Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія
Подождите немного. Документ загружается.
трупного матеріалу. Це суміш з декількох форм, тому викликає
у 30 % пацієнтів алергічні реакції. Існує також небезпека, що гі
пофізарний матеріал заражений вірусами, що повільно розвива
ються, внаслідок чого діти, які отримували препарат, потребу
вали тривалого медичного спостереження.
Соматотропін, одержаний біотехнологічним методом за до
помогою технологій рекомбінантних ДНК, має переваги над
традиційно отриманим гормоном: він доступний у великих
кількостях; його препарати є біохімічно чистими і вільними від
вірусних забруднень. Використання біотехнологічного сомато
тропіну значно знижує вартість лікування хворих дітей. Згідно
з статистичними даними у 1990 р. вартість 1 міжнародної оди
ниці гормону знизилася від 15 до 5 доларів США.
12.3.1. Використання генно<інженерного соматотропіну
у тваринництві
Після виділення гена соматотропіну людини були одержані
кДНКкопії цього гена багатьох сільськогосподарських тварин
(великої рогатої худоби, овець, свиней, курей) та здійснено їх
клонування й експресія в клітинах E.coli та інших мікроорганіз
мів. Для деяких соматотропних гормонів сконструйовані шта
мисуперпродуценти (Ніколайчук В.І., Горбатенко І.В., 1999).
Сьогодні соматотропін використовується у тваринництві
для підвищення ефективності молочної і м’ясної продук
тивності сільськогосподарських тварин. Як показали дослі
дження, соматотропін великої рогатої худоби бактеріального
походження стимулює лактацію у молочних корів так само, як і
природний гормон, виділений з гіпофізу. За даними різних ав
торів як короткострокова ін’єкція соматотропіну (протягом 14
діб), так і його довгострокове введення тваринам (188 діб) ви
кликали стійке збільшення молочної продуктивності (за умови
щоденних ін’єкцій). При добових дозах соматотропіну від 13,5
до 40,5 мг на тварину вихід молока збільшувався від 10 до 50 %
залежно від дози препарату та умов утримання. На думку екс
пертів, при масштабному впровадженні цієї біотехнології в мо
лочному тваринництві можливо розраховувати на збільшення
надоїв в середньому від 23 до 31 %.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
320
Дослідження показали, що якість молока у корів, які трива
лий час отримували соматотропін, практично не відрізняється
від контрольних зразків і не містить помітної кількості введено
го гормону росту. Введення соматотропіну протягом півроку
негативно не впливає на інші фізіологічні, соматичні та етоло
гічні характеристики піддослідних тварин.
Позитивні результати одержані також при використанні
препаратів соматотропіну бактеріального походження в м’ясно
му тваринництві. Щоденні ін’єкції гормональних препаратів
молодняку великої рогатої худоби помітно стимулювали ріст та
формування м’язових тканин. Добові прирости живої маси за
лежно від виду тварин, умов утримання та дози гормону зміню
валися в межах 20–30 %, що сприяло скороченню часу нагулу
молодняка. Крім того, виявлено певне скорочення витрат кор
мів на одиницю приросту. У молодняка свиней та жуйних при
скорення росту та розвитку під впливом генноінженерного со
матотропіну супроводжувалося також збільшенням вмісту
білка і зменшенням вмісту жиру в тканинах, що помітно підви
щувало якість та товарну цінність м’ясопродуктів. Однак зміни
в метаболізмі, які відбуваються під дією екзогенного соматотро
піну, у різних видів тварин неоднакові. Так, деякі автори зазна
чають позитивний ефект ін’єкцій соматотропіну на динаміку
приростів у м’ясних овець, але при цьому жирові відкладення
не зменшуються. Інтенсивне введення соматотропіну тваринам
не супроводжується акумуляцією препарату в продуктах харчу
вання, що вигідно відрізняє соматотропін від стероїдних гор
монів та антибіотиків, які використовувалися з аналогічною
метою.
Необхідність щоденних ін’єкцій перешкоджає широкому
застосуванню соматотропіну в тваринництві, оскільки це приз
водить до ускладнення та подорожчання виробництва. Але
останнім часом успішно проводяться дослідження з розробки і
одержання таких форм гормональних препаратів, які в організ
мі утворюють депо тривалої дії, що дозволяє уникнути щоден
них ін’єкцій.
Розділ12.Біотехнолоіявиробництваормонів
321
Контрольні питання
1. Якими шляхами отримують гормони?
2. На чому базуються нові технології виробництва гормонів і їх
переваги над традиційними технологіями?
3. Які етапи включає технологія одержання гормонів за допо
могою рекомбінантних ДНК?
4. Яким шляхом отримуються гени гормонів?
5. Як відбувається клонування генів?
6. Біосинтез інсуліну, його будова і біологічна роль.
7. Отримання інсуліну традиційним методом, його недоліки.
8. Які існують нові технології одержання інсуліну?
9. Якими методами одержуть ген інсуліну?
10.Отримання рекомбінантного соматотропіну і його біологічна
роль.
11.Які є методи отримання соматотропіну?
12.Які переваги генноінженерного методу отримання сомато
тропіну?
13.Сфери застосування соматотропну.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
322
Розділ 13.
БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА
ІНТЕРФЕРОНІВ
Вперше інтерферон був отриманий у 1957 р. Айзексом і
Лінденманном у Національному інституті медичних дослі
джень в Англії. Дослідники виявили, що клітини тварин, які
піддалися впливу вірусу, виділяють у середовище фактор, який
здатний надавати свіжим, необробленим вірусом клітинам стій
кість до вірусної інфекції. Фактор перешкоджав (інтерферував)
розмноженню вірусів у клітині і отримав назву інтерферон. Це
відкриття сприяло успішній боротьбі з вірусними інфекціями.
Інтерферони — це білки, до складу поліпептидного лан
цюга яких входить 146–166 амінокислотних залишків. Вони
синтезуються клітинами хребетних у відповідь на вірусну ін
фекцію і забезпечують неспецифічний противірусний імунітет.
Біосинтез інтерферону як відповідь на проникнення вірусної
інфекції є однією з реакцій організму, яка найшвидше реалізу
ється і значно випереджає реакції імунної відповіді. Фактично
інтерферони є першою лінією оборони проти вірусної атаки. За
даними медичної статистики, серед інфекційних захворювань
майже 95 % становить вірусна патологія. Ветеринарна практика
підтверджує цю закономірність. Значний інтерес до препаратів
інтерферонів викликаний тим, що практичні медицина і ветери
нарія не мають достатньої кількості ефективних етіотропних за
собів профілактики і лікування вірусних інфекцій. Крім антиві
русної дії і посилюючого впливу на імунітет, інтерферони
гальмують розмноження аномальних клітин, і тому використо
вуються як протипухлинний засіб для лікування ракових хво
роб. Вони є імуномодуляторами і, виступаючи при цьому регу
ляторами імунологічних реакцій, проявляють антимікробну
властивість і радіозахисну дію. Визначено стимулюючий вплив
інтерферону на фагоцитоз і неспецифічну резистентність клі
тин. Загальна імунологічна реактивність організму, як правило,
відповідає рівню утворення інтерферонів. Під впливом інтерфе
ронів підвищується цитотоксичність кілерних клітин і збільшу
ється їх кількість.
Інтерферони є відносно нешкідливими для організму в кон
центраціях, які забезпечують лікувальний ефект, хоча механізм
дії інтерферонів і їхня біологічна роль ще недостатньо з’ясовані.
Інтерферон утворюється не тільки в організмі людини, але
й в багатьох інших хребетних. Але він має видову специфічність
і тому інтерферони тварин не вдається використовувати для лі
кування людини.
13.1. КЛАСИ І ТИПИ ІНТЕРФЕРОНІВ
Розрізняють три класи інтерферонів: лейкоцитарний
(αінтерферон), фібробластний (βінтерферон) та імунний
(
γінтерферон).
1)
αα
<інтерферон синтезується лейкоцитами під час дії на
них вірусу. Він має майже 20 рекомбінантних варіантів (А, В, С,
D, E, F... тощо), які відрізняються набором і послідовністю амі
нокислот у поліпептидному ланцюгу, а також біологічною ак
тивністю.
2)
ββ
<інтерферон утворюється фібробластами сполучної
тканини під впливом вірусу.
3)
γγ
<інтерферон – його біосинтез відбувається у сенсибілі
зованих Тлімфоцитах у відповідь на вплив мітогенів, бакте
ріальних і вірусних антигенів, антисироваток проти поверх
невих детермінант лімфоцитів. У β і
γінтерферонів рекомбі
нантних варіантів не виявлено.
Класи інтерферонів відрізняються структурою молекул, де
якими біологічними властивостями і типом клітин, які їх про
дукують в організмі. Так, клас βінтерферонів складається з де
кількох білків і число генів, які кодують ці білки, наближається
до 20;
γінтерферон представлений індивідуальним білком,
якому відповідає один ген. Поки що виділений один ген, який
відповідає βінтерферону людин, – це інтерферон β
1
. Цьому
білку відповідає практично вся противірусна активність, яка
виявляється після індукції фібробластів. β і
γінтерферони
зв’язані з залишками глюкози (гліколізовані), тоді як у αінтер
ферону не виявлено моноцукристих залишків.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
324
Крім трьох класів, розрізняють два типи інтерферонів. α і
βінтерферони належать до першого типу і є так званими віру
сіндукованими. Імунний, або γінтерферон, належить до друго
го типу, індукція біосинтезу якого забезпечується іншими речо
винами (білок Аентеротоксин стафілококів, антигени тощо).
13.2. ТРАДИЦІЙНІ ШЛЯХИ ОТРИМАННЯ
ІНТЕРФЕРОНІВ
Процес отримання інтерферону в основному однаковий для
всіх типів клітин, які вирощуються в культурі й утворюють ін
терферон. Клітини найчастіше заражають вірусом Сендай або
хвороби Ньюкасла і через 24 години центрифугують. Із надос
адової рідини одержують грубий препарат інтерферону, який
піддають очищенню.
Отримання
αα
<інтерферону. За сприяння організації Між
народного Червоного Хреста у Фінляндії було налагоджено
виробництво і випробування препаратів αінтерферону, який
отримували із лейкоцитів донорської крові. Як індуктор вико
ристовували вірус Сендай або вірус хвороби Ньюкасла. Але
ефективність виробництва інтерферону шляхом простого виді
лення дуже низька. Із 250 л крові (її можна отримати від
500–1000 донорів) одержують 0,25–0,5 мг чистого αінтерферо
ну, якого достатньо для лікування 50 чоловік при легкій формі
захворювання і лише однієї людини при важкій формі.
Технологія виробництва інтерферонів з лейкоцитів крові
набула розповсюдження, але вона не могла повністю задоволь
нити потребу в цьому препараті через недоліки: поперше, це
обмеженість сировинних ресурсів (донорської крові); подруге,
нормальні, тобто неракові лейкоцити не вдається культивувати,
внаслідок чого масове виробництво інтерферонів заскладне; по
третє, чистота кінцевого продукту незадовільна, тому що отри
мується суміш αінтерферонів; почетверте, висока собівартість
виробленого продукту.
Вченими Франції й Ізраїлю розроблена установка для виді
лення інтерферону з лейкоцитів людей, хворих на хронічний
мієлоїдний лейкоз і оброблених вірусом Сендай. В результаті
Розділ13.Біотехнолоіявиробництваінтерферонів
325
вихід інтерферону був значно вищий, ніж при використанні
нормальних лейкоцитів. Однак через те, що метод грунтується
на культивуванні ракових клітин, сфера використання одержа
ного інтерферону обмежена.
Фібробластний інтерферон (βінтерферон) синтезується
фібробластами (клітинами сполучної тканини), які одержують
із тканин плода або з матеріалу передньої плоті при обрізанні
немовлят, після обробки їх вірусом Сендай.
Фібробласти можна культивувати, тому вони придатні для
масового виробництва інтерферону. Це простіше, ніж отриму
вати його з лейкоцитів. Але метод має недоліки: у ємностях з
культурою фібробласти утворюють плівку товщиною в одну
клітину, що обмежує вихід інтерферону. Його вдається підви
щити введенням в культуральне середовище мікроскопічних
гранул, до яких приєднуються клітини.
Із культури фібробластів вихід βінтерферону вищий, але
теж дорогий. У зв’язку з тим, що при ракових захворюваннях
ефективні тільки підвищені дози інтерферону, за даними аме
риканських дослідників, лікування одного ракового хворого ін
терфероном коштує 20–40 тис. доларів.
Імунний, або
γγ
<інтерферон синтезується Тлімфоцитами.
Його утворення індукується багатьма речовинами. В Техаському
університеті шляхом стимуляції лімфоцитів білком А (ентеро
токсином) стафілококів одержали вихід в 1000 одиниць γінтер
ферону на 1 млн клітин. Англійська фірма «Велкам» одержувала
інтерферон із лімфобластоїдних клітин, взятих у новонародже
них хом’ячків. В США одержували інтерферон з культури лім
фоцитів донорської крові, стимульованих мітотичним агентом.
В цілому жоден метод одержання інтерферонів усіх трьох
класів не міг задовольнити попиту через низький вихід продук
тів; їх високу вартість (вартість промислового одержання сягає
40–50 дол. за 1 млн одиниць), а чистота препаратів недостатня.
Тому в усіх країнах розпочалися роботи, спрямовані на за
стосування методів генетичної інженерії для виробництва від
носно дешевого інтерферону в кількостях, які давали б змогу за
довольнити попит на нього з боку органів охорони здоров’я,
ветеринарної медицини і тваринництва.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
326
13.3. ГЕННО<ІНЖЕНЕРНИЙ МЕТОД ОТРИМАННЯ
ІНТЕРФЕРОНІВ
Розробка біотехнології виробництва інтерферону складний
і багатоетапний процес. Досліди з перенесення генів інтерферо
нів людини в бактеріальні клітини були розпочаті наприкінці
1977 — на початку 1978 рр. майже одночасно групами дослідни
ків у Швейцарії, Японії, США, а також у Радянському Союзі.
Але на початок досліджень не було відомостей про структуру
білка (інтерферону), що не давало змоги отримати ген шляхом
хімічного синтезу. Крім цього, в суміші іРНК (мРНК), які коду
ють різні білки, частка інтерферонової мРНК невелика — при
близно 0,1 %, що ускладнювало роботу з її виділенняя. Для кло
нування гена інтерферону усі дослідники користувалися
методом зворотної транскрипції мРНК інтерферону. За корот
кий проміжок часу (1979–1982 рр.) гени лейкоцитарних, фібро
бластного й імунного інтерферонів були клоновані в E. сoli. Бу
ла отримана достатня інформація про структуру інтерферонів
та їх генів. Встановлено, що інтерферони синтезуються на пер
шій стадії у вигляді попередників, що містять на N–кінці полі
пептидного ланцюга сигнальний пептид, який потім відщеплю
ється і в результаті утворюється зрілий інтерферон, котрий
наділений повною біологічною активністю.
Першим був клонований ген фібробластного інтерферону у
складі гібридної плазміди в клітинах E. coli (Японія) у 1979 р.
Визначення нуклеотидної послідовності показало, що βінтер
ферон синтезується в клітині у вигляді поліпептиду розміром
у 187 амінокислот – преінтерферону. У процесі секреції преін
терферону з клітини від нього відщеплюється сигнальний пеп
тид, який складається з 21 амінокислоти. Зрілий βінтерферон
містить 166 амінокислот.
У 1980 і 1982 рр. були клоновані гени α і
γінтерферонів.
Довжина поліпептидного ланцюга проінтерферонів складає
відповідно 189 і 166 амінокислотних залишків, а зрілі інтерфе
рони – 166 і 146 амінокислот. Сигнальний пептид містить від
повідно 23 і 20 амінокислот.
У колишньому Радянському Союзі перше успішне клону
вання гена лейкоцитарного інтерферону було здійснено у 1982 р.
Розділ13.Біотехнолоіявиробництваінтерферонів
327
(Овчінніков Ю.А. і ін.), фібробластного – у 1983 р. (Козлов Ю.І.
та ін.) та імунного – у 1985 р. (Свердлов Є.Д. і ін.).
Конструювання штамів<продуцентів інтерферо<
нів. Технологія одержання генів. Це дуже складний і бага
тоетапний процес. Найчастіше ген інтерферонів отримують
шляхом зворотної транскрипції – передачі інформації від
структури мРНК до структури ДНК (рис. 13.1). Виділену із до
норської крові суспензію лейкоцитів обробляють вірусом Сен
дай, який індукує біосинтез інтерферонів. В них видаляють
іРНК, яка несе інформацію (кодує) про синтез інтерферонів. За
допомогою ферментів зворотної транскрипції – ревертази або
зворотної транскриптази на основі матриці іРНК синтезується
комплементарна щодо неї копія ДНК (кДНК) одноланцюгова.
Утворюється комплекс ДНК–РНК. На наступному етапі одно
ланцюгову кДНК відділяють від структури ДНК–РНК і на ній
здійснюють синтез другої комплементарної нитки ДНК. Одер
жують дволанцюгову ДНК (ген). Щоб забезпечити у синтезова
ній кДНК комплементарність липких кінців, до них приєдну
ють лінкери (перехідники), які є синтезованими хімічним
шляхом ділянками ДНК, що мають липкі кінці.
Ген виділеного інтерферону, крім структурного гена, вклю
чає промоторну ділянку, оператор і ділянку зв’язування рибосо
ми (ініціації синтезу білка) і складається майже з 1,2 тис. нук
леотидів.
У колишньому Радянському Союзі і в Англії труднощі ви
ділення гена інтерферону були подолані іншим шляхом. Ген ін
терферону синтезували хімічним шляхом, приєднуючи один
нуклеотид за іншим. Велику молекулу такого штучного гена,
який складається з 514 нуклеотидів, збирали з 8 окремо синте
зованих фрагментів. Ця робота зайняла стільки ж часу, скільки
виділення гена інтерферону.
Гени αінтерферонів можуть бути безпосередньо вилучені
із геному людини, тому що вони не містять інтронів.
Експресія генів інтерферонів у клітинах. Для
одержання значних кількостей гомогенних препаратів інтерфе
рону, необхідних для широкого клінічного застосування та нау
кових досліджень, було здійснено численні і успішні спроби
створення штамівпродуцентів на базі різних мікроорганізмів.
ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії
328
Розділ13.Біотехнолоіявиробництваінтерферонів
329
Рис. 13.1. Схема клонування генів інтерферону людини
(за Дебабовим В.Г. і Лівшіцом В.А., 1988)