Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
У біотехнологічному процесі одержання інверту використо
вується інвертаза, іммобілізована на різноманітних носіях орга
нічної і неорганічної природи.
Біокаталізатором у пілотній установці фірми Snam Progetti
для безперервного процесу інверсії сахарози є дріжджова інвер
таза, яка іммобілізована шляхом включення у порожнисті нит
ки триацетату целюлози. Біокаталізатор має високу стабіль
ність. За 10 років роботи при температурі 25
о
С він втратив
лише 20 % своєї первинної активності.
Включення інвертази у поліакриламідний гель дає можли
вість отримати біокаталізатор, який має високу стабільність
при температурі 30
о
– за 450 діб безперервної роботи активність
інвертази зменшилася лише на 10 %.
Індійська національна корпорація NRDC розробила проми
словий процес інверсії цукру, біокаталізатором якого є дріж
джові клітини, іммобілізовані на неорганічному носії.
Коваленко Г.А. та ін. (2003) одержали високостабільний ге
терогенний біокаталізатор для процесу інверсії цукру шляхом
адсорбційної іммобілізації інвертази на керамічних носіях, по
критих каталітичним волокнистим вуглецем (КВВ).
Інвертний цукор кристалізується порівняно з сахарозою
повільніше, тому його використовують при виготовленні про
дуктів, в яких кристалізація цукру є небажаною, наприклад, при
виробництві напіврідких начинок цукерок, а також лікерів,
штучного меду, сиропів.
Більш перспективним є шлях одержання фруктози із глю&
кози, яка утворюється в результаті гідролізу крохмалю.
Відомо, що глюкозу можна перетворити на фруктозу фермен
тативним шляхом за участю ферменту глюкоізомерази як роз
чинної, так і іммобілізованої. У промисловості глюкоізомеразу
використовують винятково в іммобілізованій формі. Комерційні
препарати іммобілізованої глюкоізомерази отримують різнома
нітними способами іммобілізації: адсорбцією ферменту на різних
носіях (іонообмінних смолах і пористих неорганічних носіях);
висушуванням цілих клітин продуценту, коли внутрішньоклі
тинний фермент залишався зв’язаним з клітиною; ковалентним
зв’язуванням глюкоізомерази на органічних і неорганічних но
сіях; включенням в гель і нитки; включенням в гель з подальшою
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
280
фруктози, але використовували для цієї мети не розчинну глю
коізомеразу, як японці, а іммобілізований на целюлозному іоно
обміннику фермент у реакторі з плоским шаром.
Наукові основи процесу наступні. Фермент глюкоізомераза
каталізує перетворення (ізомеризацію) глюкози до фруктози за
одну стадію, і реакція відбувається до тоді, доки в реакційній си
стемі кількість глюкози і фруктози не стане майже однаковою.
Після цього реакція припиняється і одержану суміш можна ви
користовувати у вигляді глюкозофруктозного сиропу або від
ділити фруктозу, а глюкозу, яка залишилася, знову піддати ізо
меризації.
Біотехнологічний процес ізомеризації глюкози здійснюєть
ся в реакторах, що мають форму колон висотою до 5 м, які попе
редньо заповнюють іммобілізованим ферментом у вигляді гра
нул, порожнистих ниток, кусочків гелю тощо. В колону
безперервним потоком зверху вниз подають розчин глюкози
(попередньо отриманий при гідролізі кукурудзяного або кар
топляного крохмалю), а з колони витікає глюкозофруктозний
сироп.
Про ефективність такої технології свідчать такі дані: на 1 кг
іммобілізованого ферменту за 100 днів роботи одержують 4 т
фруктози (у перерахунку на сухий продукт). Час напівінактива
ції ферменту (час, за який активність ферменту зменшується
удвічі) становить від 20 до 50 днів. Каталізатор (іммобілізований
фермент) підлягає заміні тільки один раз у 2–3 міс., завдяки чо
му процес є економічно вигідним. Вартість продукту з іммобілі
зованим ферментом складає лише 61 % від вартості продукту з
розчинним ферментом.
Для підтримки високої продуктивності установки протягом
більш тривалого часу рекомендується використовувати чисту
вихідну сировину. А.А. Клесов наводить дані компанії «Денкі
Кагаку», що при використанні кристалічної глюкози продук
тивність реактора була 4000 кг сухої фруктози з розрахунку на
1 кг іммобілізованого ферменту. Напівінактивація каталізатора
відбувалась протягом 50 днів. При більш низькій якості глюко
зи продуктивність реактора зменшувалася до 1500 кг продукту
на 1 кг іммобілізованого ферменту, а час напівінактивації скоро
чувався до 20 днів.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
282
Японська компанія «Кійова Хакко» для одержання сиропу
з високим умістом фруктози використовує глюкоізомеразу, ім
мобілізовану адсорбцією на фенолформальдегідній смолі Дуо
літ А7. Вихідною сировиною є 40 % розчин глюкози при темпе
ратурі 60
о
С (рН 8,2), який пропускають через колону з
Дуолітом А7 (рис. 10.2), а готовий продукт для видалення солей
пропускають послідовно через катіонообмінник і аніонообмін
ник. При безперервній роботі реактора протягом 40 днів не бу
ло встановлено мікробного забруднення системи через високу
температуру (60
о
С). Напівінактивується іммобілізована глю
коізомераза протягом 6 днів. Вартість виробництва при засто
суванні іммобілізованого ферменту становила 61,5 % вартості
продукту, виготовленого із застосуванням розчинної глюкоізо
мерази.
Розділ10.Застосванняіммобілізованиїхферментівбіотехнолоії
283
Рис. 10.2. Схема процесу ізомеризації глюкози у фруктозу
за допомогою глюкоізомерази, яка іммобілізована на
фенолформальдегідній смолі
(за Клесовим А. А., 1982)
Іммобілізована
люоізмераза
Катіоно-
обмінни
Аніоно-
обмінни
Контрольні питання
1. Які переваги має фруктоза над глюкозою і де застосовуються
сиропи з високим умістом фруктози?
2. Яким методом і за участю яких ферментів глюкозу можна
перетворити на фруктозу?
3. Які способи використовуються для отримання препаратів
іммобілізованої глюкоізомерази?
4. В яких установках здійснюється біотехнологічний процес
ізомеризації глюкози і який принцип їх роботи?
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
284
Розділ10.Застосванняіммобілізованиїхферментівбіотехнолоії
285
10.3. БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА ГЛЮКОЗИ
Й ЕТАНОЛУ З ЦЕЛЮЛОЗИ
Розробка цієї технології в масштабах крупнотоннажного
виробництва має виняткове народногосподарське значення. Ін
тенсивна дослідницька робота з вивчення ферментативного гід
ролізу целюлози проводиться в США, Японії, Швеції, Фінлян
дії, Італії; у менших обсягах – у Польщі, Чехії, Словаччині та
Болгарії. Провідним напрямом є пошук економічно вигідних
шляхів одержання, в першу чергу, етанолу як джерела енергії, а
не харчової глюкози, що пов’язано зі сформованою енергетич
ною ситуацією. Розробка високорентабельної технології одер
жання етилового спирту з поновлюваних ресурсів (рослинної
біомаси, відходів сільського і лісового господарств, а також про
мисловості) дозволить зменшити енергетичний голод.
При розробці технології виробництва харчової глюкози нез
доланні поки що труднощі, пов’язані з вибором джерел, якістю
целюлозовмісної сировини і ферментних препаратів, що входять
у целюлозний комплекс. Їхнє співвідношення й активність по
винні бути в такий спосіб збалансованими, щоб кінцевим про
дуктом гідролізу була харчова глюкоза, а не суміш глюкози з ін
шими ді та олігоцукрами, непридатними для використання у
харчовій промисловості. Гідролітична деградація целюлози здій
снюється не менш ніж чотирма ферментами, що складають так
званий целюлозний комплекс. Слід зазначити факт існування у
природних умовах іммобілізації ферментів або автоіммобіліза
ції. Міцно адсорбувавшись на субстраті, ферменти целюлозного
комплексу здійснюють свою каталітичну функцію. Продуктами
гідролітичної реакції є глюкоза (20–40 %), дисахарид целобіоза і
певна кількість більш складних олігоцукрів. Склад кінцевих
продуктів визначається видом целюлозовмісної сировини, скла
дом і співвідношенням ферментів у целюлозному комплексі.
Цукри, що утворюються при гідролізі целюлози, можуть у
реакційній суміші зброджуватись ферментами дріжджових клі
тин з утворенням етанолу. Через те, що целюлозні комплекси, які
каталізують утворення з целюлози глюкози, ще не отримані,
практичні зусилля спрямовані на створення технологій вироб
ництва етанолу, який використовується як енергетичне джерело.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
286
Усі виробники етанолу використовують целюлозний комплекс
мікробного походження.
Одна з установок з переробки целюлозної сировини знахо
диться в США і працює у пілотному режимі. Тут одержують це
люлозний комплекс ферментів і потім використовують його
для переробки паперової макулатури у вуглеводи, які за допо
могою целюлозного комплексу мікробного походження збро
джуються з утворенням етанолу. На другій пілотній установці
(у її створенні на кооперативних засадах брали участь компанія
«Голф Ойл», університети Пітсбурга і Канзаса (США) та
японська компанія «Ниппон Майнинг») проходить відпра
цювання біотехнологія виробництва етанолу з паперової маку
латури і відходів сільськогосподарського виробництва.
Гідроліз целюлози у глюкозу можна провести за допомогою
продуцента Trichoderma reesii, целюлаза якої руйнує кристаліч
ну і нерозчинну целюлозу. У США (С. Альбер, 1987) одержали
мутант T. reesii, який продукує у 2–4 рази більше целюлази, ніж
штам дикого типу. Процес гідролізу целюлози дуже простий.
Гриб вирощують у середовищі, яке містить відходи деревини і
мінеральні солі. Потім культура фільтрується. До фільтрату з
ферментом додається подрібнений папір. Усе поміщають в
реакційний чан та інкубують за температури 50
о
С й певного ат
мосферногоу тиску. Під час реакції гідролізу утворюється нео
чищений глюкозний сироп, а негідролізована целюлоза і фер
мент використовуються повторно. Вихід глюкози складає 50 %
вихідної целюлози. На думку американських фахівців, процес
перетворення відходів целюлози на спирт більш перспективний
ніж одержання спирту із крохмалю кукурудзи.
Контрольні питання
1. Що є проблемним у біотехнологічному виробництві глюкози
і етанолу з целюлози?
2. Які ферменти здійснюють біодеградацію целюлози?
3. Що є продуктом гідролізу целюлози?
4. Яким шляхом у світовій практиці здійснюється переробка
целюлозовмісної сировини?
Розділ10.Застосванняіммобілізованиїхферментівбіотехнолоії
287
10.4. БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ
L<ЯБЛУЧНОЇ КИСЛОТИ
Lяблучна кислота має попит на світовому ринку як замін
ник лимонної кислоти в харчовій і фармацевтичній промисло
вості. Хімічним методом (гідролізом ангідриду яблучної кисло
ти) одержують тільки рацемічну суміш оптичних D, Lізомерів
яблучної кислоти, а мікробіологічний синтез Lяблучної кисло
ти є непридатним для промислового виробництва через його
високу вартість.
Однак Lяблучну кислоту можна одержати шляхом фер
ментації з тієї самої фумарової кислоти, з якої одержують Lас
парагінову кислоту. За участю ферменту фумарази проходить
гідратація фумарової кислоти (приєднання за подвійним зв’яз
ком води) з утворенням Lяблучної кислоти. Як біокаталізатор
використовують клітини, які містять фермент фумаразу.
Для одержання Lяблучної кислоти у великих кількостях
японська фірма «Танабе Сейяку» використовує іммобілізовані
мікробні клітини в поліакриламідному гелі. Однак вони, окрім
основного процесу утворення Lяблучної кислоти, каталізують
небажаний, побічний у данному випадку процес утворення
янтарної кислоти. Для гальмування цієї реакції іммобілізовані
мікробні клітини додатково обробляють. Іммобілізація підви
щує стабільність клітинної фумарази. Час її напівінактивації
при температурі 37
о
С складає 55 днів, тоді коли цей показник
для інтактних (необроблених) клітин сягає 6 днів.
Італійська компанія «Снам Проджетті» для виробництва
Lяблучної кислоти використовує фермент фумаразу, яку іммо
білізують шляхом включення у порожнисті нитки триацетату
целюлози. Окрім цього, компанія використовує для іммобіліза
ції цілих мікробних клітин замість поліакриламідного гелю ін
ший гель на основі карагінану (поліцукру із морських водоро
стей). Це збільшило час напівінактивації ферменту до 160 днів.
Контрольні питання
1. Де застосовується Lяблучна кислота і за участю якого фер
менту її отримують?
2. Які форми ферменту використовують у біотехнологічному
процесі одержання Lяблучної кислоти?
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
288
10.5. ЗАСТОСУВАННЯ БІОТЕХНОЛОГІЙ З
ІММОБІЛІЗОВАНИМИ ФЕРМЕНТАМИ У МОЛОЧНІЙ
ПРОМИСЛОВОСТІ
Нині у молочній промисловості біотехнології з використан
ням іммобілізованих ферментів можуть бути застосовані для
видалення лактози з молока і продуктів його переробки, у про
цесах виробництва сирів, а також для збільшення терміну збе
реження молока.
При переробці молока для одержання сирів утворюється
дуже багато молочної сироватки, у якій міститься в невеликих
кількостях білок, різні солі і лактоза (близько 5 %). Так, при ви
робництві 1 т сиру утворюється 9 т сироватки. В кожній тонні
сироватки міститься близько 5 кг високоякісного білка, вітамі
ни групи В, комплекс вільних амінокислот, усі найважливіші
мінеральні елементи, в тому числі кальцій і фосфор. Але
найціннішим компонентом сироватки є лактоза, якої в 1 т май
же 50 кг.
Лактоза, діцукор або молочний цукор, є цінною сировиною
для харчової і мікробіологічної промисловості. Вона має низьку
розчинність і малу солодкість, і тому в харчовій промисловості
не може використовуватися без попередньої обробки. При дії на
неї ферменту лактази або βгалактозідази розщеплюється на два
моноцукри – глюкозу і галактозу, які у 1,5 раза солодші за
цукор. Вони використовуються у харчовій промисловості, на
приклад, для виготовлення морозива з тривалим терміном збе
рігання (до 4 міс.) та замість меляси для одержання цукристих
речовин.
Сироватка може використовуватись у мікробіологічній
промисловості як субстрат для вирощування культури кормо
вих дріжджів, які мають лактазну активність (Sacсharomyces
fragilis, Zygosacсharomyces lactic, Candidia pseudotropicalis і ін.).
Така переробка молочної сироватки зменшує забруднення
навколишнього середовища, тому що в більшості випадків ці
відходи переробки молока не утилізуються. Хімічний гідроліз
лактози економічно невигідний через високу вартість очищен
ня отримуваних з неї продуктів.
Вилучення лактози з молочної сироватки. Поки
що немає промислових установок з переробки молочної сиро
ватки, хоча доступна і дешева сировина та цінні продукти, що
утворюються при гідролізі, викликають неабиякий інтерес. У
деяких країнах працюють пілотні установки. Так, у США фір
мою «Корнінг Глас» налагоджена переробка депротеінізованої і
знесоленої сироватки. В установці, що працює при 50
о
С, вико
ристовується лактоза, іммобілізована методом ковалентного
зв’язування з пористим силікагелем за допомогою глутарового
альдегіду. Час напівінактивації ферменту залежить насамперед
від складу вихідної сировини і при переробці знесоленої депро
теінізованої сироватки досягає 62 днів. Собівартість 1 т цукрів,
отриманих при ферментативному гідролізі сироваткової лакто
зи, на цій установці складає близько 175 доларів.
У 1978 р. в Англії розпочали переробку молочної сироватки
з вилучення лактози на напівпромисловій установці (рис. 10.3).
Наразі використовується лактоза, іммобілізована на пористому
Розділ10.Застосванняіммобілізованиїхферментівбіотехнолоії
289
Рис. 10.3. Схема напівпромислової установки для гідролізу
лактози у молочній сироватці
(за Клесовим А.А., 1982)