Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
Характерною властивістю цих носіїв є різка залежність їх
розчинності від температури і рН розчину. Так, альгінові кисло
ти добре розчинні в гарячій воді і мало — у холодній. Альгінати
кальцію мають здатність утворювати гелі, які використовують
ся для іммобілізації ферментів, клітин, органел шляхом вклю
чення.
Гепарин — це кислий поліцукор, який містить ланки суль
фатованої Dглюкуронової кислоти (або Lідуронової) і суль
фатованого глюкозаміну (або Nацетилглюкозаміну):
Він успішно використовується для одержання водорозчин
них препаратів іммобілізованих ферментів, які використову
ються у медицині для введення in vivo.
Загальними недоліками поліцукристих носіїв є їх нестій
кість до дії мікроорганізмів і неспецифічна сорбція білків.
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
191
Хітин — природний амінополіцукор. Його можна розгля
дати як целюлозу, в якій СН
2
ОНгрупа замінена ацетамідним
залишком:
Він є основним компонентом зовнішнього скелету ракопо
дібних, комах, а також клітинних оболонок деяких грибів. Ця
сполука є відходом промислової переробки креветок і крабів,
тому доступна у великих кількостях при відносно невеликій
вартості.
Хітин має пористу структуру, не розчиняється у воді, роз
бавлених кислотах і лугах, а також у органічних розчинниках.
Для переведення у реакційноздатну форму він може модифіку
ватись глутаровим альдегідом, а також солями важких металів
(наприклад Ti).
Обробка хітину концентрованими розчинами лугів (деаци
лювання) приводить до утворення хітозану. Хітозан, який має
вільні аміногрупи, може використовуватися для ковалентної ім
мобілізації ферментів за допомогою таких біфункціональних
реагентів, як діальдегіди, діізоціанати. На відміну від хітину хі
тозан розчиняється у мінеральних і органічних кислотах, тому
для іммобілізації часто використовується у вигляді розчинів
(рН 3–7).
При використанні хітозану як носія одержані препарати ім
мобілізованих ферментів мають високу каталітичну активність
і стійкість до дії мікроорганізмів, а також спостерігається суттє
ве підвищення їх термостабільності.
Значний інтерес останнім часом викликають мікробні хіто
занази, які ще недостатньо вивчені. Для виділення хітозаназ із
192
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
продуцента Bacillus sp. 739 і їх афінного очищення ефективним
сорбентом виявився колоїдний розчин хітозану (Г.Е. Актуганов
і ін., 2003). Для адсорбції доцільна концентрація хітозану
0,12–0,15 %, що сприяє значній економії носія і зберігає можли
вість його подальшої регенерації.
У природі хітозан розповсюджений не так широко, як хітин,
і виявлений поки що лише у деяких видів нижчих грибів
(К.Г. Скрябіна та ін., 2000). Тому у промислових масштабах його
одержують в основному з хітину панцирів крабів або креветок
шляхом лужного дезацетилювання.
Білкові носії. До них належать кератин, фіброїн, фібрин,
колаген, міозин, сироватковий альбумін, казеїн та інші.
Використання білків як носіїв для іммобілізації ферментів
має велике практичне значення, наприклад, у медицині. Такі
носії дозволяють наблизитись до умов функціонування фер
ментів in vivo, вирішити проблему біодеградації і використати
більшість із них у вигляді мембран і плівок. Іммобілізацію на
білкових носіях можна проводити як у присутності зшиваючих
агентів, так і без них.
Загальним недоліком для білкових носіїв, які використову
ються в медицині, є їх імуногенність при введенні в організм
(винятком є колаген і фібрин).
Найчастіше як носії використовуються кератин, фіброїн,
колаген, міозин і сироватковий альбумін.
Колаген — фібрилярний білок групи склеропротеїдів. Він
є основним компонентом хрящів і сухожилля, має високу стій
кість до розриву. На своїй поверхні колаген має велику кіль
кість реакційноздатних груп, його можна легко модифікувати,
надаючи матриці широкий набір бажаних властивостей. Так,
блокуванням аміно або карбоксильних груп можна змінити по
верхневий заряд носія і, відповідно, гідрофільногідрофобний
баланс; за допомогою зшиваючих агентів можна одержати стис
нену мікроструктуру.
Колаген має високу гідрофільність. Він здатний сорбувати
від 1 до 5 г води на 1 г білка, залишаючись при цьому в нероз
чинному вигляді і зберігаючи волокнисту структуру.
193
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
Продуктом переробки колагену є желатин — розчинна су
міш поліпептидів. Одержують його тривалою обробкою колагену
окропом, у ході чого гідролізуються деякі ковалентні зв’язки ко
лагену. В результаті волокнистий нерозчинний колаген пере
творюється на розчинну суміш поліпептидів, яка називається
желатиною і має гелеву структуру.
Цінність цього носія полягає в його нетоксичності, легкій
біодеградації, що дозволяє використовувати желатин у фарма
цевтичній і харчовій промисловості.
Кератин — фібрилярний білок групи склеропротеїдів, з
якого майже повністю складається шерсть, волосся, рогові по
криви, пір’я і т.д. Його, як правило, одержують при переробці
пір’я (побічний продукт птахопереробних підприємств). Кера
тин доступний у великих кількостях і дешевий.
Синтетичні полімерні носії. Величезна різноманіт
ність доступних синтетичних полімерів забезпечила їх широке
використання як носіїв для іммобілізації ферментів. Вводячи в
полімерні молекули різні функціональні групи, можна у широ
ких межах змінювати фізичні і хімічні властивості носія.
Синтетичні полімери універсальні і можуть використовува
тись як для ковалентної і сорбційної іммобілізації ферментів, так
і для включення в структуру носія (в гелі, мікрокапсули, трубки).
Найбільш широко використовуються полімери на основі
стиролу, похідних акрілової кислоти, полівінілового спирту, по
ліамідів, поліуретанів і ін. Структура і фізикохімічні властиво
сті синтетичних полімерних носіїв абсолютно різні і варіюють у
широких межах. Серед них є носії у вигляді сферичних части
нок, гранул, порошків, мембран, трубок, пористі носії з макро
сітчастою, ізопористою і гетеропористою структурами, які ви
користовуються як для сорбційної іммобілізації, так і для
одержання гелей, мікрокапсул, або з високореакційними функ
ціональними групами — для ковалентної іммобілізації.
Полімери на основі стиролу. Вони є основою для ба
гатьох промислових марок іонообмінних матеріалів — Дауекс і
Амберліт. Для сорбційної іммобілізації використовуються як
мікропористі, так і макропористі носії, а також носії, які мають
макросітчасту ізопористу і гетеропористу структури. Макросіт
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
194
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
195
часті полістіроли подібні до скла, вони мають стабільну струк
туру пор, не набухають у воді і мають високу механічну міц
ність. Немодифіковані полістірольні носії гідрофобні.
Введення реакційноздатних груп до складу синтетичних
полімерів на основі стиролу дає можливість отримати нові види
носіїв, придатних для хімічної іммобілізації.
Полімери на основі похідних акрілової кислоти. Од
ним із численних похідних акрілової кислоти, які широко вико
ристовуються для одержання полімерних гідрофільних носіїв, є
акріламід. Його використовують для одержання гелю — поліак
ріламідний гель (ПААГ). Він випускається низкою фірм. Так,
фірма Bio–Rad Labs (США) виробляє ПААГ і його похідні під
назвою «біогелі» типу Р, Koch–Light (Велика Британія) — «ен<
закріли», Reanal (Угорщина) — «акрілекси».
Фірми LKB (Швеція) та IBF (Франція) випускають також
носії змішаного типу на основі ПААГ і агарози під назвою
ультрагелі типу AcA. Це жорстка матриця, яка створюється
агарозою з контролюючою пористістю, що забезпечується
ПААГ. Носії випускаються у вигляді водної суспензії сферич
них гранул і використовуються для синтезу афінних сорбентів і
нековалентної іммобілізації ферментів.
Для ковалентної іммобілізації ферментів поліакріламідний
носій активують одним із способів: або в готовий полімер долу
чають функціональні групи методом хімічної модифікації, або
полімеризують відповідне функціональне похідне мономера.
Із інших похідних акрілової кислоти, які використовуються
для одержання полімерних носіїв, є хлорангідрид метакріло<
вої кислоти.
Більшість полімерів на основі акрілової кислоти не стійкі
до впливу багатьох хімічних реагентів, а також набухають у
воді і органічних розчинниках. Тому у випадках, коли необхід
на жорстка структура носія, використовують змішаного типу
носії — ультрагель типу АсА на основі синтетичного і природ
ного полімерів. До синтетичних полімерів із жорсткою структу
рою належать сополімери похідних акрілової кислоти, які випу
скаються під назвою «сферон» фірмами Lachema (Чехія) і
Realco Chem. Co (США). Це макропористі полімерні гелі. Вони
механічно міцні, хімічно і біологічно стійкі. Наявність гідрок
сильних груп на поверхні надає матриці схожість з сефарозою.
Це дозволяє використовувати розроблені для сефарози методи
активації носія.
Поліамідні носії. Це група різних гетероланцюгових
полімерів з амідною групою, яка повторюється –C(O)–NH–.
Один із способів їх одержання грунтується на гомополіконден
сації амінокарбонових кислот — найлон<6, капрон. Окрім
найлона6, для іммобілізації використовуються поліізонітрил<
найлон, поліаміноарилнайлон та ін. Амідні групи надають по
лімерам гідрофільності.
Для використання як носіїв поліаміди активують, частково
гідролізуючи їх, з подальшою обробкою, наприклад, глутаровим
альдегідом.
Головною перевагою носіїв цього типу є те, що вони можуть
бути створені в різній фізичній формі: у вигляді гранул, порош
ків, волокон, мембран, трубок тощо.
До групи поліамідних носіїв належать також полімери на
основі N–вінілпіролідону.
Широке використання цих носіїв, перш за все для медич
них потреб, обумовлено їх біологічною інертністю і стійкістю до
впливу середовища. При використанні полівінілпіролідону і со
полімерів на його основі одержані препарати іммобілізованих
ферментів, які здатні повільно деградувати в організмі, причому
швидкість розпаду залежить від природи другого мономера і
концентрації зшиваючого агента у суміші.
Носії на основі полівінілового спирту. Ці носії,
запропоновані Г. Манеке і Г. Фогтом (1980), мають високу реак
ційну здатність. Відповідна обробка дозволяє вводити в них різ
ні функціональні групи: дісульфідні, альдегідні та ін. Для одер
жання гідрофільних гелів носії можуть бути зшиті глутаровим
альдегідом у кислому середовищі, а в лужному — епіхлоргідри
ном або nксилилендіхлоридом:
196
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
До переваг носіїв на основі полівінілового спирту слід від
нести, окрім високого вмісту реакційноздатних груп, велику мі
сткість.
Поліуретани. Гідрофільні поліуретанові полімери міс
тять угруповання . Вони є зручними матеріалами для
включення ферментів у гель.
Процес іммобілізації у даному випадку полягає у простому
змішуванні компонентів. Поліуретани мають більшу стійкістью
стосовно води, ніж поліаміди.
Органічні низькомолекулярні носії. Природні
носії — ліпіди. Використання природних ліпідів як носіїв
для іммобілізації вимагає спеціальної техніки і дуже трудоміст
ке. Ця іммобілізація наближена до умов функціонування фер
ментативних систем у живій клітині, тому що використовують
ся, як правило, ліпіди — компоненти біомембран: гліцероліпіди,
сфінголіпіди, холестерин, кардіоліпін.
У зв’язку з тим, що ці носії дорого коштують, а для прове
дення іммобілізації необхідне дороге і складне обладнання, во
ни використовуються переважно для одержання лікарських
препаратів.
Як правило, ліпідні носії використовуються у вигляді моноша
рів на різних поверхнях або біошарів сферичної форми — ліпосом.
197
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів
Моношари ліпідів на поверхні води. Ліпіди здатні
утворювати мономолекулярні плівки на межі розділення фаз
(вода : повітря або вода : неполярний розчинник). Ліпідні моле
кули в моношарі розміщені таким чином, що їх полярні головні
групи занурені у водну фазу, а вуглеводневі частини направле
ні у повітря або занурені в органічний розчинник. Така плівка
здатна сорбувати білкові молекули.
Одержання моношарів на поверхні води вимагає спеціаль
ної техніки і є досить трудомісткою процедурою, що обмежує їх
використання.
Моношари ліпіду на твердій поверхні. Ці системи
як носії були запропоновані О.М. Полтораком і Є.С. Чухрай
(1966). Суть методу полягає у нанесенні ліпідного моношару на
тверду підкладку (силікагель, сажа, аеросил) з подальшою ад
сорбцією білка із водного розчину. Як ліпідну матрицю викори
стовують зазвичай лецитин, фосфатидилетаноламін і холесте
рин. Розроблений також метод одержання штучних змішаних
лецитинхолестеринових шарів.
Можливість змінювати структуру і орієнтацію молекул у
ліпідних шарах досягається підбором полярності носія і приро
ди розчинника ліпіду, який використовується.
Ліпосоми. Вперше ліпосоми були описані А. Бенгемом в
1964 р. Для їх виготовлення часто використовуються фосфати
дилхоліни (лецитіни), фосфатидилетаноламін, фосфатидилсе
рин, кардіоліпін, сфінгомієлін, причому вони утворюються як із
чистих ліпідів, так і сумішей.
Існує три різних види ліпосом: мультиламелярні, монола
мелярні і макровезикулярні. Мультиламелярні ліпосоми —
це замкнуті структури, які складаються із декількох концентрич
них ліпідних біслоїв, відокремлених один від одного водним
середовищем. Сумарний діаметр мультіламелярних ліпосом ко
ливається від 1–2 до 50 мкм.
Ультразвукова обробка мультиламелярних ліпосом приво
дить до трансформації їх у прості або моноламелярні з мен
шими розмірами частинок. Діаметр моноламелярних ліпосом
становить від 20,0 до 50 нм.
Третій тип ліпосом — макровезикулярні, які утворюються,
наприклад, шляхом злиття малих ліпосом, що індукуються
198
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
іонами Са
2+
, а також присутністю фосфоліпідів з негативно за
рядженими головними групами. Такі ліпосоми складаються з
одного бішару і можуть мати діаметр від 60,0 нм до 100 мкм.
Розмір і форма ліпосом залежить від способу їх виготовлен
ня, а також від таких факторів, як кислотність середовища, при
сутність неорганічних солей і природи ліпіду, який використо
вується.
Широке використання ліпосом як носіїв для іммобілізації
ферментів і лікарських препаратів обумовлено простотою одер
жання і легкістю регенерації іммобілізованого препарату, а та
кож можливістю застосування in vivo.
Синтетичні аналоги ліпідів (поверхнево<активні
речовини). Поверхневоактивні речовини (ПАР) складаються
з молекул дифільної природи, які містять у своєму складі як по
лярну головну групу, так і неполярну вуглеводневу частину.
Природні ліпіди, в принципі, теж відносяться до ПАР. Синте
тичні ПАР — це сполуки, чимало з яких є продуктами крупно
тоннажного виробництва.
Залежно від того, які групи присутні у головній частині мо
лекули, усі ПАР можна розділити на чотири основних типу:
аніонні, катіонні, неіонні і цвітеріонні. Наприклад, біо2етил
гексиловий ефір натрієвої солі сульфоянтарної кислоти —
аніонна ПАР; цетилтриметиламонійбромід — катіонна ПАР; по
лі (9–10) оксиетилена октилфеніловий ефір (трітон Х–100) —
неіонна ПАР; алкілдіметилкарбоксибетаін — цвітеріонна ПАР.
Фірмою Servera випускається понад 30 найменувань тільки не
іонних ПАР різної будови.
Як носії для іммобілізації ферментів використовуються такі
форми ПАР: обернені (спрямовані) міцели ПАР в органічних
розчинниках; синтетичні миючі засоби (СМЗ) з біодобавками —
ферментами; носії з полімеризованих ПАР.
7.4.2. Носії неорганічної природи
Для іммобілізації ферментів використовуються різні неор
ганічні носії: макропористі кремнеземи — силікагель, силохром,
макропористе скло; метали і їх оксиди: титан, залізо, алюміній;
природні алюмосилікати — різні глини, цеоліти; пориста кера
міка, активоване вугілля, сажа.
199
Розділ7.Біотехнолоіявиробництваізастосванняіммобілізованихпрепаратів