Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
270
Гомогенні методи аналізу EMIT (enzyme multiplay immu
notechnic) були розроблені для визначення низькомолекуляр
них сполук – гаптенів, ліків, гормонів, фізіологічно активних
речовин. Суть методів полягає в тому, що гаптен пришивається
ковалентно поблизу активного центру ферменту таким чином,
що після його взаємодії з антитілом молекула ферменту втрачає
свою каталітичну активність.
Додавання до цієї системи вільного гаптену приводить до
пропорційного збільшення активності ферменту внаслідок ви
тіснення антитіл із комплексу. Принципові схеми гомогенних
методів імуноферментного аналізу наведені на рис. 9.4.
Як ферменти в таких системах використовуються лізоцим,
малатдегідрогеназа, глюкозо6фосфатдегідрогеназа; як субстра
ти – кофактори. Певно, при утворенні комплексу ферментгаптен
з антитілом, останній так змінює конформацію білкової глобули,
що кофактор не може продуктивно зв’язуватися з активним цен
тром ферменту, в результаті чого його активність зникає.
Антигени, мічені субстратами і кофакторами, також знайшли
застосування в гомогенних методах ІФА. Суть цих методів (рів
няння 6, 7, 8) полягає в тому, що при взаємодії міченого антигену
з антитілами субстрат стає недоступним для дії ферменту,
внаслідок чого продукт ферментативної реакції не накопичу
ється в системі (рис. 9.4, б):
Е
Ag – S → P, (6)
E
Ag – S + Ab Ag – S – Ab → P, (7)
E
Ag – S – Ab + Ag → Ag – S +Ag – Ab → P, (8)
де: Ag – S – комплекс антигену з субстратом.
Отже, утворення комплексу Ag–Ab може відбутися в роз
чині без спеціального розділення вільних і зв’язаних компонен
тів безпосередньо в пробірках.
Гомогенний аналіз на основі біолюмінесценції (ЛІКА).
При ньому маркером є молекула АТФ, яка пришита до інсуліну.
Додавання антитіл проти інсуліну призводить до екранування
молекули АТФ і її недоступності для світлячкової люциферази.
Аналогічний підхід був використаний для застосування як
Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі
271
маркера НАД. У цьому випадку детектуючою системою слугува
ла алкогольдегідрогеназа печінки коня, за допомогою якої в систе
мі внутрішньої регенерації можна визначити до 10
–7
М інсуліну.
Особливістю гомогенних методів є простота й експресність –
час аналізу займає декілька хвилин (до 15 хв), тому що в них
відсутні дифузійні ускладнення імунохімічної реакції, харак
терні для твердофазових методів аналізу.
Метод широко застосовується при визначенні гормонів,
барбітуратів, антиепілептичних засобів та ін.
Використання ІФА
Серед різних напрямів розробки ІФА неабиякий інтерес ви
кликає створення методів, які дозволяють в одному зразку виз
начити декілька речовин. Наприклад, при діагностиці вірусного
гепатиту важливим є одночасне визначення декількох антиге
нів, що дає можливість визначити стадію інфекційного процесу.
Використання суміші антитіл, мічених різними ферментами, –
один із шляхів, який дає можливість вирішити проблему.
Методи ІФА знайшли широке розповсюдження у медицині
(гуманній і ветеринарній), контролі технологічних процесів і
якості біотехнологічної, фармацевтичної, харчової продукції та
наукових дослідженнях.
У медичній діагностиці методи ІФА використовуються для
виявлення мікробних та вірусних збудників і антитіл проти
них, а також збудників паразитарних інфекцій (гельмінти, ма
лярійний плазмодій та ін.), що мають складний і мінливий ан
тигенний склад.
Методи ІФА широко застосовуються і в діагностиці неін
фекційних захворювань, таких як діабет, рак, серцевосудинні й
ендокринні захворювання.
Методи гомогенного ІФА використовуються для контролю
лікарської терапії, особливо препаратів, які впливають на серце
восудинну систему, антибіотиків, психотропних речовин. Ці
методи дають можливість швидко виявляти отруєння, наяв
ність наркотиків і допінгових препаратів у організмі.
У ветеринарній практиці метод ІФА найчастіше застосову
ють для виявлення антитіл вірусу ящуру, хвороби Aуескі, афри
канської чуми свиней, чуми великої рогатої худоби, ротавіру
сної та коронавірусної інфекцій, для оцінки ефективності
вакцинації, а також при епізоотичному обстеженні тварин. Ме
тоди ІФА вважаються особливо ефективними при виявленні
невідомих, важко культивованих і таких збудників, що дуже
складно виявляються в лабораторних умовах, а також для роз
пізнавання маловідомих хвороб.
Можливість візуального виявлення комплексу антитіло
фермент, чому сприяє утворення кольорового продукту фер
ментної реакції під час розщеплення певного субстрату, робить
цей метод доступним для застосування у виробничих лаборато
ріях. Можливість експресдіагностики окремих захворювань
дає змогу проводити досліди на великому поголів’ї.
Налагоджено випуск антивидових мічених ферментами анти
тіл до глобулінів кролів, мишей, свиней, великої рогатої худоби, а
також створені тестсистеми для виявлення вірусних антигенів
і вірусспецифічних антитіл, що створило сприятливі умови
для впровадження методів ІФА у ветеринарну практику.
У зв’язку з інтенсивним розвитком промислової біотехно
логії методи ІФА дедалі ширше застосовуються для контролю
технологічних процесів і якості біотехнологічної продукції. Так,
у мікробіологічних виробництвах методи ІФА використову
ються для швидкого виявлення високоефективних мікроорга
нізмівпродуцентів різних фізіологічно активних речовин (фер
ментів, антибіотиків та ін.), контролю наявності сторонніх
мікроорганізмів і бактеріофагів у ферментерах, для визначення
забруднення повітря промислових приміщень на наявність
шкідливих речовин, які викликають професійні захворювання
обслуговуючого персоналу.
Важливими є методи ІФА при виробництві лікарських пре
паратів, в тому числі із сировини тваринного походження і
донорської крові. Домішки супутніх речовин або вірусних анти
генів можуть бути дуже шкідливими для організму. Важливим
є виявлення у донорській крові вірусу гепатиту В, білкових до
мішок у препаратах інсуліну тощо.
У наукових дослідженнях імуноферментний аналіз застосо
вується як у традиційних сферах біохімічних досліджень, так і в
нових, пов’язаних з розробкою методів генетичної і клітинної
інженерії. Наприклад, одержання гібридом цілком базується на
використанні ІФА при клонуванні клітин. При генноінженер
них роботах ці методи дозволяють швидко відбирати клони
продуценти.
Методи ІФА ефективні при вирішенні фундаментальних
проблем онкології, вірусології, біохімії, фізіології тощо.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
272
Контрольні питання
1. Які передумови використання ферментів у аналітичній ро
боті?
2. Яка особливість сучасних підходів до створення біохіміч
них методів аналізу на основі ферментів?
3. Які переваги мають іммобілізовані ферменти над розчинни
ми у ферментативних методах аналізу?
4. Які є носії для іммобілізації ферментів з їх наступним вико
ристанням в аналітичній роботі і від чого залежить вибір та
кого носія?
5. Які обставини стали передумовою використання іммобілі
зованих ферментів у хімічному аналізі?
6. Який вигляд мають аналітичні проточні реактори? Де вони
застосовуються?
7. Які носії використовуються в аналітичних проточних реак
торах і яким вимогам вони мають відповідати?
8. Що таке ферментні мікрокалориметричні датчики і для чо
го вони розроблені?
9. Що є перевагою ферментних мікрокалориметричних датчиків?
10. Що таке ферментні електроди і як вони створюються?
11. Де використовуються ферментні електроди?
12. На чому базується біолюмінесцентний метод мікроаналізу?
13. Які носії використовуються для іммобілізації ферментів і
поліферментних систем?
14. В яких галузях застосовуються біосенсори з іммобілізова
ними ферментами?
15. На чому базуються методи імуноферментного аналізу (ІФА)?
16. Які маркери (мітки) використовуються в ІФА?
17. Які недоліки мають радіоактивні мітки?
18. Якими властивостями мають бути наділені ферментні мар
кери?
19. Які субстратні мітки найчастіше використовуються?
20. Які є способи введення ферментної мітки (або одержання
кон’югатів з ферментами)?
21. Як проводиться розділення вільних і зв’язаних маркерів?
22. За яким принципом класифікуються методи ІФА?
23. Які особливості мають твердофазні методи?
24. Суть гомогенних методів ІФА і для визначення яких спо
лук вони використовуються?
25. Які особливості має гомогенний аналіз на основі біолюмі
несценції (ЛІКА)?
26. Де використовуються методи ІФА?
Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі
273
Розділ 10.
ЗАСТОСУВАННЯ ІММОБІЛІЗОВАНИХ
ФЕРМЕНТІВ У БІОТЕХНОЛОГІЇ
10.1. БІОТЕХНОЛОГІЯ ПЕРЕТВОРЕННЯ КРОХМАЛЮ
НА ГЛЮКОЗУ
Глюкоза використовується як вихідна сировина для вироб
ництва глюкозофруктозних сиропів, в органічному синтезі для
одержання амінокислот і вітамінів, а також у медицині. Для
одержання глюкози використовується дешева і доступна сиро
вина – крохмаль.
Утворення глюкози з крохмалю – це двоступінчастий про
цес. На першому етапі під дією αамілази з крохмалю утворю
ються декстрини невеликої молекулярної маси (олігоцукристі
фрагменти) і певна кількість мальтози. На другому етапі під ді
єю ферменту глюкоамілази від олігоцукристих фрагментів від
щеплюються кінцеві залишки глюкози.
Для промислового виробництва αамілазу одержують шля
хом мікробного синтезу продуцентами Bacillis subtilis, грибами
Aspergillus niger і A.oryzae. Для B.subtilis сполученням методів
мутагенезу і селекції з методами генетичної інженерії було от
римано штам, здатний до надсинтезу αамілази, вихід якої у 200
разів перевершував вихідні форми. Доведено, що вихід цукри
стих речовин збільшується при підвищенні температури проце
су гідролізу крохмалю. Японські дослідники отримали термо
стабільну αамілазу шляхом введення в сінну паличку гена,
який контролює синтез цього ферменту.
Перспективними продуцентами глюкоамілази є гриби з ро
дин Rhizopus, Endomyces, Endomycopsis, а також бактерії із ро
дин Aerobacter, Clostridium.
Технологічна схема одержання глюкози:
1. Желатинізація крохмалю при нагріванні (62–72
о
С).
2. Декстринізація крохмалю за допомогою бактеріальної
αамілази (80–110
о
, рН 6,5–6,7).
Розділ10.Застосванняіммобілізованиїхферментівбіотехнолоії
275
3. Оцукрення декстринізованого крохмалю за участю
грибної глюкоамілази (50–60
о
, рН 4–5). Одержання крохмаль
ної патоки різного вуглеводного складу.
4. Очищення та одержання глюкозних сиропів. Кристалі
зація глюкози.
Лімітуючою ланкою у біотехнологічному процесі є третя
стадія, проблема якої полягає в одержанні іммобілізованого
препарату глюкоамілази, який би зберігав стабільність при па
раметрах технологічного процесу.
Процес одержання іммобілізованої αамілази поки що не
стоїть на порядку денному, тому що низька її вартість не викли
кає необхідності проведення регенерації ферменту.
У 1970–1980 рр. фірма «Корнінг Глас» продемонструвала
першу пілотну установку з використанням глюкоамілази, іммо
білізованої шляхом ковалентного приєднання до поверхні мак
ропористого кремнезему. У реакційну колону висотою близько
2 м і діаметром 15 см подається 30% розчин частково гідролізо
ваного крохмалю (декстрини), який протягом 9хвилинного
контакту з іммобілізованою глюкоамілазою перетворюється на
глюкозний сироп. Для порівняння: час контакту розчинної глю
коамілази з декстринами для одержання глюкози – 724 хв. Про
тягом 80 днів роботи установки при 40
о
С іммобілізована глю
коамілаза практично не інактивується. Однак до сьогодні
промисловий процес одержання глюкози з використанням гете
рогенного біокаталізатора не реалізований.
Основними перешкодами на шляху промислового освоєння
процесу створення технології крупнотоннажного виробництва
глюкозних сиропів за участю іммобілізованої глюкоамілази бу
ли такі обставини. Поперше, недостатньо висока стабільність
одержаних препаратів іммобілізованої глюкоамілази при темпе
ратурі пастеризації (60–65
о
С); подруге, зниження виходу глю
кози на 7–10 % (90–93 %) при використанні іммобілізованого
ферменту порівняно з нативним, який забезпечує конверсію
крохмалю в глюкозу на рівні 98 %. Технологія може бути поста
влена на комерційну основу за умови одержання стабільних
препаратів з періодом інактивації тривалістю 3–4 тижні. Про
мислової установки з перетворення крохмалю у глюкозу з за
стосуванням іммобілізованої глюкоамілази поки що немає.
В результаті досліджень останнього десятиріччя з іммобілі
зації глюкоамілази на неорганічних матеріалах розроблені біока
талізатори з досить високою стабільністю іммобілізованої глю
коамілази (табл. 10.1). Глюкоамілаза, іммобілізована на
попередньо оброблених частинках кістки свині, зберігала прак
тично повністю первинну активність протягом 700 год роботи
при температурі 37
о
. На носіях, поверхня яких покрита каталі
тичним волокнистим вуглецем (КВВ), іммобілізована глюкоамі
лаза мала найбільшу стабільність. Активність іммобілізованого
ферменту зростала на порядок порівняно з його активності у
розчині. Іммобілізована глюкоамілаза не втрачала каталітичної
активності через 1–1,5 роки зберігання при кімнатній темпера
турі. Використання макроструктурованих КВВмістких носіїв
дозволило виготовити ефективні гетерогенні біокаталізатори
складної геометричної форми (сотові моноліти, пористі пено
матеріали), які мали високу стабільність і активність у процесі
оцукрення крохмалю. При періодичному функціонуванні при
50
о
С протягом 8–8,5 міс. ці біокаталізатори практично повні
стю зберігали ферментативну активність.
Традиційно в біотехнологічному процесі одержання глюко
зи з крохмалю використовуються проточні біореактори з розмі
щенням гетерогенного біокаталізатора у вигляді нерухомого
шару. Останнім часом розроблений принципово новий тип біо
каталітичного реактора – роторноінерційний біореактор (РІБ)
на рівні лабораторного зразка (Коваленко Г.А. та ін., 2004).
Його основним функціональним елементом є контейнер з закрі
пленим гетерогенним біокаталізатором, який обертається нав
коло своєї осі (рис. 10.1). Частота обертів контейнера складає
від 3 до 170 об./хв; загальний об’єм контейнера – 1,2 л; об’єм
біокаталізатора становив 360 м
3
. Температура в біореакторі під
тримувалася на рівні 50–55
о
С. Біокаталізатор отримували шля
хом адсорбційної іммобілізації глюкоамілази на вуглецевовміс
ній пенокераміці.
Випробування показали, що біореактор нового типу (РІБ)
в оптимальних умовах роботи (частота обертів контейнера
не менше 80 об./хв, швидкість подачі субстрату не більше
0,2 л/год) в 1,5–2 рази ефективніший за продуктивністю, ніж
традиційний реактор з нерухомим шаром. Активність біокаталі
затора в 3–3,5 рази вища, ніж у традиційному реакторі.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
276
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
278
Контрольні питання
1. Де використовується глюкоза як вихідна сировина?
2. Які особливості технологічного процесу отримання глюкози
із крохмалю і що є лімітуючим у біотехнологічному процесі?
3. Які біокаталізатори використовуються при одержанні глю
кози і способи їх отримання?
4. Які суттєві проблеми має біотехнологія перетворення крох
малю на глюкозу?
Рис. 10.1. Роторно<інерційний біореактор для гетерогенних
біокаталітичних процесів
(Коваленко Г.А. та ін., 2004)
Розділ10.Застосванняіммобілізованиїхферментівбіотехнолоії
279
10.2. БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ СИРОПІВ
З ВИСОКИМ УМІСТОМ ФРУКТОЗИ
Фруктоза (фруктовий, плодовий чи медовий цукор) широ
ко розповсюджена в природі, міститься у багатьох фруктах і
плодах. Особливо багаті на неї яблука, а також бджолиний мед,
який майже наполовину складається із фруктози. Порівняно зі
звичайним цукром (до складу молекул якого фруктоза теж вхо
дить, але у вигляді хімічної сполуки з менш солодкою глюко
зою) фруктоза має більш приємний смак, і згідно з професій
ною термінологією смак фруктози – «медовий», а звичайного
цукру – нудносолодкий.
Фруктоза в 1,65 раза солодша за сахарозу і більш ніж у
2,2 раза солодша глюкози, що відповідно зменшує її споживан
ня, а це, в свою чергу, призводить до зниження калорійності
продукту. Це дуже важливо з точки зору дієтології харчування.
Крім того, фруктозу на відміну від глюкози чи цукру можуть
споживати хворі на діабет. Фруктоза в суміші з глюкозою не
кристалізується (не зацукрується), що важливо для виробниц
тва морозива, кондитерських виробів тощо.
Сироп з високим умістом фруктози застосовується для ви
готовлення тонізуючих і ацидофільних напоїв, морозива, кон
дитерських виробів, консервованих фруктів та інших продуктів.
Отже, підвищення солодкості сиропів за рахунок збільшення в
них фруктози, потенційним джерелом якої може бути глюкоза,
має практичне значення. У світі були розпочаті спроби пошуку
ефективних методів одержання цього продукту.
Солодкі фруктозні сиропи можна отримувати із цукрози
шляхом кислотного гідролізу (сірчаною, лимонною кислотами,
рідше соляною при підвищеній температурі), або більш ефек
тивним ферментативним способом – інверсією за допомогою
ферменту інвертази (сахарази). Під дією інвертази із цукрози
утворюється суміш Dглюкози і Dфруктози.
Здатність до біосинтезу інвертази мають багато мікроорга
нізмів, але найбільш вивченою групою серед них є дріжджі і зо
крема Sacharomyces cerevisiae. Останнім часом одержані резуль
тати, які свідчать проте, що дріжджі К.marxianus синтезують
інвертазу, активність якої у 2–3 рази вища, ніж S. cerevisiae
(Жеребцов Н.А. та ін., 2003).