Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
силікагелі шляхом ковалентного зв’язування за допомогою глу
тарового альдегіду за методом фірми «Корнінг Глас». У реактор
надходить попередньо пастеризована, депротеінізована і демі
нералізованана сироватка. Протягом 5 днів безупинної роботи
на установці переробляється близько 30 т сироватки, з якої
одержують 1,7 т цукрового сиропу або 1,2 т сухих цукрів. Сту
пінь конверсії лактози – 80 %. Аналогічна установка за участю
тих же партнерів уведена в дію 1978 р. у Франції. Її продуктив
ність – 500 л/год сироватки. На промисловій установці з ден
ною продуктивністю 200 т цукрового сиропу при 80 % конверсії
лактози собівартість 1 кг отриманих цукрів складає 1,25–1,80
французького франка.
Для вилучення лактози з молочної сироватки біокаталіза
тор (іммобілізована лактаза) розміщується в реакторі горизон
тально у вигляді нерухомого шару.
Вилучення лактози з молока. Необхідність вилучен
ня лактози з незбираного молока викликана тим, що деякі лю
ди, особливо в країнах Азії й Африки, не засвоюють лактозу че
рез відсутність у їхньому організмі лактази. При вживанні в їжу
молока в них з‘являється діарея, метеоризм, біль у животі. Елі
мінувавши лактозу з молока, можна вирішити дуже важливе
питання поліпшення харчування значної частини населення,
насамперед дітей в економічно відсталих країнах.
Однак виникає багато проблем, пов’язаних з особливими фі
зикохімічними властивостями цього продукту. У зв’язку з тим,
що молоко – колоїдний розчин, при використанні реактора з не
рухомим шаром існує потенційна небезпека забивання колонок.
Крім цього, для збереження високої якості і запобігання мікроб
ного забруднення технологією передбачена обробка молока при
низьких робочих температурах. У цьому випадку зменшується
активність іммобілізованого ферменту, тому що оптимум дії
лактази становить 37
о
С. Зменшення активності лактази спричи
няє збільшення часу витримування молока в реакторі. Це, в
свою чергу, може призвести до забруднення молока ферментом і
носієм, очищення молока від яких дорого коштує.
Успішне подолання багатьох з названих проблем дозволило
здійснити перший комерційний проект з одержання безлактоз
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
290
ного молока. З 1975 р. в Італії працює промислова пілотна уста
новка з використанням лактази (рис. 10.4).
Джерелом для комерційних препаратів розчинної лактази є
гриби (з них лактаза більше підходить для переробки кислої сиро
ватки) і дріжджі (лактаза більш придатна для обробки молока).
Для попередження закупорки реактора швидкість, з якою
протікає молоко через колонку, значно збільшили. Іммобіліза
ція дріжджової лактази проведена шляхом включення крапе
льок ферменту у порожнисті нитки триацетатцелюлози, що
змотуються в мотки і дуже рихло розміщуються паралельно осі
реактора та закріплюються в його верхній і нижній точках. Таке
рішення одночасно забезпечує низький опір струму рідини і
дуже велику площу поверхні ферменту. Стійкість триацетатце
люлози перешкоджає потраплянню носія у продукцію. Іммобі
лізований таким методом фермент має високу стабільність:
0,5 кг ферментомістких волокон триацетатцелюлози після пере
робки 500 тис. л молока при 4–7
о
С втратили тільки 10 % своєї
первинної ферментативної активності.
Розділ10.Застосванняіммобілізованиїхферментівбіотехнолоії
291
Рис. 10.4. Схема пілотної установки для одержання
безлактозного дієтичного молока за допомогою іммобілізованої
лактази
(за Клесовим А.А., 1982)
Для усунення мікробного забруднення колонки періодично
промивають бактерицидними розчинами.
При високій вартості лактази (дріжджової βгалактозідази)
економічного ефекту можна досягнути за рахунок високої ек
сплуатаційної стабільності ферменту і високої конверсії лакто
зи. Проблему вирішили, використавши реактор з нерухомим
шаром і рециркуляцією (реактори з нерухомим шаром потребу
ють менше ферменту при виході такої ж кількості продукту).
Установка має 20метровий реактор, у якому знаходиться 4 кг
лактази, іммобілізованої шляхом включення у волокна триаце
татцелюлози. Фермент досить стабільний. Протягом 50 днів ро
боти його активність зменшилася тільки на 20 %. Потужність
установки – не менше 8000 л молока на день. Переробці підда
ється збиране молоко, що стерилізується протягом 3 с при тем
пературі 142
о
С, потім швидко охолоджується до 4–7
о
С і кіль
каразово прокачується зі швидкістю 7 л/хв через реакційну
колонку до досягнення необхідного ступеня конверсії (75 %).
При 7
о
С безлактозне молоко може зберігатися протягом 3–4
місяців.
Джерелом для комерційних препаратів розчинної лактази
є гриби (з них лактаза більш підходить для переробки кислої
сироватки) і дріжджі (лактаза більш придатна для обробки
молока).
Виробництво сирів. Використання іммобілізованих
ферментів може бути перспективним при переробці молока для
виробництва сирів. При виробництві сирів використовується
сичужний фермент реннін. В результаті його дії із незбираного
молока виділяється білок казеїн, який після коагуляції стає ос
новою усього процесу виробництва сичужних сирів. Процес
згортання (зсідання) молока проходить у дві стадії. На першій,
ензиматичній, відбувається зміна структури казеїну, який стає
менш стійким і під дією іонів кальцію на другій неензиматичній
стадії випадає в осад. Крім того, відомо, що сичужний фермент
суттєво впливає на якість сиру і, як наслідок, на економіку ви
робництва.
Природний сичужний фермент (реннін) виготовляють із
сичугів молодих телят, які одержували з раціоном тільки моло
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
292
ко. Практично в усіх країнах з розвиненою молочною про
мисловістю не вистачає сичугів телят, а отже, сичужного фер
менту. У колишньому Радянському Союзі щорічно для потреб
сироваріння потрібно було 200–250 т сичужного ферменту,
який можна виділити з 8–10 млн сичугів телят (Артамонов В.І.,
1989). Підраховано, що загальна потреба в ренніні у світі оці
нюється сумою близько 100 млн дол.
Замість шлунків молодих телят у виробництві сирів почали
використовувати сичуги більш дорослих телят, в яких містить
ся менше реніну, однак вони мають підвищену кількість пепси
ну та небажаних баластних речовин, що негативно впливає на
якість сирів, які виготовляються. Все це зумовило інтенсивний
пошук альтернативних джерел ренніну за допомогою мікроор
ганізмів.
Мікроорганізми продукують різноманітні ферменти. Ще з
кінця ХІХ століття було відомо, що деякі мікроорганізми
синтезують ферменти, які викликають згортання молока. До
них належать Bac. subtilis, Bacterium prodigiosum, Aspergillus
oryzae та ін. Мікробні ферменти для згортання молока у проми
слових масштабах виробляються в Японії, США, Данії та ін
ших країнах. Продуцентами ферментів, які використовуються
в Японії є Mucor parasitiсa, у США – гриб Еndothia parasitica, а
у Данії — плісень Mucor miеhei. Фірмою Cooney et Emerson
випускається фермент реннілаза, у Франції – формоза, а в
колишньому Радянському Союзі вироблявся мезентерин ГР і
мукор. Мікробні ферменти можна використовувати окремо, а
також у суміші з природним ренніном, витрати якого зменшу
ються удвічі.
На жаль, мікробний реннін має деякі недоліки. Він зберігає
активність протягом тривалого часу і має ширший спектр дії по
рівняно з ренніном тваринного походження. Завдяки цьому
мікробний реннін сприяє видаленню природних ароматів сирів,
негативно впливає на процеси консервації і старіння сирів та
погіршує його смакові властивості. Тому останнім часом для
одержання більш якісного ренніну використовуються методи
генетичної інженерії.
Перспективним є застосування іммобілізованого ренніну
чи інших альтернативних протеаз, можливість їх реактивації і
Розділ10.Застосванняіммобілізованиїхферментівбіотехнолоії
293
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
294
тривалого використання, а також автоматизація процесу, що за
безпечить значний економічний ефект.
Перспективним є також використання іммобілізованих
ферментів для стабілізації молока. При обробці трипсином мо
локо скисає повільніше і довше зберігає свої первинні смакові
властивості. Обробка іммобілізованим трипсином збільшила
термін зберігання молока на 2–3 тижні. Використання іммобі
лізованих ферментів ефективніше за традиційні способи об
робки молока – стерилізацію або обробку струмом високої ча
стоти.
Контрольні питання
1. З якою метою використовуються іммобілізовані ферменти в
молочній промисловості?
2. Біотехнологія вилучення лактози з молочної сироватки.
3. На якому носії іммобілізується лактаза для вилучення лак
този з молочної сироватки і як розміщується біокаталізатор
у реакторі?
4. Як відбувається вилучення лактози з молока і які труднощі
виникають при цьому?
5. На якому носії і яким методом проводиться іммобілізація
лактази для обробки молока? Як розміщується біокаталіза
тор у реакторі установки?
6. Які перспективи використання іммобілізованих ферментів у
технології одержання сиру?
Розділ10.Застосванняіммобілізованиїхферментівбіотехнолоії
295
10.6. БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА
D<ФЕНІЛГЛІЦИНУ
Dфенілгліцин – це амінокислота, яка необхідна для виго
товлення напівсинтетичних антибіотиків – ампіциліну і цефа
лексину. Це антибіотики широкого спектру дії, які згубно діють
як на грамнегативні, так і грампозитивні мікроорганізми та ма
ють низьку токсичність.
Італійська компанія «Снам Проджетті» розробила техноло
гію одержання оптично активних амінокислот із рацемічних су
мішей з використанням як біокаталізатора іммобілізованого
ферменту гідантоїнази шляхом включення у порожнисті нитки
триацетату целюлози. Джерелом цього ферменту є печінка те
лят. В процесі іммобілізації активність гідантоїнази знижується
на 20% і становить 80 % активності нативного ферменту.
Dфенілгліцин одержують шляхом хімічного синтезу. При
взаємодії альдегідів з ціанистим калієм і карбонатом амонію
утворюється рацемічна суміш, тобто суміш D, Lізомерів – гідан
тоїнів амінокислот. Гідантоїназа взаємодіє тільки з Dгідантої
нами з подальшим перетворенням їх у карбамоїлпохідні Dамі
нокислот. Lгідантоїни амінокислот довільно перетворюються
на рацемічну суміш, яка складається з D, Lгідантоїнів. Dізоме
ри за участю гідантоїнази знову елімінуються з рацемічної
суміші, перетворюючись на карбамоїлпохідні Dамінокислот.
Останні у присутності гідроксиду кальцію при температурі
100
о
С гідролізуються до Dамінокислот, тобто таким шляхом
одержується Dфенілгліцин. Є дані, що 3 кг фенілгідантоїну в
реакторі періодичної дії при 30
о
С і рН 8,5 протягом 5 год пере
творюються на Dфенілгліцин.
Контрольні питання
1. До яких речовин належить Dфенілгліцин і де він застосову
ється?
2. Біотехнологія одержання Dфенілгліцину?
3. Що є біокаталізатором у біотехнологічному процесі отри
мання Dфенілгліцину і як його застосовують?
Розділ 11.
БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА
АНТИБІОТИКІВ
Відкриття основних груп антибіотиків і весь комплекс гене
тичних і біохімічних досліджень їхніх продуцентів у 40–50ті
роки минулого століття, які дозволили створити масштабне ви
робництво принципово нових лікарських препаратів, можна
віднести до найважливіших досягнень біотехнології.
Демографічний вибух в одних країнах і різке збільшення
тривалості життя в інших на той час були обумовлені значною
мірою антибіотиками. Серед продукції фармацевтичної проми
словості розвинених країн антибіотики посідають перше місце
за всіма показниками.
Незважаючи на знання структури практично всіх відомих
речовин з антибіотичною дією, їхній хімічний синтез громізд
кий і неефективний. У промисловості одержують антибіотики
медичного чи ветеринарного призначення, використовуючи
здатність відповідних штамівпродуцентів генерувати даний ан
тибіотик у певній фазі росту і заданому режимі культивування.
Антибіотики – це низькомолекулярні речовини, які розріз
няються за хімічною структурою. Загальне в цих сполуках є те,
що, залишаючись продуктами життєдіяльності мікроорганізмів,
вони в дуже малих концентраціях порушують ріст мікроорга
нізмів. Більшість антибіотиків належать до вторинних метабо
літів, так званих ідіолітів.
Мікроорганізми, які виробляють вторинні метаболіти, спо
чатку проходять стадію швидкого росту – трофофазу, під час
якої синтез вторинних метаболітів незначний. У міру сповіль
нення або припинення росту через виснаження однієї або де
кількох необхідних поживних речовин у культуральному сере
довищі мікроорганізми переходять в ідіофазу. У цей період
синтезуються ідіоліти (антибіотики). Більшість мікроорганіз
мів у процесі трофофази чутливі до власних антибіотиків, однак
Розділ11.Біотехнолоіявиробництваантибіотиів
297
у період ідіофази вони втрачають цю властивість. Щоб зберегти
мікроорганізми, продукуючі антибіотики, від самознищення,
потрібно швидко досягти ідіофази і потім культивувати мікро
організми у цій фазі.
На сьогодні відомо близько 6000 антибіотиків та антибіо
тичних речовин природного походження, продуцентами яких в
основному є шість родів нитчастих грибів, три роди актиноміце
тів (майже 4000 різних антибіотиків) і два роди справжніх бак
терій (майже 500 антибіотиків).
Із нитчастих грибів плісняві гриби родів Cephalosporium i
Penicillium є продуцентами так званих βлактамних антибіоти
ків – пеніцилінів і цефалоспоринів. Більша частина синтезова
них актиноміцетами антибіотичних речовин, включаючи тетра
цикліни, належить до роду Streptomyces (один тільки вид
Streptomyces griseus синтезує понад п’ятдесят антибіотиків).
Крім пеніцилінів і цефалоспоринів, до βлактамних анти
біотиків належать цефаміцини, продуцентами яких є нитчасті
бактерії актиноміцети, які належать до роду стрептоміцетів
Streptomyces.
У 1945 р. Бротзу з Інституту гігієни в Кальарі (Сардінія)
виділив із проби морської води плісень Cephalosporium acremo
nium, яка синтезує декілька антибіотиків, у тому числі цефалос
порин С, який особливо ефективний проти стійких до пеніцилі
ну грампозитивних бактерій.
У період 40х – 70х років ХХ ст. кількість щорічно винай
дених антибіотиків збільшувалася лінійно: щорічно відкривали
приблизно 200 нових сполук. Наприкінці 70х років ХХ ст. ан
тибіотики виявляли зі швидкістю 300 сполук на рік, з них 150
продукувались актиноміцетами (Альбер Сассон, 1987).
Серед відомих тепер 5000–6000 природних антибіотиків і
антибіотичних речовин для реалізації споживачам виробляєть
ся лише 100, більшість яких (69) одержана зі стрептоміцетів. До
найважливіших антибіотиків терапевтичного призначення, які
використовувались донедавна і використовуються тепер нале
жать наступні їх класи (табл. 11.1).
Перелік наведених класів антибіотиків поповнюється що
року. Причини такої уваги до пошуку нових антибіотиків по
яснюються токсичністю існуючих антибіотиків, алергічними
реакціями на їх введення, підвищенням стійкості до них пато
генних мікроорганізмів, а також необхідністю пошуку засобів
боротьби зі збудниками, проти яких недостатньо ефективні ві
домі тепер препарати.
У світі в 1978 р. було реалізовано антибіотиків на 4,2 млрд.
доларів. Із цієї суми 1,5 млрд. доларів припадає на βлактамні
антибіотики (пеніциліни і цефалоспорини) та антибіотики, які
синтезуються актиноміцетами (1 млрд. доларів). У 1980 р. сві
тове виробництво антибіотиків складало приблизно 25000 т, з
них 17000 т – пеніциліни, 5000 – тетрацикліни, 1200 – цефалос
порини і 800 т – еритроміцини.
Починаючи з середини 60х років ХХ ст. у зв’язку зі зрос
таючою складністю виділення ефективних антибіотиків і роз
повсюдження стійкості до широко вживаних антибіотиків у
значної кількості патогенних бактерій, дослідники перейшли
від пошуку нових препаратів до модифікації структури уже от
риманих. Вони прагнули підвищити ефективність антибіотиків,
знайти захист їх від інактивації ферментами стійких бактерій і
покращити фармакологічні властивості препаратів. Більшість
досліджень було зосереджено на пеніцилінах і цефалоспоринах,
структура яких включає чотиричленне
ββ
&лактамне кільце,
що складається з трьох атомів вуглецю і одного атома
азоту: , і яке є зручним для модифікації.
11.1. ВИРОБНИЦТВО
ββ
<ЛАКТАМНИХ АНТИБІОТИКІВ
Одержання пеніцилінів. Вперше антибактеріальну дію
пеніциліну і можливість його використання як лікувального
препарату встановили у 1940 р. А. Флемінг, Х. Флорі і Е. Чейн зі
співробітниками Оксфордського університету. Продуктивність
лабораторного штаму плісені була на той час 2 мг препарату на
1 л культуральної рідини, що було недостатнім для налагоджен
ня промислового виробництва антибіотика. Продуктивність
гриба вдалося збільшити шляхом багаторазового систематич
ного впливу на нього такими мутагенами, як рентгенівське й
Розділ11.Біотехнолоіявиробництваантибіотиів
299