Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

другій. Метод простий, однак використання його обмежується

низькою швидкістю процесу, можливістю інактивації ферменту

на межі розділення фаз, а також переходом ферменту в проти

лежну фазу, що призводить до забруднення продукту і втрати до

рогого каталізатора. Перевагою систем такого типу є можливість

перетворення макромолекулярних субстратів.

Отже, перевагою методів механічного включення є те, що

іммобілізована біологічно активна речовина захищена від нес

приятливих зовнішніх впливів шаром носія, що дає можливість

одержати стабільні іммобілізовані препарати.

Недоліком є неспецифічні взаємодії між включеним фер

ментом і носієм, а також можливі міжмолекулярні взаємодії

білків, що спричинює їх автоліз.

7.5.2. Хімічні методи іммобілізації

Хімічні методи іммобілізації ґрунтуються на ковалентному

зв’язку молекул ферменту з носієм як органічної, так і мінераль

ної природи. Основною позитивною якістю препаратів іммобі

лізованих ферментів, одержаних хімічними методами, є наяв

ність міцних хімічних зв’язків між ферментом і носієм. Це

важлива експлуатаційна характеристика іммобілізованого біо

каталізатора, оскільки в процесі його використання не «зми

вається» фермент з носія (десорбція), чим забезпечується чи

стота продуктів реакції, що надто важливо при одержанні

продукції медичного і харчового призначення, а також для за

безпечення сталих, відтворюваних результатів у аналітичних

системах. Крім того, хімічна іммобілізація ферментів дозволяє

суттєво покращити важливі для практики якості — субстратну

специфічність, каталітичну активність і стабільність. Саме хі

мічними методами шляхом багатоточкового ковалентного зак

ріплення білкової структури вдається досягти найбільшої стабі

лізації ферменту.

7.5.2.1. Основні принципи конструювання препаратів

ковалентно іммобілізованих ферментів. При проведенні ім

мобілізації хімічним методом використовується величезна різ

номанітність хімічних реакцій, вихідних компонентів та умов

перебігу реакцій.

220

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

Практично всі функціональні групи білків (α і εаміногру

пи, α, β і γкарбоксильні групи, сульфогідрильні групи цистеїну,

ароматичні кільця тирозину і триптофану, імідазольна група

гістидіну, гідроксильна група амінокислот) можуть бути вико

ристані для зшивання ферменту з носієм. Зокрема, широко

використовують реакції, які ведуть до утворення пептидних

зв’язків між аміногрупами ферменту і карбоксильними групами

носія або, навпаки, між карбоксильними групами каталізатора і

аміногрупами носія.

В основі методик, що використовуються для хімічної іммо

білізації, лежать реакції утворення:

а) амідного зв’язку [–С(О)–NH];

б) карбамідних зв’язків (похідних сечовини:

–(NH,О)–C(O,S)–NH–);

в) вторинних амінів [–NH–];

г) азосполучення (утворення азосполук зі зв’язком

–N=N–);

д) тіолдисульфідного обміну та інші.

Але незалежно від кількості і хімічної природи компонен

тів, які використовуються в процесі іммобілізації, кількості і

труднощів окремих стадій цього процесу, створюється одна із

трьох моделей, до складу яких входить не більше трьох елемен

тів: фермент (Ф), носій (Н) і зшиваючий бі або поліфункціо

нальний реагент (С, З), який називається «зшивка», «вставка»,

«спейсер», «ніжка» і займає проміжне положення між молеку

лами, що зшиваються.

Таким чином, ковалентна іммобілізація ферментів передба

чає створення конструкцій, сполучених хімічними зв’язками

трьох елементів: НЗФ (максимум) або двох НФ і ЗФ (міні

мум). У свою чергу принципи конструювання відповідних мо

делей можна назвати термінами: «пришивкою» (для НФ),

«зшивкою» (для НЗФ) і «вшивкою» для (ЗФ).

Утворення хімічних зв’язків між елементами можливе тіль

ки за наявності специфічних реакційноздатних груп у всіх реа

гентів, що вступають у взаємодію: ферменту, носія і зшиваючо

го агента.

Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів

221

За наявності на поверхні носія функціональних груп, здат

них вступати у хімічні реакції з функціональними групами фер

менту з утворенням ковалентних зв’язків, методика хімічної ім

мобілізації аналогічна адсорбційній. В розчин ферменту

вводиться носій і на ньому проходить адсорбція ферменту, але

вона незворотна, бо фермент пришивається до носія однією або

декількома ковалентними зв’язками — Н–Ф (рис. 7.6, а).

У разі, коли тісний контакт з носієм може виявитись неба

жаним, наприклад, через несприятливі зміни мікросередовища

ферменту, стеричних і дифузних обмежень, необхідно віддали

ти фермент від носія на деяку відстань. Ковалентна іммобіліза

ція у цьому випадку відбувається шляхом зшивки ферменту з

носієм за допомогою зшиваючого реагента різної довжини —

Н–З–Ф (рис. 7.6, б).

За різноманітністю методичних прийомів цей спосіб незрів

нянно багатший і гнучкіший за попередній за рахунок зшиваю

чого агента. Поперше, підбираючи довжину зшиваючого агента

(або підбираючи оптимальну суміш зшиваючих агентів різної

довжини), можна змінювати каталітичні характеристики іммо

білізованого ферменту.

Подруге, можна спеціально конструювати зшивку так, щоб

вона містила зв’язок, лабільний за певних умов або такий, що спе

цифічно розщеплюється певними реагентами (зокрема, фермен

тативно). Це дає ключ до контрольованого відокремлення іммобі

лізованого ферменту від носія, наприклад, при вирішенні

проблем направленого транспорту ферментів у живому організмі.

Ковалентна іммобілізація можлива і в системах, які почат

ково не містять носія, а тільки фермент і зшиваючий реагент

(З–Ф). Носій (як тверде тіло) формується безпосередньо у про

цесі іммобілізації, або ж сам фермент слугує одночасно і носієм.

Таким чином, відбувається ковалентне вшивання молекули

ферменту в різні типи сіток (рис. 7.6, в). Ідея конструювання

ферментних сіток (ретикуляція ферментів) випливає із полі

функціональної природи самої молекули ферменту, який має на

поверхні, окрім активного центру, велику кількість реакційноз

датних груп. При введенні в розчин ферменту біфункціональ

ного зшиваючого реагента окремі молекули ферменту зшива

ються одна з одною і утворюють сітку, в якій вузлами слугують

самі молекули ферменту. Залежно від природи і кількості зши

222

ЧастинаIII.Спеціальнібіотехнолоії

ваючого агента можна одержати як водорозчинні, так і водоне

розчинні препарати.

Інший спосіб ретикуляції заснований на використанні фер

ментів, попередньо ковалентно модифікованих зшиваючим реа

гентом, який має подвійний зв’язок (наприклад, акрилоілхлори

дом). У цьому випадку при співполімеризації білкового

макромономера з низькомолекулярними мономерами (напри

клад, з акриламідом), утворюються сітчасті полімерні гелі, зшиті

Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів

223

Рис. 7.6. Блок<схеми ковалентної іммобілізації ферментів

(за Березіним І.В. та ін., 1987)

білком або додатковим зшиваючим мономером (наприклад, N,

Nметиленбісакриламідом). У наведеній системі вихідний

стан — рідкий розчин, а кінцевий (після полімеризації) — твер

де тіло (гель), причому, звичайно, воно набуває форми тієї по

судини (реактора), в якій проводиться полімеризація.

Зшивкою білка в об’ємі розчинника (сополімеризація)

одержують тривимірний гель (рис. 7.7, а) у вигляді крупного од

норідного блока, який можна механічно подрібнювати і викори

стовувати у вигляді частинок у суспензіях.

Тривимірний гель можна готувати і безпосередньо у вигля

ді дрібних частинок сферичної форми шляхом емульсійної по

лімеризації. Емульсії одержують диспергуванням водного роз

чину, який містить мономери в органічному розчиннику, що не

змішується з водою. Варіантом таких систем є мікроемульсії

або гідратовані обернені (спрямовані) міцели поверхневоак

тивних речовин (ПАР) в органічних розчинниках. В міцеляр

них системах розміри «крапельок», які містять модифікований

фермент і мономери, можна варіювати і навіть одержувати їх

близькими до власних розмірів молекул ферменту. При їх вико

ристанні можна обшивати окремі молекули ферменту полімер

ною оболонкою заданої товщини, тобто одягти фермент у «со

рочку, яка зшита за міркою» (рис. 7.7, б). Це нова якість

іммобілізації — молекулярний рівень.

Процес ретикуляції може відбуватись не тільки в розчині

ферменту, але й при використанні його іммобілізованних препа

ратів. Так, додаткова обробка адсорбційно іммобілізованого фер

менту на інертному носії зшиваючим агентом приведе до — підви

щення міцності (задублення) препарата. Носій тут не бере участі

в хімічній реакції, а слугує лише матрицею для організації шару

(моношару) адсорбованого ферменту і обумовлює двовимірну

направленість ретикуляції. До того ж, носій може бути взагалі ви

далений (наприклад, нітроцелюлозу розчиняють у метанолі) і та

ким чином одержують зшиту ферментну плівку (рис. 7.7, в).

Препарати молекулярно іммобілізованих ферментів мо

жуть бути одержані, якщо обидві групи біфункціонального

зшиваючого реагента взаємодіють з однією і тією спмою моле

кулою білка — ферменту. Тут можна говорити про накладання

«хімічних дужок», які внутрішньомолекулярно закріплюють

структуру ферменту (рис. 7.7, г).

224

ЧастинаIII.Спеціальнібіотехнолоії

Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів

225

Рис. 7.7. Типи ретикуляції ферментів

(за Березіним І.В. та ін., 1987):

а — міжмолекулярна трьохмірна сітка; б — сітчаста оболонка навколо моле

кули ферменту (молекулярноіммобілізований фермент);

в — міжмолекулярна двомірна сітка; г — внутрішньомолекулярна сітка із по

ліпептидних ланцюгів білка та «хімічних дужок».

7.5.2.2. Характеристика реагентів

Носій. Для хімічної іммобілізації можуть використовува

тись носії як органічної, так і неорганічної природи, природні

або синтетичні. У кожному конкретному випадку використову

ється носій, який має реакційноздатні групи або в нього ці групи

введені шляхом активації чи обробки модифікуючими агентами.

Активацію носіїв проводять з метою введення на поверхню

електрофільних груп, які реакційноздатні стосовно до нуклео

фільних груп білка (аміно і SHгруп). Для цього, наприклад,

вводять діазогрупи, альдегідні, імідоефірні, азидні групи.

Як активатори носіїв використовуються діальдегіди, бром

ціан, ароматичні хінони, карбодиіміди, хлортриазини, епокси

ди, реактив Вудворда тощо.

Зшиваючі реагенти. Можуть бути як простими біфункціо

нальними (тобто з двома однаковими або різними за хімічною

природою реакційноздатними групами) і складними, поліфунк

ціональними, в тому числі і побудованих із різних за хімічною

природою ланок з неоднаковими за міцністю зв’язками між ними.

Найбільш широко як багатофункціональні зшиваючі реа

генти використовуються: глутаровий альдегід, 2,4динітро3,5

дифторбензол, низькомолекулярні карбодиіміди, ціанурхло

рид, епоксиполііміни.

226

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

Епоксиполііміни здійснюють поперечне зшивання біоката

лізаторів за рахунок епокси та іміногруп.

Хлористий ціанур містить три активних атоми хлору. Він

взаємодіє з целюлозою (носій) і ферментом, а третій реакцій

ноздатний зв’язок може бути використаний для взаємодії

з іншим компонентом.

Глутаровий альдегід, який є біфункціональним реагентом,

своїми альдегідними групами при нейтральній реакції

середовища утворює ковалентний зв’язок з вільними аміногру

пами носія і ферменту. Недоліком його є те, що він може взає

модіяти з функціональними групами, які входять до складу ак

тивного центру, в результаті чого фермент інактивується. Щоб

запобігти цьому, активний центр захищають глутатіоном, ци

стеїном або іншим низькомолекулярним тіолом тощо.

Зшиваючі реагенти використовуються для віддалення мо

лекули іммобілізованого ферменту від носія на певну відстань.

Це обумовлено тим, що у деяких випадках тісний контакт фер

менту з носієм є небажаним, наприклад, через несприятливі змі

ни мікрооточення ферменту, стеричних і дифузійних обмежень.

З цією метою використовуються зшиваючі реагенти різної дов

жини.

Мікрооточення іммобілізованого ферменту — це молекули

та іони, що знаходяться дуже близько біля нього і впливають на

його активність. Іммобілізація супроводжується зміною ба

гатьох параметрів ферментативної реакції (оптимумів темпера

тури і рН, константи Михаєліса, максимальної швидкості реак

ції та ін.).

Носій впливає на мікрооточення іммобілізованого фермен

ту. Він може сприяти концентруванню на своїй поверхні або

відштовхувати від неї молекули субстрату, продукту реакції,

інгібітора, іонів водню та інших молекул і іонів, змінюючи при

цьому їхній вміст у безпосередній близькості від ферменту.

Участь носія у створенні мікрооточення іммобілізованого

ферменту відрізняється від розчинника. У зв’язку з цим вво

диться поняття вільний розчин і мікрооточення ферменту.

Якщо фермент, іммобілізованний на поліаніоновому носії і діє

Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів

227

на субстрат, який має позитивний заряд, то у зв’язку з електро

статичною взаємодією концентрація субстрату у фазі вільного

розчину і в мікрооточенні буде різною. Жоден з іонів, що є у

розчині (субстрат, Н

), не розподіляється рівномірно в системі.

Носій впливає також на мікрооточення ферменту в резуль

таті обмежень, створюваних носієм для вільної дифузії молекул

(субстрату, продукту, кофактора тощо) як у напрямі до фермен

ту, так і від нього. Дифузійні обмеження спричинюються вну

трішньою або зовнішньою перешкодою.

Зовнішня дифузійна перешкода пов’язана з наявністю нав

коло носія шару, що не перемішується (шару Нернста), товщи

на якого залежить від швидкості, з якою розчинник перемішу

ється навколо носія. Зі збільшенням швидкості зменшується

величина протидії, створюваної зовнішньою дифузійною пе

решкодою. Речовини розчинника дифундують у шар Нернста

завдяки пасивній молекулярній дифузії і конвекції.

Внутрішні дифузійні перешкоди виникають через обме

ження, створювані самим носієм. Визначальною щодо швидко

сті дифузії є одна з дифузійних перешкод — внутрішня або зов

нішня.

Підбираючи довжину зшиваючого агента (або оптимальну

суміш зшиваючих агентів різної довжини), можна, поперше, змі

нювати каталітичні характеристики іммобілізованого ферменту.

Подруге, можна спеціально конструювати зшивку так, щоб во

на містила зв’язок, лабільний в певних умовах, або такий, що

специфічно розщеплюється певними реагентами (фермента

ми). Це дає ключ до контрольованого відділення іммобілізова

ного ферменту від носія, наприклад, при вирішенні проблем на

правленого транспорту ферментів у живому організмі.

Фермент. Враховуючи, що основою будьякого фермен

ту є білок, однією з головних умов успішного проведення іммо

білізації хімічним методом є врахування специфічних особли

востей будови білкової молекули. Білкові частини ферментів —

це компактна конструкція з однієї або декількох поліпептидних

ланцюгів, які ковалентно зв’язані (зшиті) між собою дисульфід

ними містками. Вони побудовані з

∼ 20 амінокислот, з’єднаних

між собою пептидним зв’язком. Кількість амінокислотних за

лишків у поліпептидних ланцюгах білків складає від декількох

228

ЧастинаIII.Спеціальнібіотехнолоії

десятків до тисяч. Однак якісний склад білків (вміст тих чи

інших амінокислотних залишків) виявляється дуже схожим.

Майже половину усіх амінокислотних залишків білка склада

ють амінокислоти з неполярними або слабополярними бічними

групами. В результаті цього за рахунок гідрофобних взаємодій

поліпептидні ланцюги скручуються у глобулярні структури

таким чином, що ядро складають неполярні фрагменти полі

пептидних ланцюгів, а зовнішній шар утворюють ланки з

полярними та іоногенними групами, такими як —SH, —OH,

—COOH, —NH

Звичайно, деяка кількість гідрофобних угруповань також

може опинитись на поверхні. З них на глобулі формуються кон

тактні ділянки для зв’язування субстратів і (або) для міжсубо

диничних взаємодій.

Таким чином, білкові глобули несуть на своїй зовнішній

поверхні реакційноздатні функціональні групи — мішені. Реак

ційна здатність білка — ферменту визначається набором і кіль

кістю розміщених ззовні білкової молекули функціональних

груп: тіольних (цистеїну), гідроксильних (серину, треоніну, ти

розину), карбоксильних (глутамінової і аспарагінової кислот),

гуанідинових (аргініну), імідазольних (гістидину) та аміногруп

(лізину).

Найбільш реакційноздатними є SHгрупи цистеїну. Вони

здатні брати участь у різноманітних хімічних реакціях: окислен

ня, ацилювання, алкілування і т.д. Однак SHгрупи не зовсім

підходять на роль групмішеней для ковалентної іммобілізації

через низку причин. Поперше, вміст цистеїну в білках невели

кий. Подруге — дуже часто в білках немає вільних SHгруп, то

му що вони беруть участь в утворенні дисульфідних містків, які

стабілізують структуру ферментів. Потретє: у разі, коли такі

групи у білка є, вони, як правило, входять до складу активного

центру ферменту і необхідні для каталітичної активності. Тоді

при іммобілізації їх спеціально захищають обробкою ферменту

різними речовинами. Але попри на це, SHгрупи є дуже прива

бливими як групимішені. Тому розроблені методи введення в

молекулу ферменту екзогенних SHгруп, наприклад, модифіка

цією аміногруп білка потрібними реагентами, зокрема, ацилю

ванням тіолактоном гомоцистеїна.

Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів

229