам бактерії Streptococus mutans, який знаходиться в ротовій
порожнині. Він виділяє кислоти, які руйнують зубну емаль і
дентин. Одержаний мутантний штам цього виду бактерії, який
при введенні в ротову порожнину не утворює корозивних ки
слот, витісняє дикий патогенний штам і виділяє летальний для
нього білковий продукт (Єгоров Н.С. і ін., 1987).
Контрольні питання
1. Що таке антибіотики, коли і ким вони були відкриті?
2. Які антибіотики й антибіотичні речовини сьогодні відомі і
скільки їх виробляється для реалізації?
3. Які мікроорганізми є продуцентами антибіотиків?
4. Які антибіотики належать до βлактамних?
5. Біотехнологія одержання пеніцилінів.
6. Який промисловий штам використовується для крупнотон
нажного виробництва пеніциліну G і його продуктивність?
7. Біотехнологія отримання антибіотиків цефалоспоринового
ряду?
8. Який продуцент використовують для виробництва цефалос
поринових антибіотиків?
9. З якою метою проводиться модифікація βлактамних анти
біотиків?
10. Яким шляхом одержують 6АПК?
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
308
11. Чи використовується 6АПК як самостійний лікувальний
препарат?
12. Якими методами і на яких носіях проводиться іммобілізація
пеніцилінамідази у різних країнах?
13. Які антибіотики можна отримати в результаті модифікації
ядра 6АПК?
14. Що є вихідними продуктами для отримання 7АЦК і як за
стосовується 7АЦК?
15. Які напрями створення нової біотехнології виробництва і за
стосування антибіотиків?
Розділ11.Біотехнолоіявиробництваантибіотиів
309