Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

Одержаний також комплексний вітамінний препарат, іммо

білізований на колагені і призначений для профілактики пору

шень обміну речовин. Іммобілізація вітамінних комплексів

(аскорбінової кислоти, тіаміну, броміду пірідоксину) на колаге

новому носії проводилася методом включення вітамінів у гель.

Дослідами на лабораторних тваринах встановлено, що викори

стання іммобілізованого комплексу вітамінів більшою мірою

впливає позитивно при порушенні обміну речовин, ніж засто

сування водного розчину цих же вітамінів окремо.

Контрольні питання

1. У яких випадках використовуються ферментні препарати з

лікувальною метою?

2. З якою метою проводиться іммобілізація ферментних пре

паратів, призначених для ензимотерапії?

3. Які носії використовуються для іммобілізації терапевтич

них ферментів?

4. Які вимоги до носіїв, що використовуються для іммобіліза

ції лікувальних ферментів і від чого вони залежать?

5. Які методи іммобілізації застосовуються для одержання

терапевтичних препаратів?

6. Які існують методи використання іммобілізованих терапев

тичних ферментів?

7. У чому полягає перспективність методу іммобілізації шля

хом створення «штучних клітин»?

8. Які особливості іммобілізації та застосування у терапії

мікрокапсул?

9. Що таке ліпосоми та їх характеристика? Які переваги і не

доліки має цей метод іммобілізації?

10. Які особливості має метод включення терапевтичних фер

ментів у «тіні» еритроцитів та в оболонки макрофагів, їх

застосування?

11. Які іммобілізовані ферменти застосовуються у гуманній і

ветеринарній медицині?

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

250

Розділ 9.

ВИКОРИСТАННЯ ІММОБІЛІЗОВАНИХ

ФЕРМЕНТІВ У АНАЛІТИЧНІЙ РОБОТІ

Унікальна специфічність дії і висока каталітична актив

ність, а також дедалі більша доступність індивідуальних фер

ментів стали причиною їх широкого використання для аналі

тичних цілей, в медицині (гуманній і ветеринарній), харчовій,

мікробіологічній і медичній промисловості, для контролю ото

чуючого середовища і наукових досліджень.

Поряд із вдосконаленням різних фізикохімічних інстру

ментальних методів (хроматографічних, радіохімічних, люмі

несцентних та ін.) методи аналізу з використанням як реагентів

ферментів застосовуються для виявлення і кількісного визна

чення різних речовин: металів, органічних і неорганічних спо

лук, метаболітів, ферментів, мутагенів, онкогенів тощо.

Особливістю сучасних підходів до створення біохімічних

методів аналізу на основі ферментів є високі вимоги до їх чут

ливості, точності, специфічності, відтворюваності, можливості

автоматизації, вартості. Крім того, аналіз має бути експресним,

розрахованим на використання мікрокількості зразка і можли

вість проведення дослідження у багатокомпонентних середови

щах, наприклад, таких як сироватка крові, стічні води тощо.

Ще однією характерною рисою сучасного аналізу є його різ

номасштабність залежно від умов використання: поодиноких у

промисловості (1–100 аналізів на день) і масових (10

–10

) при

епідеміологічних обстеженнях, причому аналізи повинні прово

дитися як у стаціонарних, так і в пересувних лабораторіях.

Наведені вище вимоги зумовили створення численних ви

дів ферментних аналізаторів.

Однак попри на переваги ферментативних методів аналізу,

їх використання донедавна обмежувалося сферою клінічної біо

хімії. Це пояснюється такими причинами:

1) ферменти – це, у більшості випадків, дуже дорогі препа

рати, які виділяються із дефіцитної рослинної або тва

ринної сировини;

2) багато ферментів є нестабільними і швидко втрачають

свою каталітичну активність, зберігаються, як правило,

при низькій температурі;

3) розчинні ферменти дуже чутливі до дії різних домішок,

які можуть міститися в об’єктах, що аналізуються;

4) розчинні ферменти можуть бути використані лише од

одноразово, що також підвищує вартість аналізу.

Для широкого впровадження ферментних методів аналізу в

медицину (гуманну і ветеринарну), екологію і технологічне ви

робництво необхідно було вирішити декілька практично важли

вих завдань: знайти дешевші і доступні джерела ферментів, пі

двищити стабільність біокаталізаторів, зробити можливим

багаторазове використання ферментів. Це досягається метода

ми біотехнології, технічної мікробіології, генної інженерії та ін

женерної ензимології. Ферменти рослинного і тваринного похо

дження поступово замінюються на мікробні ферменти.

Біотехнологи навчились одержувати «на замовлення» такі шта

мимутанти, які синтезують необхідний фермент у десятки і

сотні разів більших кількостях, ніж вихідні штами.

Принциповим кроком у розвитку ферментативного аналізу

було впровадження в аналітичну практику іммобілізованих

ферментів, які мають переваги над розчинними формами:

1) багаторазове використання в реакторах періодичної і

безперервної дії;

2) висока стабільність при зберіганні і в умовах прохо

дження процесу;

3) знижена чутливість до дії активаторів та інгібіторів, що

підвищує специфічність аналізу;

4) простота використання у вигляді готових реагентів;

5) можливість проведення послідовних вимірів з одним і

тим самим зразком;

6) зниження вартості аналізу за рахунок вартості самих

ферментів, допоміжних реагентів, особливо кофакторів;

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

252

7) можливість використання іммобілізованих ферментів у

різноманітному обладнанні;

8) скорочення часу аналізів;

9) збільшення рН і температурного оптимуму дії фер

ментів.

Для іммобілізації ферментів використовують різноманітні

типи носіїв, залежно від конструктивних особливостей облад

нання. Наприклад, для ферментних електродів використо

вуються синтетичні полімери, які утворюють плівку з включе

ними в їхні пори ферментами. Для автоаналізаторів фотоме

тричного типу перспективними виявилися найлонові трубки,

на поверхню яких пришиті ферменти. Такі трубки дозволяють

проводити з одним зразком до 10000 аналізів (Єгоров А.М.,

1984). Для колончастих реакторів ефективні макропористі носії

на основі модифікованих кремнеземів.

Перші роботи з аналітичного використання іммобілізова

них ферментів належать до середини 60х років минулого сто

ліття. У 1965 р. Дж. Гілболт включив холінестеразу в крохмаль

ний гель, який нанесли на поліуретанову пластинку і

використали для виявлення фосфороорганічних пестицидів у

повітрі (Березін І.В. та ін., 1987). Іммобілізована холінестераза

використовується сьогодні в автоматичних датчиках у проми

словому виробництві інсектофунгіцидів для постійного контро

лю повітряного середовища цехів.

У 1966 р. Г. Хікс і С. Апдайк вперше використали аналітич

ні колончасті реактори з ферментами, включеними в поліакрі

ламідний гель. За допомогою глюкозооксидази визначали глю

козу, а лактатдегідрогенази – молочну кислоту. Субстрати

пропускали через невеликі колонки об’ємом 1–5 мл. Продукт,

який утворюється (Н

або НАД ⋅ Н

), досліджували колори

метрично. З однією колонкою, тобто з однією порцією іммобілі

зованого ферменту вдавалося провести десятки і навіть сотні

аналізів. Відтоді і розпочалась ера іммобілізованих ферментів у

хімічному аналізі. Подальший розвиток робіт у цій сфері відбу

вався за наступними напрямами.

Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі

253

9.1. АНАЛІТИЧНІ ПРОТОЧНІ РЕАКТОРИ

З ІММОБІЛІЗОВАНИМИ ФЕРМЕНТАМИ

Використання іммобілізованих ферментів відкрило можли

вість створення проточних аналізаторів, необхідних для кон

тролю технологічних процесів.

Були запропоновані різноманітні реактори з іммобілізова

ними ферментами – у вигляді колонок, трубок, порожнистих

ниток. Для заповнення колонок використовували ферменти,

ковалентно зв’язані з носіями – амінованим склом, акриловими

полімерами, агарозою або сефарозою, найлоновим порошком,

силікагелем, силохромом тощо.

Головною вимогою до носіїв є: здатність зв’язувати найбіль

шу кількість ферменту (висока місткість), забезпечувати швид

ке проходження аналізованої суміші через реактор і відсутність

сильної неспецифічної сорбції її компонентів на носії, тому що

це може призвести до зниження активності ферменту і до збіль

шення тиску в колонці.

Одним з найкращих носіїв для колончастих реакторів є се

фароза, активована бромціаном. На ній успішно іммобілізували

не тільки окремі ферменти, але й поліферментні системи. Пер

шою на такому реакторі визначали незамінну амінокислоту –

триптофан.

Р. Сандерем (1977) як ферментні реактори використовував

найлонові трубки. Внутрішня поверхня була частково гідролі

зована кислотою, а потім на найлоні був ковалентно іммобілізо

ваний фермент. Ці трубки приєднували до автоматичних про

точних аналізаторів фірми «Технікон». За допомогою таких

реакторів визначали різні метаболіти і ліки в сироватці крові:

сечовину, сечову кислоту, амінокислоти, глюкозу, лактозу,

мальтозу, пеніцилін та ін.

Оригінальний варіант ферментного реактора запропонува

ли італійські хіміки (Марконі В. і ін., 1975). Вони розробили ме

тод включення ферменту всередину порожнистих ниток

триацетатцелюлози в момент її формування, тобто в момент ви

тягування нитки з розчину. Фермент опинявся включеним у

внутрішню порожнину, куди могли проникати тільки низько

молекулярні субстрати. Ці нитки накручували у вигляді кату

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

254

шок, поміщали у скляну оболонку і через такий ферментний ре

актор пропускали аналізовану суміш. За допомогою такого ме

тоду сьогодні визначається пеніцилін, сечовина, глюкоза й інші

речовини.

9.2. ФЕРМЕНТНІ МІКРОКАЛОРИМЕТРИЧНІ ДАТЧИКИ

Для харчової і мікробіологічної промисловості на основі ім

мобілізованих ферментів розроблені датчики на вуглеводи, які

дозволяють проводити їх безперервне визначення.

У 1975 р. К. Мосбах зі співробітниками (Швеція) вперше

запропонували використовувати в колонних ферментних реак

торах мікрокалориметричний датчик для аналізу метаболітів.

Датчик (рис. 9.1) складається із двох ідентичних колонок, за

повнених іммобілізованим на склі або сефарозі ферментом. В

нижній частині кожної колонки є термістор. Якщо через колон

ки прокачується буферний розчин, то ніякої реакції не відбу

вається і різниця температур між двома термісторами дорівнює

нулю. Коли в колонку вводиться буферний розчин з аналізова

ним субстратом, то в результаті ферментативного перетворення

останнього виділяється тепло. Температура в цій колонці підви

щується. Різниця температур між двома термісторами пропор

ційна кількості перетвореного субстрату.

Перевагою методу є те, що його можна використовувати

для будьякої ферментної системи, непрозорих середовищ, для

реакцій, де не утворюються забарвлені продукти. Чутливість

методу дає можливість виявляти мікромолярні кількості різно

манітних речовин.

9.3. ФЕРМЕНТНІ ЕЛЕКТРОДИ

Це тип ферментних реакторів, у яких фермент і електрод

утворюють єдину конструкцію, яка не потребує для їхнього функ

ціонування додаткових реагентів, окрім буферного розчину. Такі

електроди одержали назву «безреагентних» датчиків, а методи

аналізу, що ґрунтуються на їх використанні називаються «безреа

гентними». Електроди разом з іммобілізованими ферментами,

Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі

255

утворюючи єдину конструкцію, являють собою ферментний

електрод (рис. 9.2).

Єдина конструкція створюється шляхом розміщення роз

чинного або іммобілізованого на розчинному носії ферменту в

приелектродному шарі, який відділений від решти простору

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

256

Рис. 9.1. Мікрокалориметричний датчик для аналізу

метаболітів за допомогою іммобілізованих ферментів

(за Березіним І.В. та ін., 1987):

а — пристрій вимірювального блока: 1 — кріплення верхньої і нижньої

частини колонки; 2 — металевий блок; 3 — термістор; 4 — мікроколонка,

яка заповнена іммобілізованим ферментом; 5 — внутрішня частина блока;

6 — водяна баня; 7 — теплообмінник;

б — загальна схема установки: стрілками показано напрям потоку розчину,

який аналізується; 1 — колонка з ферментом; 2 —теплообмінник;

3 — колонка порівняння; 4 — водяна баня.

Помпа1

Помпа2

Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі

257

Рис. 9.2. Ферментні електроди (за Березіним та ін., 1987):

а — ферментний електрод на основі скляного електрода для вимірювання рН:

1 — металевий електрод; 2 — гумове кільце; 3 — діалізна плівка або інша

напівпроникна мембрана; 4 — розчин ферменту або шар полімерного гелю,

що містить фермент; 5 — скляна мембрана, яка проникна для іонів водню;

6 — приелектродний буферний розчин;

б — схема електрода для визначення глюкози:

1 — катод; 2 — електрод порівняння, який знаходиться у внутрішньому

буферному розчині; 3 — напівпроникна полімерна мембрана; 4 — шар

іммобілізованої глюкозооксидази;

в — електрод для визначення сечовини; в цьому електроді уреаза іммобілізована

в гелі, який нанесений на поверхню скляного електрода.

діалізною мембраною. Однак частіше ферменти включають у

полімерні або гелеві плівки альбуміну, желатину, колагену,

агарагару, гідроксиду алюмінію або ковалентно приєднують до

напівпроникних целюлозних, полікарбонатних мембран чи до

поверхні скляних дисків. Потім така плівка (або диск) прикрі

плюється до поверхні електрода.

У ферментних електродах, як і в інших ферментних аналі

тичних системах, можуть використовуватися не тільки одно

ферментні, але й поліферментні системи і навіть клітини мікро

організмів. В останньому випадку одержують так звані

«бактеріальні» електроди. Так, іммобілізовані нітрифікуючі

бактерії окислюють аміак з утворенням нітриту киснем, зни

ження якого вимірюється електродом Кларка. Аналогічні мето

ди були розроблені для визначення метану і інших газів, а та

кож для етанолу, оцтової кислоти, мутагенів. Мікробні

електроди прості, селективні, стабільні і можуть використову

ватися для контролю забруднення довкілля.

Г. Рехніц у 1977 р. покрив NH

чутливий електрод пастою

клітин Streptococcus faecalis і за його допомогою визначав аргі

нін за реакцією дезамінування. Час роботи такого електрода

складав 20 діб, а час відповіді – 20 хв. Якщо на електрод наноси

ти попередньо зруйновані клітини, то час відповіді скорочується

до 10 хв, а тривалість роботи електрода збільшується до 40 діб.

Потенціометричні ферментні електроди використовуються

для визначення амінокислот, сечовини, нітрат і нітритіонів,

пеніциліну. З ферментів у них використовуються оксидази або

декарбоксилази амінокислот, уреаза, нітрит і нітратредуктаза

та ін.

Важливим напрямом сучасного ферментативного аналізу є

використання мультиферментних систем, у яких один з фер

ментів забезпечує специфічність реакції, а інший – переведення

продуктів цієї реакції у речовину, яка легко детектується (вия

вляється) фізикохімічними методами. Наприклад, деякі фер

ментативні реакції, пов’язані з утворенням перекису водню, мо

жуть використовуватися для фотометричного аналізу разом з

пероксидазою. Для визначення різних вуглеводів як універ

сальний детектор використовується глюкозооксидаза. Напри

клад, визначення лактози здійснюються таким чином:

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

258

Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі

259

βгалактозидаза

лактоза глюкоза + галактоза,

глюкозооксидаза

глюкоза глюконова кислота + Н

+ О

На основі електрода на глюкозооксидазу можуть бути ство

рені електроди на різні вуглеводи (лактоза, цукроза, поліцукри).

9.4. БІОЛЮМІНЕСЦЕНТНИЙ МІКРОАНАЛІЗ

Одним з перспективних методів аналізу є біолюмінесцент

ний метод на основі світлячкової і бактеріальної люциферази.

Під час аналізу реєструється світло, яке випромінюється збу

дженими продуктами реакції, інтенсивність якого за оптималь

них умов проведення процесу пропорційна концентрації таких

важливих метаболітів або коферментів, як АТФ, НАД

⋅ Н

, Н

гемін, ФМН тощо. Висока специфічність цих реакцій стосовно

субстратів, високий квантовий вихід (від 0,01 до 1,0) дозволяє

аналізувати багато речовин з межею виявлення до 1 фмоль при

використанні поліферментних спряжених (поєднаних) реакцій.

У 1976 р. вперше були одержані препарати іммобілізованої

люциферази бактерій. У 1977 р. люциферазу світлячків іммобі

лізували на скляних кульках і на BrCNсефарозі. Зі скляних ку

льок були виготовлені стрижні, за допомогою яких визначали

6

моль/л і більш високі концентрації НАД ⋅ Н

та АТФ. Зго

дом як носії використовували діалізні плівки, ацетатцелюлозні

мембрани, целюлозу і ін. Іммобілізовані люциферази мають в

10–100 разів вищу стабільність, їх можна використовувати ба

гаторазово для визначення АТФ, НАД

⋅ Н

На рис. 9.3 показаний аналізатор з колонним проточним ре

актором, у якому знаходиться ковалентно іммобілізована люци

фераза на BrCNсефарозі для визначення концентрації АТФ.

Аналогічний реактор з іммобілізованою біферментною системою

бактерій дозволяє визначати мікрокількості НАД

⋅ Н