Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
210
Метод нанесення в колонці. Найбільш зручний для техно
логічного використання іммобілізованого ферменту. Через ко
лонку, заповнену носієм, за допомогою помпи прокачують роз
чин ферменту, причому швидкість потоку має бути такою, щоб
частинки були у завислому стані, утворюючи «кип’ячий шар».
Промивку теж проводять у колонці (рис. 7.3, г, д).
Процес адсорбції і міцність зв’язування ферменту з носієм
значною мірою залежить від умов проведення іммобілізації. Ос
новними факторами, які впливають на адсорбцію ферменту, є
питома поверхня і пористість носія, значення рН та іонної сили
розчину ферменту, його концентрація і температура проведен
ня процесу адсорбції.
Питома поверхня і пористість носія. Сорбційна єм
ність носія пропорційна його питомій поверхні у випадку, коли
носій непористий або коли діаметр пор буде приблизно удвічі
більший за розмір молекули білка. Коли ж пори будуть малими,
то не зможуть вмістити молекулу ферменту і сорбційна ємність
носія буде незначною. При цьому вважається, що молекулярні
розміри субстрату набагато менші, ніж ферменту, і молекула
субстрату здатна проникнути у пору, де знаходиться сорбова
ний фермент. У разі, коли субстратом є речовина з дуже
великою молекулярною масою, вибір діаметра пор носія уже
диктується розмірами молекули субстрату. До того ж, високо
молекулярний субстрат сам може слугувати носієм для іммобі
лізації ферменту. Наприклад, для адсорбційної іммобілізації
ферментів целюлазного комплексу з успіхом був використаний
як носій його субстрат — целюлоза.
Значення рН. Реакція середовища дуже впливає на ефек
тивність сорбції ферменту на поверхні носія, особливо якщо
сорбція відбувається головним чином за рахунок електроста
тичних взаємодій. Це пов’язано з тим, що при зміні рН зміню
ється стан іонізації іоногенних груп носія і білка, які відпові
дальні за адсорбцію. При використанні носіїв, які не є
іонообмінниками, максимальна адсорбція досягається в ізое
лектричній точці білка.
Іонна сила. Значення цієї величини впливає на міцність
зв’язування ферменту з носієм. При високій концентрації солей
присутні в розчині іони витісняють з поверхні носія зв’язані за
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
211
рахунок електростатичних взаємодій молекули білкафермен
ту. Тобто підвищення іонної сили розчину, як правило, викли
кає десорбцію ферменту.
Концентрація ферменту. При збільшенні концентрації
ферменту в розчині кількість сорбованого на носії ферменту
збільшується і відповідно зростає питома каталітична актив
ність іммобілізованого препарату. Але ця закономірність існує
до певної межі. При подальшому підвищенні концентрації фер
менту не збільшується сорбція ферменту на носії, тобто відбу
вається «насичення» носія.
Температура. Підвищення температури порізному
впливає на процес адсорбції. З одного боку, сильне нагрівання
призводить до денатурації білка і втрати каталітичної активно
сті. З іншого — зростання температури зазвичай забезпечує
прискорення процесу. Отже, є оптимальна температура для
проведення адсорбційної іммобілізації, величини якої залежать
від природи ферменту і носія.
Таким чином, ефективність адсорбційної іммобілізації фер
ментів визначається тонким балансом цілої низки факторів. По
рушення цього балансу внаслідок змін будьякого із зовнішніх
факторів може призвести до різкого ослаблення взаємодії фер
менту з носієм і, як наслідок, до його десорбції.
Ефективність сорбції може бути підвищена використанням
попередньо модифікованих носіїв і ферментів.
Іммобілізація на попередньо модифікованих носіях.
Попередня модифікація носія у багатьох випадках дозволяє
суттєво підвищити міцність зв’язування ферменту на матриці.
Модифікуючими агентами для носіїв виступають гідрофоб
ні речовини, розчини іонів металокомплексоутворювачів, а та
кож речовини з великою кількістю груп, здатних до електроста
тичної взаємодії з білковою глобулою.
1. Обробка носіїв іонами металів (Ti, Sn, Zn, V, Fe) підвищує
міцність зв’язування ферменту з носієм за рахунок утворен
ня комплексу білка з іонами металів. Іон металу відіграє роль
містка, який з’єднує молекулу ферменту з носієм (рис. 7.4, а).
Цей метод ефективний при іммобілізації різних ферментів
на таких носіях, як, наприклад, целюлоза, найлон, скло, філь
трувальний папір тощо.
2. Модифікація гідрофобними сполуками теж сприяє підвищен
ню ефективності сорбції, що забезпечується гідрофобними
взаємодіями між модифікатором і неполярними ділянками
на поверхні білкової глобули (рис. 7.4, в). Із носіїв найчастіше
використовуються різні агарози, які ковалентно модифікова
ні гідрофобними групами (алкільними, фенільними та ін.);
поліцукристі носії, модифіковані таніном та інші. На кінці та
кої гідрофобної «ніжки» може бути присутня й заряджена
група, завдяки чому забезпечується взаємодія з ферментом
одночасно за рахунок електростатичних і гідрофобних сил.
212
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
Рис. 7.4. Адсорбційна іммобілізація ферментів на попередньо
модифікованих носіях
(за Березіним І.В. та ін., 1987)
3. Обробка носія речовинами, молекули яких містять велику
кількість функціональних груп, здатних взаємодіяти з гру
пами на поверхні білкової глобули за рахунок електроста
тичних сил і водневих зв’язків (рис. 7.4, б). Наприклад, полі
меризація на поверхні носія силохрому акрілової кислоти,
вінілацетата та ін. з подальшою хімічною модифікацією полі
мера приводить до утворення носія з високою поверхневою
концентрацією функціональних груп (гідроксильних, аміно
алкильних, аміноарильних і гідразідних), здатних до елек
тростатичної взаємодії з білковою глобулою.
Як модифікатор часто використовується також альбумін,
який наноситься на носій шляхом адсорбції, а потім піддається
денатурації нагріванням. Шар денатурованого альбуміну утво
рює на поверхні носія «м’яку» підкладку з великою кількістю
функціональних груп, які здатні міцно зв’язувати молекули
ферменту, водночас забезпечуючи для них сприятливе мікро
оточення. В результаті у багатьох випадках при обробці альбу
міном вдається досягти підвищення ефективності сорбції і по
кращення каталітичних характеристик іммобілізованого фер
менту.
Модифікація носія, окрім підвищення ефективності сорб
ції, часто забезпечує також покращення каталітичних властиво
стей іммобілізованого ферменту за рахунок створення для його
молекул сприятливого мікрооточення. Крім того, інколи без по
передньої модифікації носія взагалі не вдається зберегти каталі
тичну активність ферменту при адсорбційній іммобілізації. На
приклад, якщо фермент з низькою стабільністю у кислому
середовищі рН, то при його адсорбції на силікагелі може відбу
тися втрата каталітичної активності через те, що поверхня цьо
го носія має кислий характер (рН ~ 4). Для уникнення інакти
вації ферменту необхідно носій витримати деякий час у
буферному розчині зі значенням рН, яке відповідало б опти
мальному рН для ферменту.
Аналогічна проблема часто виникає при адсорбційній іммо
білізації ферментів, яким для нормального функціонування
необхідна наявність в активному центрі іона металу.
При іммобілізації металозалежних ферментів може відбу
тись вихід іона металу з активного центру ферменту і його
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
213
зв’язування на поверхні носія, що супроводжується частковою
або повною втратою його каталітичної активності. Це небажане
явище можна усунути шляхом обробки носія розчином, який
містить іони відповідного металу, а отже, насичити центри сорб
ції іонів металів на носії.
Модифікація ферментів аналогічно передбачає введення іо
ногенних груп (полікислоти, карбоксиметилцелюлоза, залишки
янтарної кислоти та ін.) або обробку гідрофобними речовина
ми. У деяких випадках для підвищення зв’язку адсорбованого
ферменту з носієм та запобігання його змивання з носія (дес
орбції) використовується обробка його біфункціональним зши
ваючим реагентом. У цьому випадку поверхня носія виявляєть
ся покритою плівкою зі зшитих між собою молекул ферменту.
Як зшиваючий агент найчастіше використовується глутаровий
альдегід.
Переваги і недоліки методу. Іммобілізація ферментів
шляхом адсорбції широко розповсюджена. Метод простий, до
ступний, дешевий, а носії, які використовуються для проведен
ня адсорбції, порівняно недорогі. Іммобілізовані шляхом ад
сорбції ферменти в більшості випадків мають високу
каталітичну активність і переваги в технологічному плані.
Одним із суттєвих недоліків методу є десорбція ферменту,
тобто сповзання його з носія, що призводить до втрати дорого
го біокаталізатора та забруднення кінцевого продукту, який
одержують. Частіше це трапляється в момент додавання суб
страту до іммобілізованого ферменту. До інших недоліків мож
на віднести низький вихід зв’язаного ферменту з розрахунку на
одиницю маси носія, а також часткову або повну його інактива
цію.
Крім того, недоліком адсорбційного методу іммобілізації є
неможливість дати загальні рекомендації, які дозволили б заз
далегідь зробити правильний вибір носія і оптимальних умов
проведення процесу іммобілізації конкретного ферменту. Це
завдання доводиться щоразу вирішувати заново, використо
вуючи метод проб і помилок.
214
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
215
7.5.1.2. Методи механічного включення молекул
ферменту в структуру носія
Іммобілізація ферментів шляхом включення в гелі. Суть
цього методу іммобілізації полягає в тому, що фермент включа
ється у тривимірну сітку із тісно переплетених полімерних лан
цюгів, які утворюють гель (рис. 7.2, б). Утримання молекул
ферменту відбувається за рахунок того, що середня відстань
між сусідніми ланцюгами в гелі менша за молекули включеного
ферменту, тому він не може полишити полімерну матрицю і ви
йти в розчин. Певну роль в утриманні ферменту в сітці гелю ві
діграють іонні і водневі зв’язки, які виникають між ферментом і
носієм. Простір між полімерними ланцюгами в гелі заповнений
водою, на частку якої зазвичай припадає значна частина загаль
ного об’єму гелю.
Гелі можуть бути як органічної, так і неорганічної природи.
Неорганічні — це силікагель, гель фосфату кальцію. З органіч
них використовуються гелі природних поліцукрів (крохмалю,
агарагару, агарози карагінана тощо), природних білків — кола
гену, а також синтетичних полімерів.
Ефективність включення ферменту в гелі досягається при
оптимальному поєднанні розмірів пор гелю і молекули фермен
ту та оптимізації мікрооточення ферменту.
Для підвищення механічної міцності носіїв і більш міцного
утримування включеного в них ферменту використовується об
робка матриць біфункціональними зшиваючими реагентами,
які здатні взаємодіяти з функціональними групами ферменту.
Перевагою методу є його простота, можливість одержання
іммобілізованих препаратів у будьякій формі (сферичні
частинки, плівки та ін.), універсальність, тобто можливість ви
користання для іммобілізації будьяких біологічно активних ре
човин, поліферментних систем і навіть клітин. Одержані препа
рати стабільні, оскільки захищені гелем від несприятливих
зовнішніх впливів, у тому числі і від бактеріального забруднен
ня, оскільки крупні бактеріальні клітини не можуть проникну
ти у дрібнопористу матрицю.
Недоліком одержаних таким методом препаратів є певні ди
фузні труднощі при взаємодії ферменту з субстратом. А коли
216
субстратом є високомолекулярна сполука, то цей спосіб іммобі
лізації взагалі не може бути використаний.
Іммобілізація ферментів з використанням напівпрони<
кних оболонок (мембран). Загальний принцип, який лежить в
основі цього способу, полягає в тому, що водний розчин фермен
ту відділяється від водного розчину субстрату напівпроникною
мембраною, яка є непроникною для ферменту й інших високомо
лекулярних сполук, але дає можливість вільно дифундувати че
рез неї низькомолекулярним речовинам — субстратам і продук
там реакції (рис. 7.5). Фермент бере участь у каталітичній реакції,
перебуваючи у нативному стані в розчині і, утримуючись мем
браною, легко може бути відокремлений від продуктів реакції.
Існуючі модифікації цього методу відрізняються лише спосо
бами одержання напівпроникної мембрани: методи міжфазової по
ліконденсації, міжфазової коацервації і метод подвійної емульгації.
Мікрокапсулювання. Цей спосіб іммобілізації ферментів
розроблений Т. Чангом (1964). Суть його полягає в тому,
що водний розчин ферменту включають всередину мікрокапсул
— замкнених сферичних пухирців з тонкою полімерною стін
кою — мембраною (рис. 7.5, а). Залежно від способу одержання
розміри мікрокапсул складають десятки або сотні мікрометрів,
а товщина мембрани — сотідесяті долі мікрометра при діаметрі
пор близько декількох нанометрів.
Метод мікрокапсулювання особливо зручний для іммобілі
зації поліферментних систем і може бути придатним для іммо
білізації інших БАР, клітинних органел та інших субодиниць
клітини, гомогенатів тканин тощо.
Включення ферменту у волокна. Це аналогічний мікро
капсулюванню метод, який відрізняється від мікрокапсулювання
головним чином формою одержаних препаратів. У першому ви
падку утворюються сферичні мікрокапсули, а в другому — нитки.
Основа методу полягає у розчиненні волокноутворюючого
полімеру (похідні целюлози, полівінілхлорид, поліLметилглу
тамат) в органічному розчиннику, емульгації одержаного роз
чину з розчином або суспензією ферменту і протисненні
емульсії через фільєри в рідину, яка викликає коагуляцію (на
приклад, толуол).
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
217
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
Рис. 7.5. Іммобілізація ферментів з використанням напівпрони<
кних оболонок (мембран)
(за Березіним І.В. та ін., 1987):
а — мікрокапсулювання; б, в — включення у волокна; г — включення у
порожнисті нитки з напівпроникними стінками; д — включення в ліпосоми;
крапками позначені молекули ферменту; символами S і Р субстрат та
продукт ферментативної реакції відповідно
Емльсія
вода/олія
Одержані волокна — це пористі полімерні гелі, які містять
гомогенну дисперсію невеликих крапель водного розчину фер
менту розміром близько 1 мкм (рис. 7.5, в). Змінюючи умови
процесу коагуляції, можна змінювати розмір пор у волокнах та
кількість включеного ферменту. Однак не всі ферменти можуть
бути інкапсульовані у волокнах. Перешкодою є жорсткі умови
обробки (контакт з органічними розчинниками).
Для іммобілізації можуть використовуватись і одержані
промисловістю готові полімерні порожнисті волокна, які засто
совуються для очищення білків методом діалізу (рис. 7.5, г). Їх
виготовляють з природних і синтетичних полімерів (целюлоза,
полівінілхлорид, поліакриламід).
Для проведення ферментативної реакції волокна, заповнені
розчином ферменту, занурюють у розчин субстрату, який ди
фундує через мембрану всередину волокна.
Недоліком методу є можливість використання тільки низь
комолекулярних субстратів. Волокна, як і мікрокапсули, при
датні для іммобілізації поліферментних систем, клітин, клітин
них фрагментів.
Перевагою методу є його простота. Ферментомісткі волок
на мають високу механічну міцність.
Включення ферменту в ліпосоми. Цей метод може вико
ристовуватись для іммобілізації практично всіх біологічно ак
тивних речовин, а одержані препарати широко застосовуються
в медицині, а також для проведення фундаментальних дослі
джень, оскільки такі системи близькі до природних мембран і їх
вивчення може дати цінну інформацію про ферментативні про
цеси в клітині.
Ліпосоми — це концентричні бішарові замкнуті ліпідні мем
брани. Існують декілька способів їх одержання (рис. 7.5, д). У
простішому випадку розчин ліпіду (зазвичай лецитину) розчи
няють в органічному розчиннику, який упарюють у вакуумі, а
на стінках посудини залишається тонка плівка ліпіду. Вона дис
пергується у водному середовищі, в якому міститься фермент
(БАР), з утворенням сферичних капсул — ліпосом. Спосіб
інкапсулювання (іммобілізації) ферментів (або інших БАР) в
ліпосомах зводиться таким чином до диспергування ліпідної
плівки у присутності розчину ферменту.
218
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
У другому варіанті методу розчин ліпіду в органічному роз
чиннику нашаровують на поверхню водного розчину ферменту,
після чого органічний розчинник видаляють шляхом випарю
вання в струмі інертного газу, а ліпідну плівку, що утворилась,
диспергують у водному розчині.
Розмір ліпосом залежно від методу їх одержання і фосфолі
підного складу може становить від 250
о
А до 1мк і більше. Ліпо
соми можуть бути полі і моноламелярними, тобто складатись з
декількох або одного ліпідного шару. Центральне водне ядро
поліламелярних ліпосом має діаметр 0,15 мк, а відстань між сус
ідніми бішарами дорівнює ~ 75 мк.
Спосіб інкапсулювання ферментів (або інших БАР) в ліпо
сомах зводиться таким чином до диспергування ліпідної плівки
у присутності розчину ферменту.
Характер взаємодії включеного білкаферменту з ліпідними
шарами різноманітний. Частина молекул взаємодіє із внутріш
німи ліпідними шарами, частково проникаючи в них, а інші мо
лекули ферменту можуть адсорбуватись на зовнішній поверхні
ліпосоми.
Відмінність у властивостях структурних частин ліпосом
розширюють можливості іммобілізації. Так, речовини, розчинні
у воді, можуть включатись у внутрішню фазу ліпосом і/або вод
ний простір між концентричними бішарами, а жиророзчинні
можуть включатись у саму мембрану ліпосом. Включення в лі
посоми захищає інкапсульовану речовину від інактивуючого
впливу оточуючого середовища.
Сучасні методи одержання ліпосом дають можливість
включати в них майже 50 % ферменту, який знаходиться в роз
чині, причому практично без втрати каталітичної активності.
Іммобілізація ферментів з використанням систем
двофазового типу. Відмінною рисою цього способу іммобілі
зації є те, що обмеження вільного переміщення ферменту в об’ємі
системи досягається не за рахунок його взаємодії із жорстким но
сієм (сорбентом, гелем або мембраною), а внаслідок його здатно
сті розчинятись тільки в одній із фаз двофазової системи, напри
клад типу «вода — органічний розчинник, що не змішується з
водою» (рис. 7.2, г). В таких системах фермент присутній тільки
в одній фазі, а продукт ферментативної реакції зосереджується у
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
219