Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

Біолюмінесцентним методом сьогодні визначаються багато

діагностично важливих біохімічних тестів, у яких визначува

ною речовиною є АТФ або НАД

⋅ Н

. Наприклад, підвищення

в сироватці крові активності креатинкінази спостерігається при

таких важких захворюваннях, як інфаркт міокарда, інсульт або

мускульна дистрофія. Біолюмінесцентний метод дозволяє

встановити активність цього ферменту від 0,1 до 1000 МО

(в нормі сироватка містить менше 10 МО креатинкінази). Фер

ментативний метод аналізу креатинкінази заснований на таких

реакціях:

креатинкіназа

АДФ + креатинфосфат АТФ + креатин.

Наприкинці кінці ХХ століття з’явилося чималоо робіт з

використання в мікроаналізі соіммобілізованих поліфермент

них біолюмінесцентних систем. Наприклад, за допомогою три

ферментної соіммобілізованої системи: аденілаткіназа + піру

ваткіназа + люцифераза світлячків визначають різні аденінові

нуклеотиди: АМФ, АДФ і АТФ таким чином:

аденілаткіназа

АМФ + ЦТФ АДФ + ЦДФ

піруваткіназа

АДФ + фосфоенолпіруват АТФ + піруват.

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

260

Рис. 9.3. Біолюмінісцентний мікроаналіз з колонним реактором

(за Березіним І.В. та ін., 1987):

а — схема установки; 1 — розчин субстрату; 2 — перистальтична помпа;

3 —пристрій для введення зразка, що аналізується; 4 — колонка з

іммобілізованою люциферазою в кюветному відділі люмінометра;

5 — реєструючий пристрій (самописець або дисплей).

Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі

261

Потім АТФ вимірюють люциферазою світлячків. При ана

лізі АДФ, окрім люциферину, беруть субстрат піруваткінази –

фосфоенолпіруват, а для визначення АМФ у реакційну суміш

вводять цитидинтрифосфат (ЦТФ). Отже, один біокаталізатор,

що містить три співіммобілізованих ферменти, використовуєть

ся для визначення трьох нуклеотидів.

Триферментна система: бактеріальна люцифераза + оксидо

редуктаза + форміатдегідрогеназа, що співіммобілізовані на

BrCNсефарозі, використовуються для визначення НАД в інтер

валі концентрації 10

12

–10

6

моль/л і форміату з межею виявлення

12

моль/л. У цьому випадку НАД перетворюється за реакцією:

форміатдегідрогеназа

НАД + НСООН НАД ⋅ Н

+ СО

в НАД ⋅ Н

який вимірюється біолюмінесцентно.

Великою перевагою співіммобілізованих поліферментних

систем є те, що активність співіммобілізованих ферментів зрос

тає у десятки, а іноді в сотні разів порівняно з їх розчинними

формами. Певно, при співіммобілізації досягається значно ви

ща локальна концентрація ферментів і продуктів проміжних ре

акцій на поверхні носія, полегшується дифузія продуктів однієї

ферментативної реакції до активного центру іншого ферменту.

Сьогодні 4, 7 і навіть 13ферментні співіммобілізовані систе

ми використовуються для біолюмінесцентного мікроаналізу різ

них метаболітів: стероїдів, тригліцеридів, жовчних кислот тощо.

9.5. БІОСЕНСОРИ З ІММОБІЛІЗОВАНИМИ

ФЕРМЕНТАМИ

Біосенсори з іммобілізованими ферментами найбільш при

датні для вирішення біоаналітичних завдань в медицині (гуман

ній і ветеринарній), харчовій, мікробіологічній, хімічній проми

словості, біотехнології і екології для контролю оточуючого

середовища, а також в наукових дослідженнях.

Десятки біохімічних тестів виконуються при постановці

діагнозу і для контролю за ходом лікування. Чимало з них

ґрунтуються на використанні ферментів, в тому числі іммобілі

зованих.

Наприклад, ферментний електрод на глюкозу, вмонтований

в автоматичну систему, допомагає не тільки контролювати рі

вень глюкози в крові хворим на діабет, але й корегувати цей рі

вень, подаючи сигнали на дозатор інсуліну в організм.

У харчовій промисловості ферментні датчики дають мож

ливість визначити якість вихідної сировини і, що дуже важливо,

визначати залишкові кількості пестицидів та інших шкідливих

речовин. Аналізатори з іммобілізованою холінестеразою, кон

тролюючи склад повітря в хімічних цехах, допомагають забез

печити належні умови праці людей на особливо шкідливих під

приємствах.

Контроль за стерильністю зразків є важливим завданням

біохімічної, фармакологічної промисловості і медичної мікро

біології. Його можна забезпечити аналізатором на основі іммо

білізованої люциферази, за допомогою якої можна виявити біо

люмінесцентним методом 500–1000 клітин в 1 мл.

9.6. ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ (ІФА) І ЙОГО

ВИКОРИСТАННЯ

Серед вимог до сучасних методів біохімічного аналізу

найважливішим є специфічність, тобто здатність детектувати

(виявляти) дану речовину у складних багатокомпонентних се

редовищах, таких як сироватка крові, сік рослин або фермента

ційне середовище. Найбільшу специфічність мають імунохіміч

ні методи, що грунтуються на реакції антитіл з антигеном, які

утворюють одне з одним стійкі комплекси.

Сутність будьякого імунохімічного аналізу зводиться до

того, щоб після завершення реакції антигенантитіло визначити

концентрацію надлишкового компонента (антигена або антиті

ла), який не вступив у реакцію. Оскільки ці концентрації неви

сокі (10

12

– 10

8

моль/л), для їх виявлення зазвичай використо

вують легко детектовану мітку (радіоактивний йод, трітій).

Нові можливості були відкриті при використанні ферментів

для підвищення чутливості імунохімічних методів аналізу.

Виявилося, що без втрати чутливості методу радіоактивна міт

ка може бути замінена приєднанням ферменту, який після реак

ції виявляється за його каталітичною активністю.

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

262

Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі

263

Поєднання ферментативних та імунохімічних методів ана

лізу зумовило створення імуноферментних методів аналізу, в

яких антитіло виступає як специфічний детектор речовини, що

визначається, а фермент – як маркер імунохімічної реакції, за

допомогою якого візуалізується утворення комплексу. В ІФА

використовуються різноманітні методи ферментативного аналі

зу, що визначає її високу специфічність і чутливість.

Принципи імунохімічного аналізу

ІФА – процес утворення кон’югату відомого антитіла і фер

менту та наступного приєднання отриманої комплексної сполу

ки до антигена.

Для проведення ІФА потрібна іммобілізація антитіла або

антигена на твердому носії (підкладці) шляхом гідрофобної,

електростатичної взаємодії або в результаті ковалентного

зв’язування антитіла чи антигена з носієм.

Антитіло, утворюючи комплекс з антигеном, може забезпе

чити унікальне за специфічністю виявлення речовини в будь

яких складних багатокомпонентних системах. Спочатку осно

вою імуноферментного аналізу була властивість антитіл (Аb)

«склеювати» антигени (Аg). Цей процес подається наступною

системою рівняння:

Ag + Ab АgАb, (1)

АgАb + (Аg)

+ (Аb)

(АgАb)

. (2)

Оскільки молекули антитіл є двовалентними, вони здатні

зв’язуватися з двома молекулами антигену в комплекс, який, у

свою чергу, може зв’язувати інше антитіло і т.д. Утворення таких

агрегатів можна виявити за збільшенням помутніння розчину,

або за випадінням в осад. Цей підхід використовується, напри

клад, для визначення груп крові при «склеюванні» еритроцитів

антитілами тієї чи іншої специфічності. Така реакція одержала

назву гемаглютинації і досі широко використовується. Взаємо

дія білкових антигенів з антитілами викликає їх осаджування,

тобто преципітацію. Цей метод також широко застосовується

при визначенні білків плазми крові в концентрації 10

6

г/мл.

Але ці методи не можуть забезпечити кількісне визначення ре

човин. Вони належать до якісних або напівкількісних.

Принципово новий крок був зроблений при використанні в

імунохімічних реакціях компонентів, помічених маркером,

який детектується одним із відомих фізикохімічних методів з

високою чутливістю.

Визначення концентрації антигену ґрунтується на принци

пі конкурентного зв’язування антитілами міченого і неміченого

антигена. Суть цих методів подається таким рівнянням:

Аg + Аg* +Аb АbАg + АbАg*, (3)

де: Аg* і Аg – визначуваний антиген з міткою і без мітки;

Аb – антитіла;

АgАb і Аg*Аb – відповідні комплекси.

Для визначення концентрації комплексу Аg*Аb його пот

рібно віддокремити від вільного міченого антигена Аg*, або змі

нити властивості маркера в комплексі з антигеном. Обидва

принципи знайшли практичне застосування в методах імунохі

мічного аналізу.

Маркери в імунохімічному аналізі

Як мітки використовуються різні речовини: радіоактивні

ізотопи

125

I або

Н, ферменти або їх субстрати, флуоресцюючі

барвники. Від чутливості маркера залежить чутливість методу

аналізу. Вибір маркера і способу його «прив’язування» до анти

гену є одним із важливих етапів у проведенні аналізу.

Радіоактивні мітки. Вперше вони були запропоновані

американськими дослідниками (Берсон С.А., Ялоу Р.С., 1959) і

спочатку мали широке застосування. Однак сьогодні перевага

надається маркерамферментам. Це зумовлено труднощами,

пов’язаними з використанням ізотопних маркерів. Це склад

ність і висока вартість обладнання, необхідність централізова

ної системи розподілу імунохімічних наборів, мічених радіоак

тивними ізотопами та небезпека ізотопів для навколишнього

середовища. Тому були запропоновані маркериферменти.

Ферментні мітки. З відомих нині понад 2000 різних фер

ментів, тільки деякі використовуються в імуноферментному ана

лізі. Це пояснюється високими вимогами, які висуваються до

властивостей ферментівмаркерів. Фермент має бути високоак

тивним, а продукти його реакції виявлятися з високою чутливі

стю; стабільним, щоб активність його зберігалася протягом року;

вміст ферментумаркера у досліджуваному зразку має бути міні

мальним. Через це для різних об’єктів використовуються різні

ферменти. У багатьох випадках, коли необхідний якісний резуль

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

264

Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі

265

тат, оцінка імунохімічної реакції може бути проведена візуально.

Субстратні мітки. Крім ферментів, як маркери можуть

використовуватися субстрати. Зокрема, часто використовують

ся як мітки АТФ і НАД, що можуть бути «пришиті» до молеку

ли антигену через аденіновий залишок таким чином, що збері

гається їх здатність взаємодіяти з ферментом. Аналогічно були

використані субстрати пероксидази (люмінол, ізолюмінол).

Одержання кон’югатів з ферментами

Для введення ферментної мітки розроблено багато різних

хімічних, біохімічних та імунологічних способів. Першим реа

гентом, який використовувався для синтезу імуноферментних

кон’югатів, був глутаровий альдегід, що реагує з аміногрупами

лізину білкових молекул. За його допомогою були одержані

кон’югати антитіл і антигенів з пероксидазою, лужною фосфа

тазою, глюкооксидазою, глюкоамілазою. Склад одержаних

кон’югатів можна варіювати, змінюючи концентрацію альдегіду

і білкових компонентів.

З водонерозчинних карбодиімідів найбільш успішно для

синтезу кон’югатів використовуються 1етил3(3діметиламі

нопропіл) карбодиімід і 1циклогексил3(2морфоліноетил)

карбодиімідметилnтолуолсульфонат, які утворюють пепти

дний зв’язок між вільними карбоксильними і NH

групами біл

кових компонентів.

Широкого розповсюдження набув метод синтезу імунопе

роксидазних кон’югатів, в основі якого лежить окислення пер

йодатом натрію вуглеводної частини молекули пероксидази з

утворенням альдегідних груп.

Розроблені методи одержання імуноферментних кон’югатів

з βгалактозідазою, що містить до 20 SHгруп. Вони базуються

на тому, що зв’язування через них антигенів не відображається

на каталітичних функціях ферменту.

Враховуючи те, що ферменти з великою молекулярною ма

сою можуть інгібувати реакцію антигенантитіло за рахунок

стеричного екранування антигенних детермінант, у деяких ви

падках доцільно використовувати як мітки не цілу молекулу

ферменту, а пептид, який має специфічну активність. Такий

синтез здійснювався при одержанні кон’югата Fabфрагмента з

гемоктапептидом, що має пероксидазну активність.

Ковалентні методи одержання імуноферментних кон’югатів

широко розповсюджені, однак у деяких випадках дія зшиваючо

го реагента негативно впливає на ферментативну та імунологіч

ну активність компонентів гібридної макромолекули.

У зв’язку з цим певний інтерес викликають імунологічні ме

тоди введення ферментної мітки – це метод «гібридних антитіл».

Гібридомна технологія відкриває принципово новий шлях одер

жання гібридних антитіл. Він полягає в тому, що зливаються мо

ноклональні клітини, специфічні проти даного антигену і фер

ментумаркера, в результаті чого утворюються гібридоми другого

покоління, які синтезують антитіла з двома специфічностями.

Розділення вільних і зв’язаних маркерів

Одним із важливих моментів у проведенні імунофермент

ного аналізу є розділення вільних і зв’язаних з антитілами міче

них компонентів. Найбільш розповсюдженим є метод, заснова

ний на іммобілізації антитіл на твердій підкладці (стінки

полістирольних пробірок або кульок, целюлозні диски, гранули

макропористих носіїв для хроматографії). Особливо перспек

тивними є полістиролові пробірки або планшети, що містять 96

лунок. Суть методів розділення полягає в тому, що одні з ком

понентів, наприклад, антитіла, можуть бути сорбційно іммобілі

зовані на поверхні вимірювальної кювети. Після проведення ін

кубації зі зразком антиген сорбується на поверхні, а всі інші

компоненти залишаються в розчині і можуть легко відділятися,

наприклад, за допомогою пористих частин під дією магнітного

поля. Основні проблеми, які виникають при реалізації твердофа

зових методів розділення, є стандартизація поверхні і зменшен

ня неспецифічного зв’язування мічених компонентів з носієм.

Інший шлях розділення мічених і немічених компонентів

грунтується на принципі модуляції активності ферментів анти

тілами. При взаємодії антитіл з гаптеном, «пришитим» поблизу

активного центру ферменту, відбувається повне інгібування йо

го активності. При додаванні до такої системи вільного гаптена

відбувається дисоціація комплексу, в результаті чого актив

ність ферменту відновлюється (рис. 9.4, рівняння 4, 5):

Е – Г + Аb Е – Г – Аb P, (4)

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

266

Е – Г – Аb + Г Е – Г + Г – Аb Р, (5)

де: Е–Г – комплекс ферменту (Е) з гаптеном (Г);

Аb – антитіло;

S – субстрат;

Р – продукт ферментативної реакції.

Ці методи одержали назву гомогенного аналізу.

Методи імуноферментного аналізу (ІФА)

Методи ІФА поділяються на дві великі групи: твердофазові

і гомогенні.

При твердофазових методах, які одержали назву ELISA

(enzyme linced immunosorbent assy), використовується принцип

іммобілізації одного із компонентів (антигену Аg або антитіла

Аb) на твердому носії (підкладці) шляхом гідрофобної, електро

статичної взаємодії. Як носій найчастіше використовують полі

мерний матеріал. Речовина, що визначається (антитіло чи анти

ген), відповідно конкурує з аналогічними речовинами, в які

введений ферментмаркер, за зв’язування на сорбенті:

|| – Ab + Ag + AgE ||– Ab + AgE + Ag + AgE.

Після видалення речовин, які не прореагували, визначаєть

ся концентрація ферменту, що зв’язався з носієм.

У системах твердофазового імуноферментного аналізу

(ELISA) антигенів (рис. 9.5) можна виділити декілька основних

методів (варіантів).

1. Прямий конкурентний метод – антитіла, іммобілізовані на

твердій фазі (носії), а мічений і немічений антигени, додані од

ночасно, конкурують один з одним за зв’язування (рис. 9.5, а).

2. Метод послідовного насичення – спочатку з антитілами ін

кубують зразок, а потім після видалення компонентів, які не

зв’язалися, додають мічений антиген. Використовується у

випадку, коли досліджуваний зразок може впливати на мар

кер, або якщо константи зв’язування обох компонентів з ан

титілами різні (рис. 9.5, б).

3. Метод інгібування з використанням подвійних антитіл. Ба

зується на конкуренції вільних антитіл з антигеном, який по

передньо іммобілізований на носії, і антигеном, що визнача

ється і знаходиться у розчині (рис. 9.5, в).

Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі

267

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

268

Рис. 9.4. Принципові схеми гомогенних методів імуноферментного

аналізу (за Березіним І.В. та ін., 1987):

а–Г — вільний гаптен; Е–Г — мічений ферментом гаптен; Аb — антитіла;

S і Р — субстрат і продукт ферментної реакції; б — Аg–S — мічений

субстратом антиген; Аg — вільний антиген; Е — фермент; Р — продукт

ферментної реакції; символ х — інгібування ферментної реакції.

Розділ9.Виористанняіммобілізованихферментіваналітичнійроботі

269

Рис. 9.5. Схеми конкурентних методів твердофазового аналізу

(за Березіним І.В. та ін., 1987):

a — прямий конкурентний метод; б — метод послідовного насичення;

в — метод інгібування з використанням подвійних антитіл;

— Аb і — Аg — антитіла і антигени, які адсорбовані на носії; Аg–Е і

Аg — мічений ферментом і вільний антиген; Аb–Е — другі антитіла, які

мічені ферментом; S і Р — субстрат і продукт ферментної реакції; стадії

І і II — інкубація з наступним відмиванням компонентів, що не зв'язалися;

стадія III — додавання субстрату і детекція ферментної активності.