Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
Іммобілізація це обмеження рухливості молекул та їх кон
формаційних перебудов. Іммобілізація у широкому розумінні
слова — це будьяке обмеження вільності руху об’єкта в просторі.
Найбільшу групу іммобілізованих біологічно активних ре
човин складають ферменти. Основні принципи і способи іммо
білізіції вперше були розроблені для ферментів і іммобілізовані
ферменти вперше почали широко застосовувати в різних галу
зях народного господарства.
Так, дослідження Дж. Нельсона і Е. Гриффина ще в 1916 р.
показали, що інвертаза, адсорбована на вугіллі (тобто іммобілі
зована), зберігає каталітичну активність. У 20–30 рр. минулого
століття роботи у цьому напрямку були продовжені, і в 1939 р.
Дж. Пфанмюллер і Г. Шлейх одержали перший патент на вико
ристання адсорбованих на дерев’яній тирсі протеолітичних
ферментів для обробки шкур. У 1953 р. Н. Грубхофером і
Д. Шлейтом вперше був застосований метод ковалентної іммо
білізації.
Методичні підходи іммобілізації ферментів розповсюджу
ються і на інші біологічно активні речовини, тому іммобілізація
ферментів і іммобілізовані ферменти є модельними об’єктами.
7.3. ІММОБІЛІЗАЦІЯ ФЕРМЕНТІВ.
МЕТА ІММОБІЛІЗАЦІЇ
Під іммобілізацією ферменту розуміють включення його в
будьяку ізольовану фазу, яка відділена від фази вільного розчи
ну, але здатна обмінюватися молекулами субстрату або ефекто
ра, що знаходяться у фазі вільного розчину. Іншими словами —
іммобілізація — це включення ферменту в таке середовище, в
якому доступною для нього є лише обмежена частина загально
го об’єму.
Іммобілізований фермент (лат. Immobilis — нерухомий) —
це фермент, приєднаний тим чи іншим способом до інертної, не
розчинної підкладки або носія (матриці) з частковим або пов
ним збереженням його каталітичної активності.
Іммобілізованим вважають також фермент, вміщений у сі
ткоподібну матрицю, крізь яку вільно проникають низькомоле
181
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
182
кулярні субстрати і продукти ферментної реакції, але не можуть
пройти макромолекули білкаферменту.
При іммобілізації обмежується рухливість молекул і відбу
вається закріплення структури таким чином, що активний
центр ферменту зберігає свою каталітичну активність протягом
тривалого часу.
Метою іммобілізації є можливість використання фермент
них препаратів як промислових каталізаторів у біотехнологіч
них процесах одержання біотехнологічної продукції, для аналі
тичної роботи і в лікувальних цілях.
В результаті поєднання ферменту з носієм були створені гете
рогенні біокаталізатори, для яких нещодавно, на першій конфе
ренції з інженерної ензимології в Хеннікері (США) в 1971 р. був
узаконений термін «іммобілізовані ферменти». В літературі ще
можна натрапити й на інші терміни, наприклад: «нерозчинні фер
менти», «матрицьовані ферменти» тощо, зміст яких однознач
ний — це препарати ферментів, зв’язаних з нерозчинними носіями.
Однак поняття іммобілізація потрібно розглядати ширше,
як будьяке обмеження вільності руху білкових молекул (або їх
фрагментів) у просторі. Цього можна досягнути, окрім зв’язу
вання з нерозчинним носієм, шляхом внутрішньомолекулярної
чи міжмолекулярної «зшивки» білкових молекул низькомоле
кулярними біфункціональними реагентами, або приєднанням
ферменту до розчинного полімеру. Такі препарати називають
ферментами, модифікованими «зшиваючими» або, відповідно,
полімерними реагентами.
Іммобілізовані ферментні препарати мають низку суттєвих
переваг при використанні їх з прикладною метою порівняно з
нативними попередниками.
Поперше, при іммобілізації ферменти з розряду гомоген
них каталізаторів (які знаходяться у тій самій фазі, що й суб
страти реакції) переходять у розряд гетерогенних (які утворю
ють особливу фазу, відділену від реагентів). Фермент і реагенти
завдяки цьому можуть бути розділені. Це дає можливість: а) зу
пинити в потрібний момент реакцію; б) регенерувати фермент
після закінчення реакції і використати каталізатор повторно;
в) одержати продукт, незабруднений ферментом, що дуже ва
жливо в харчовому і фармацевтичному виробництві.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
Подруге, використання гетерогенних каталізаторів дозво
лить проводити ферментативний процес безперервно, напри
клад, у проточних колонках, і регулювати швидкість реакції, що
каталізується, а також вихід продукту шляхом зміни швидкості
потоку.
Потретє, іммобілізація або модифікація ферменту сприяє
цілеспрямованій зміні властивостей каталізатора, в тому числі і
його специфічності, залежності каталітичної активності від рН,
іонної сили розчину, температури й інших параметрів середови
ща, а також підвищує стійкість (або стабільність) до різних де
натуруючих факторів у 100–1000 разів.
Почетверте, іммобілізація ферментів дає можливість регу
лювати їх каталітичну активність шляхом зміни властивостей
носія.
Завдяки одержанню нового класу біоорганічних каталізато
рів — іммобілізованих ферментів — стало можливим налаго
дження промислового крупнотоннажного виробництва біотех
нологічної продукції, яке піддається автоматизації.
Метод іммобілізації також дає можливість одержувати пре
парати пролонгованої і направленої дії для застосування з ліку
вальною метою у гуманній і ветеринарній медицині та у тварин
ництві для поліпшення травлення і засвоєння поживних речовин
кормів у організмі тварин та збільшення їх продуктивності.
7.4. НОСІЇ ДЛЯ ІММОБІЛІЗАЦІЇ ФЕРМЕНТІВ
Для одержання іммобілізованих ферментів використову
ється величезна кількість носіїв (матриць, підкладок) як орга
нічної, так і неорганічної природи.
Усі носії можна розділити на дві основні групи: органічні і
неорганічні, які, у свою чергу, можуть бути як природними, так
і синтетичними (рис. 7.1).
7.4.1. Органічні полімерні носії
Існуючі органічні полімерні носії можна розділити на два
класи: природні і синтетичні. У свою чергу, клас природних по
лімерів можна розділити на групи відповідно до їх біохімічної
183
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
класифікації: поліцукристі, білкові і ліпідні носії. Синтетичні
полімери також розділяються на групи відповідно до хімічної
будови основного ланцюга макромолекул: поліметиленові, по
ліамідні і поліефірні носії.
Із цієї групи носіїв широкого застосування для іммобіліза
ції ферментів набули природні поліцукристі носії і синтетичні
носії поліметиленового типу.
184
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
Оранічні
НОСІЇ
Біл&ові
&ератин
фіброїн
&олаен
міозин
сироват&овий
альб#мін
желатин
Ліпідні
природні
ліпіди–
&омпоненти
біомембран
Поліц#&ристі
целюлозаіїх
де&странпохідні
аароза
аар
хітин
альінові&ислоти
іїхсолі
епарин
&рохмаль
Полі-
ефірні
Природні
полімери
Синтетичні
полімери
ма&ропористі&ремнеземи
(силі&аелі,силохроми,
ма&ропористес&ло)
природніалюмосилі&ати
(лини,пісо&,цеоліт,
пориста&ерамі&а)
о&сидиметалів
(Al,Ti,Niтаін.)
а&тивованев#ілля
рафітовасажа
аеросил
Неоранічні
Полімети-
ленові
Полі-
амідні
Рис. 7.1. Класифікація носіїв, які використовуються для
іммобілізації БАР
(О.В. Скородумова, Н.Г. Рибальський, 1990)
ПРИРОДНі НОСії. Велике значення природних полімерів
як носіїв для іммобілізації пояснюється їх доступністю і наявні
стю на їх поверхні реакційноздатних функціональних груп (у
вихідному або модифікованому препараті), які легко вступають
у різні хімічні реакції, а також високою гідрофільністю. До не
доліків природних носіїв належать нестійкість до дії мікроорга
нізмів і висока вартість деяких з них.
ПОЛіЦУКРИСТі НОСії—це целюлоза, декстран, агароза і їх по
хідні, агар, хітин, альгінові кислоти і їх солі, гепарин, крохмаль.
Серед них широко використовуються похідні целюлози,
декстрана, агарози, модифіковані різними хімічними зшивками.
Різні типи таких препаратів виробляються зарубіжними фірма
ми для іммобілізації або афінної хроматографії.
Целюлоза — це полі1,4β−DглюкопіранозилDглюко
піраноза:
Целюлоза відзначається високою гідрофільністю, а наяв
ність на її поверхні великої кількості гідроксильних груп дає мо
жливість її легко модифікувати шляхом введення різних замін
ників. Препарати целюлози для надання їм хімічної стійкості
«зшивають» епіхлоргідрином. Для збільшення механічної міц
ності целюлозу гранулюють шляхом часткового гідролізу, в ре
зультаті чого руйнуються її аморфні ділянки. На їх місце для
збереження пористості вводять хімічні зшивки. Гранульована
целюлоза завдяки простоті одержання, порівняно низькій вар
тості належить до зручних носіїв для іммобілізації ферментів і
185
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
афінної хроматографії. Вітчизняні і зарубіжні фірми випуска
ють різні промислові марки целюлози (табл. 7.2) для іммобілі
зації ферментів і афінної хроматографії. Недоліком целюлози
як носія є нестійкість до впливу сильних кислот, лугів та окис
лювачів.
Декстран — полі 1,6α−DглюкопіранозилDглюкопіра
ноза — розгалужений поліцукор з бактеріальних джерел, який
містить залишки глюкози, що зв’язані в основному 1,6глюко
зидними зв’язками (а також 1,2, 1,3 і 1,4зв’язками):
Гелі на основі декстрану, зшиті епіхлоргідрином, випуска
ються фірмою Pharmacia (Швеція) за комерційною назвою «се
фадекс» і Reanal (Угорщина) «молселект». При висушуванні
сефадекси стискаються, а у водних розчинах сильно набухають.
Середній розмір пор у сітці гелю регулюється зміною частки
зшивки. Гелі на основі декстрану мають високу хімічну стій
кість і гідрофільність. Зарубіжними фірмами випускаються
також похідні декстрану, які містять різні функціональні групи
(табл. 7.3).
186
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
189
Агароза широко використовується для іммобілізації, але
вартість її зависока, через що розробляються методи її модифі
кації з метою одержання форм, які легко регенеруються. При
охолодженні гарячого 2–6%го водного розчину агарози до тем
ператури нижче 45
о
С утворюються міцні крупнопористі гелі,
які є свого роду складною сумішшю із заряджених і нейтраль
них поліцукрів. У процесі утворення гелю індивідуальні полі
цукридні ланцюги утворюють подвійні спіралі, які потім агрегу
ють з утворенням «вузлів». При температурі близько 100
о
С
гель агарози розплавлюється, тому на відміну від сефадексів йо
го не можна автоклавувати. Висушування агарози призводить
до незворотньої деструкції гелю, тому його необхідно зберігати
у вигляді водної суспензії.
Гелі на основі агарози виробляються різними зарубіжними
фірмами і випускаються під комерційними назвами «сефароза»,
«біогель А», «ультрагель А», «сефароза CL» (табл. 7.4).
Агар виділяють з клітинних мембран деяких червоних мор
ських водоростей. Точний склад його невідомий. Однак устано
влено, що він містить два поліцукри: агарозу і агаропектин. Гелі
агару утворюються аналогічно до агарозних при охолодженні
водного розчину до температури 38
о
С. Після висушування гель
агару перетворюється на прозору плівку, що дає можливість ви
користовувати для вивчення іммобілізованого в гелі ферменту
оптичні методи дослідження.
До переваг агару варто віднести низьку вартість і нетоксич
ність. Відмінною особливістю цього носія є здатність формува
ти механічно міцні гелі навіть при малих концентраціях у роз
чині.
Суттєвого покращення властивостей агару можна досягну
ти зшиванням епіхлоргідрином, діепоксидними сполуками то
що. Зшитий агар стійкий до нагрівання навіть у лужному сере
довищі, має високу механічну міцність, а наявність на поверхні
великої кількості гідроксильних груп дає змогу для проведення
модифікації. Це дало підставу вважати його майже ідеальним
носієм.
Альгінові кислоти і їх солі — це поліцукри бурих морських
водоростей, які складаються з поєднаних β1,4зв’язками за
лишків Dманнуронової кислоти: