Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

рН-ЗАВИСИМОСТЬ

СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ

181

чение

р/Са,

равное

р/С

свободного фермента.

За

исключением

единственного случая,

это

предсказание теории подтверждается.

При

25°С

концентрации соли 0,1 М

рК

активного центра

химотрипсина равно 6,80

0,03. Наиболее точные эксперимен-

тальные данные очень хорошо совпадают

теоретическими кри-

выми ионизации

диапазоне

рН 5—8

после внесения поправки

на

долю фермента, находящегося

неактивной конформации.

Это соотношение справедливо

для

гидролиза амидов,

где не

происходит накопления промежуточных соединений

выполня-

ется механизм Михаэлиса

—

Ментен,

также

для

гидролиза

эфиров,

где

накапливается ацилфермент (табл.

5.3 и

рис.

5.5 и

5.6).

Таблица

5.3

рК

активного центра химотрипсина

Субстрат

cat

Источник

данных

)

Аланинамид

ацетил-Ь-фенилаланина

Семикарбазид

формил-Ь-фениланина

)

я-Ацетиланилид

ацетил-Ь-тирозина

)

га-Нитрофенилацетат

)

Этиловый

эфир

ацетил-Ь-фенилалани-

на

)

/г-Ацетиланилид

ацетил-Ь-тирозина

n-Нитрофениловый

эфир

ацетил-Ь-три-

птофана

)

6,80

6,84

6,77

6,85

6,8

6,83

6,50

6,6

6,32

6,85

6,9

—Fersht

R., Renard M., Biochemistry,

13,

1416 (1974).

2—Bender H.

L.,

Clement G. E., Kezdy F.

J.,

Heck H.

d'A., J. Am.

Chem. Cos.,

3680

(1964).

3—Hammond

R., Gutfreund

H.,

Biochem.

J.,

61,

187

(1955).

4—Renard M.. Fersht

R., Biochemistry,

12,

4713 (1973).

а-Химотрипсин.

25 °C,

ионная сила

0,1.

6-Химотрипсин,

"С, ионная сила

0,95.

б.

л-Нитрофениловый

эфир

ацетил-Ь-триптофана:

механизм

Бриггса

—

Холдейна

изменением

природы

лимитирующей

стадии

при

варьировании

рН

Исключение,

котором упоминалось выше,— это рН-зависи-

мость fccat/Ям

для

гидролиза n-нитрофенилового эфира

аце-

тил-Ь-триптофана.

этом

случае

кажущийся

p/G

свободного

фермента равен

6,50.

Причина такого низкого значения

р/С

была рассмотрена

разд.

В.2. При

высоком

рН

стадия связьь

вания

субстрата

ферментом является отчасти лимитирующей.

182

ГЛАВА

Предельное значение

at/Km

при высоком

рН

равно

что близко

величине, характерной

для

лимитируемых диффу-

зией

частот столкновений фермента

субстрата. Однако

при

низких

рН

химические стадии замедляются

и по

мере протони-

рования

фермента

уменьшения

его

активности становятся

ли-

митирующими. Константа скорости

для

стадии связывания,

ко-

торую

можно рассчитать из уравнения (5.31), равна

lCFM-'c-

Эти данные находятся

соответствии

со

схемой

(5.35)

значением

р/С

= 6,8

для

активного центра

17].

6-10

М-'с~'

Ac-TrpONPh

Ac-TrpONPh-E

6-Ю

с"

Ас-Тгр-Е

(5.35)

|б5с-

Ас-Тгр

+ Е

(Е

—

химотрипсин).

Это редкий случай, когда анализ стационарной кинетики

позволяет получить константы скорости

для

ряда конкретных

стадий реакции.

в.

Фермент-субстратный

комплекс

р/Са

фермент-субстратного комплекса

не

является величиной

постоянной,

как в

случае

свободного фермента, поскольку

свя-

зывание субстратов изменяет

активного центра. Значение

р/Са,

полученное

из

рН-зависимости

для

гидролиза амидов,

колеблется

пределах

6—7.

Соответственно значение

Км

возра-

стает при низком

рН

согласии

уравнением (5.16).

Точное определение р/С

фермент-субстратного комплекса

из

рН-зависимости

/См

затруднено

по

двум

причинам. Во-первых,

изменение

/См относительно невелико

требуется высокая

точ-

ность при получении данных. Во-вторых, необходимо определить

две области плато:

при

низком и при высоком значениях рН. Это

означает,

что

измерение нужно проводить

более широком

диапазоне

рН, чем при

определении ftcat

или

\IKm,

а при

этом возникает опасность появления нежелательных эффектов,

обусловленных ионизацией

других

групп.

г.

Ионизация

при

высоких

значениях

рН [11]

Высокое значение

р/Са

обусловлено

не

зависящим

от суб-

страта изменением конформации фермента, которое можно

вы-

явить

физическими методами, например сняв спектры кругового

рН-ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ

183

дихроизма или определив квантовый

выход

флуоресценции. Ки-

нетические измерения

дают

такое же значение р/С

, как и эти

методы.

Рис.

5.7. Увеличение /См при низких рН для катализируемого химотрипсином

гидролиза Ы-формил-Ь-фенилаланинсемикарбазида (/) и формилгидразида

(//), связанное с тем, что рК* фермент-субстратного комплекса ниже рКа

свободного фермента [8].

Ж.

Прямое

титрование

групп

ферментах

Существует несколько методов прямого титрования опреде-

ленных ионизирующихся боковых цепей в белках. Одна из ос-

новных проблем заключается в идентификации данной группы.

Влияние

O на

pH/pD

и р/С

Во многих спектроскопических методах в качестве раствори-

теля вместо НгО используют D

O, что позволяет разделить

нужный сигнал и сигналы, обусловленные растворителем.

Экспериментально установлено, что pD, измеренный стеклянным

электродом, на 0,4 единицы ниже рН:

= pD + 0,4.

(5.36)

184

ГЛАВА

рН

в смеси Н

0 и D

0, измеренный стеклянным электродом,

определяется соотношением [12]

рН

= pD +

0,3139а

0,0854а

(5.37)

где а — относительное содержание дейтерия, т. е. [D]/([D]-f

[Н]). Однако в растворе Е>

0 и в смеси D2O/H2O значение р/С

выше,

чем в водном растворе. Иногда увеличение р/Са компен-

сирует уменьшение показаний прибора со стеклянным электро-

дом, и значение р/Са, измеренное в D

O, становится равным

истинному р/Са соединения в водном растворе. Влияние раство-

рителя на константу ионизации непостоянно; недооценка этого

факта

может привести к ошибке в несколько десятых единиц

рН.

2. Методы

а. Ядерный магнитный резонанс: гистидиновые остатки [13]

Метод ЯМР особенно ценен для определения р/Са гистидино-

вых остатков в белках. Сигналы от протонов при углеродных

атомах С-2 и С-4 сдвинуты в слабопольную область по

отношению к сигналам от остальных атомов данной белковой

молекулы и

могут

быть разрешены в растворах D

O. При прото-

нировании

происходит изменение величины химического сдвига

и,

следовательно, гистидиновые группы можно легко оттитро-

вать. Когда в белке присутствует более чем один гистидиновый

остаток, возникают трудности, связанные с идентификацией от-

дельных р/Са. Решить эту

задачу

для рибонуклеазы помогли

химическая модификация, избирательное дейтерирование и вы-

яснение

кристаллической структуры данного фермента; в насто-

ящее время идентифицированы р/С

всех

четырех гистидиновых

остатков рибонуклеазы 114, 15].

Сигнал

ЯМР протонов,

участвующих

в образовании водо-

родных связей, может быть сдвинут в слабопольную область

настолько сильно, что его удается зарегистрировать в растворе

О.

Обнаружено, что в химотрипсиногене, химотрипсине и

других

сериновых протеазах

между

Asp-102

и His-57 находится

протон,

и установлено, что он титруется с р/Са = 7,5 [16] (хотя

этот рДа относится к диссоциации протона, связанного с другим

атомом азота имидазольного кольца);

/о:

Одна из сериновых протеаз, а-литическая протеаза, которая,

как

полагают, имеет в активном центре аналогичную

«систему

рН-ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ 185

переносом заряда», содержит только один гистидин. Измерение

величины химического сдвига для

С, который включен в

С-2-положение,

дает

р/С

= 6,7. Однако в отличие от модельных

соединений

константа взаимодействия

между

этим атомом уг-

лерода и связанным с ним протоном не изменяется при измене-

нии

рН. По-видимому, группа, титрующаяся с р/С

= 6,7, при-

надлежит

Asp-102,

а не гистидину, как всегда предполагалось

[17]. Этот вывод подтверждается данными титрования кар-

боксильной

группы с помощью ИК-спектроскопии (см. ниже)

[18].

/ОН.

Чо

ЯМР-спектроскопия

на ядрах

С позволяет определить р/С

остатков лизина и аспартата. Ионизация остатков тирозина

исследовалась с помощью ПМР.

б. ИК-спектроскопия [18, 20, 21]

Карбоксильные

группы поглощают электромагнитные волны

с частотой ~1710 см~', а карбоксилаты — с частотой 1570 см~'.

Разностные

ИК-спектры, снятые в D

O, позволили определить

р/Са

необычных карбоксильных групп а-лактоглобулина (7,5),

лизоцима

(2,0; 6,5) и трипсина

(Asp-102;

7).

в.

Разностная УФ-спектроскопия [22, 23]

Разностная

УФ-спектроскопия часто используется при иссле-

довании ионизации фенольного гидроксила тирозиновых остат-

ков,

а также при изучении свойств сульфгидрильных групп

цистеина

и имидазольных групп гистидина.

г. Флуоресцентный анализ [22, 24]

Этот метод весьма полезен в тех

случаях,

когда при иониза^

ции

группы изменяется спектр флуоресценции соседнего с ней

триптофана

— главного флуоресцирующего остатка в белках,

или

происходит конформационное изменение в белковой моле-

куле, изменяющее спектр флуоресценции белка в целом. В от-

сутствие триптофана (который обладает относительно сильной

флуоресценцией) можно следить за флуоресценцией тирозина.

д. Разностное титрование [25]

Прямое

титрование белка кислотой или основанием обычно

дает

не поддающуюся интерпретации кривую ионизации из-за

перекрывания,

обусловленного титрованием большого числа

186

ГЛАВА

групп. Однако, сравнивая кривые титрования фермента до и

после блокирования определенной группы, удается выделить

одну или две ионизирующиеся группы. Например,

Asp-52

лизо-

цима

можно специфически этерифицировать триэтоксифторбо-

ратом. Сравнение кривых титрования модифицированного и на-

тивного белка не только

дает

р/С

Asp-52,

но и позволяет выявить

влияние

ионизации этой группы на свойства

другой

важной

кислоты,

входящей в состав активного центра,— Glu-35.

е. Разностное

титрование

переводом

фермента

денатурированное

состояние

[26]

Определить с помощью титрования состояние ионизации на-

ходящегося в глубине белковой глобулы остатка (например,

Asp-102

в химотрипсине и химотрипсиногене) практически

невозможно.

Из-за высоких фоновых концентраций гидроксил-

ионов

и протонов точное титрование удается осуществить только

диапазоне рН от 3 до 11. В связи с этим с помощью суммарной

кривой

титрования нельзя выявить ионизацию групп белка с

аномальными

р/С

. Например, в химотрипсине имеются три кар-

боксильные группы с аномально низкими р/С

— они находятся

ионизированной форме при рН < 3. Однако когда белок дена-

турирован, эти группы титруются нормально, а число титрую-

щихся карбоксильных групп в денатурированном белке можно

легко определить. Ионизация

Asp-102

химотрипсина и химо-

трипсиногена при варьировании рН была установлена путем из-

мерения

числа поглощенных протонов при денатурации и сопо-

ставления полученного результата с числом ионизированных

карбоксильных групп в этих денатурированных белках. Для

повышения

точности большинство расположенных на поверхно-

сти карбоксильных групп было превращено в амиды, чтобы

уменьшать число ионизирующихся групп.

ж.

Химическая

модификация

Значения

р/С

аминокислотных остатков активного центра

свободного фермента и комплекса фермента с ингибитором на-

ходят

по результатам измерения скорости необратимого инги-

бирования

ферментов точно так же, как и в

случае

обычной

ферментативной кинетики. р/С

других

остатков определяют из

рН-зависимости

скорости реакций этих соединений с различны-

ми

реагентами. Например, поскольку амины, находясь в форме

основания,

реагируют с уксусным ангидридом [27] или динит-

рофторбензолом 128—30], степень их ионизации определяется

из

относительных скоростей реакций при разных рН. Этот под-

ход был использован для определения р/Са аминогрупп в белках.

рН-ЗАВИСИМОСТЬ

СКОРОСТИ

ФЕРМЕНТАТИВНЫХ

РЕАКЦИЙ

187

Аминогруппы модифицировали реагентами, меченными радио-

активными

изотопами, затем белок гидролизовали, разделяли

пептиды и измеряли их

удельную

радиоактивность. Таким спо-

собом можно найти р/С

нескольких групп одновременно, что и

было сделано для эластазы и химотрипсина.

В видоизмененном варианте этого метода измеряется ско-

рость обмена трития (из Т

О) с протоном, связанным с

С-2-атомом имидазольного кольца гистидина [18, 31, 32]. Кон-

станта скорости обмена зависит от состояния ионизации имида-

зола и является более высокой для непротонированной формы.

Описанный

метод дополняет метод ЯМР, который также позво-

ляет измерять р/Са гистидина. Эти эксперименты весьма трудо-

емки,

однако с их помощью можно однозначно идентифициро-

вать р/Са.

3. Влияние температуры, полярности растворителя

ионной силы на рК

групп,

находящихся в составе фермента и в растворе

Полярные

растворители стабилизируют ионы — электроста-

тические диполи растворителя взаимодействуют непосредствен-

но

с ионами, а увеличение диэлектрической проницаемости сре-

ды уменьшает тенденцию этих ионов к реассоциации. Ионизация

нейтральной кислоты НА [уравнение

(5.38)]

при добавлении к

водному раствору слабо полярного растворителя подавляется

(табл. 5.4).

НА

= А" + Н

(5.38)

Таблица

5.4

Влияние органических растворителей на рК

при 25 °С*)

Циоксан,

Р*а

уксусная

кислота

4,76

5,29

6,31

8,34

трис

8,0

бензоиларгинин

3,34

4,59

4,60

глицин

-СО

2,35

2,63

3,11

3,96

-NH

9,78

9,29

8,49

7,42

)

Harned

H. S.,

Owen

В. В., The

physical

chemistry

electrolytic

solution,

Relnhold,

New

York,

755-6

(1958);

Inagami

Т.,

Sturtevant

J. M.,

Blochim.

Blophys.

Acta,

38, 64

(1960).

> (HOCH

)

CNH

188

ГЛАВА

другой

стороны, ионизация кислоты, несущей положительный

заряд

(ВН+),

нечувствительна к полярности растворителя, по-

скольку в равновесии не происходит изменения заряда.

вн

= в + н

(5.39)

Исследование влияния полярности растворителя на р/С

группы, связанной с ферментом, не позволяет с определенностью

ответить на вопрос, какая кислота ионизируется — нейтральная

или

несущая положительный заряд. Частично погруженная

вглубь

белковой глобулы кислотная группа экранирована от

растворителя, и более существенным может оказаться электро-

статическое взаимодействие с другим группами белка. Напри-

мер,

р/Са ацилфермента, образованного бензоиларгинином и

трипсином,

почти не изменяется в смеси диоксан/вода в диапа-

зоне

концентрации диоксана от 0 до 50% и лишь слегка возра-

стает, когда концентрация достигает 88% [33]. Казалось бы, это

должно соответствовать кислоте, несущей положительный заряд

(например,

ионизирующемуся имидазолу), поскольку в этих

условиях рКа уксусной кислоты увеличивается приблизительно

на

6 единиц, однако результаты исследований методами ЯМР- и

ИК-спектроскопии

указывают на то, что ионизируется карбок-

сильная

группа

Asp-102

[17, 18].

Аналогичным образом, хотя увеличение ионной силы приво-

дит к снижению р/Са карбоксильных групп в растворе, р/С

Asp-52

и Glu-35 в лизоциме при увеличении ионной силы возра-

стает вследствие оказываемого ею влияния на поверхностный

заряд белка 125].

Энтальпия

ионизации имидазольных групп в растворе со-

ставляет ~30 кДж-моль-

(7 ккал-моль"-

тогда

как для кар-

боксильных групп эта величина пренебрежимо мала.

Следует

иметь в

виду,

что на энтальпию ионизации оказывает большое

влияние

изменение энтальпии образующих сольватную оболочку

молекул воды, поэтому данные, полученные для раствора, нель-

зя

прямо переносить на случай частично погруженных в белко-

вую

глобулу

групп.

И.

Аномальные значения рК

в ферментах

Известно

много примеров, когда амины, находящиеся в фор-

ме основания, и карбоксильные группы в белках имеют ано-

мально высокий или низкий р/Са (табл. 5.5). Причины этого

явления

крайне просты и объясняются особенностями микроок-

ружения. Если карбоксильная группа, например, аспартата в

системе с переносом заряда ос-литической протеазы или химо-

трипсина

находится в среде с относительно низкой полярностью,

рН-ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

189

Таблица 5.5

Некоторые

аномальные

значения

рК

белковых групп

Фермент

Остаток

Лизоцим

Комплекс

лизоцима с гликолхитином

о-Литическая

протеаза

Ацетоацетатдекарбоксилаза

Химотрипсин

а-Лактоглобулин

Glu-35

Asp

Lys

(e-NH

)

Ile-16(a-NH

)

6,5 [25]

~ 8,2 [25]

6,7 [17]

5,9 [6]

10,0 [11]

7,5 [201

то ее р/Са

будет

повышен, поскольку в этих условиях анионная

форма

дестабилизируется. С другой стороны, если карбоксилат-

ион

образует ионную связь с аммоний-ионом, то он

будет

стаби-

лизироваться положительным зарядом и станет более кислым.

наоборот, если аминогруппа имеет неполярное окружение

(например,

аминогруппа лизина в ацетоацетатдекарбоксилазе),

то ее протонирование подавляется и р/Са понижается. Аммоний-

ион,

образующий в химотрипсине ионную связь с остатком

Ие-16,

стабилизируется отрицательным зарядом карбоксилат-

иона;

его депротонирование подавляется, и р/Са возрастает,

СПИСОК

ЛИТЕРАТУРЫ

1. Dixon M., Biochem. J., 55, 161 (1953).

Alberty

R. A., Massey V., Biochim. biophys. Acta, 13, 347 (1954).

Bender M. L, Clement G. £., Kezdy F. J., d'A Heck H., J. Am. chem. Soc,

86,

3680 (1964).

Fersht A. R., Requena Y., J. Am. Chem. Soc, 93, 7079 (1971).

Fastrez /., Fersht A. R., Biochemistry, 12, 1067 (1973).

6 Schmidt D. £., Jr., Westheimer F. H., Biochemistry, 10, 1249 (1971).

7. Renard M., Fersht A. R., Biochemistry, 12, 4713 (1973).

8. Fersht A. R., Renard M., Biochemistry, 13, 1416 (1974).

9. Edsall J. Т., Wyman J., Biophysical chemistry, Academic Press, New York,

510 (1958).

10. Kezdy F. J., Clement G. E., Bender M. L., J. Am. chem. Soc, 86, 3690

(1964).

11.

Fersht

A. R., J. molec. Biol., 64, 497 (1972) (см. также ссылки, приведен-

ные

в этой работе).

12.

Pentz L, Thornton E. R., J. Am. chem. Soc, 89, 6931 (1967).

13.

Markley J. L, Accts chem. Res., 8, 70 (1975).

14. Markley J L, Biochemistry, 14, 3546 (1975).

15.

Дудкин

С. М.,

Карпейский

М. Я-,

Сахаровыми

В. Г.,

Яковлев

Г. И., ДАН

СССР,

221, 740 (1975).

16. Robillard G., Shulman R. G, J. molec Biol., 86, 519 (1974).

17.

Hunkapiller M. W., Smallcombe S. H., Whitaker D. R., Richards J. H.,

Biochemistry, 12, 4732 (1973).

18.

Koeppe

R. E. II, Stroud R. M., Biochemistry, 16, 3450 (1976).

19.

Karplus S., Snyder G. H., Sykes B. D., Biochemistry, 12, 1323 (1973).

190

ГЛАВА

20. Susi Н., Zell Т., Timasheff S. N., Archs. Biochem. Biophys., 85, 437 (1959).

21.

Timasheff S. N.. Rupley J. A., Archs. Biochem. Biophys., 150, 318 (1972).

22.

Timasheff S. N.. The Enzymes, 2, 371 (1970).

23.

Gorbunoff

M. J., Biochemistry, 10, 250 (1971).

24.

Cowgill

R. W., Biochim. biophys. Acta, 94, 81 (1965).

25.

Parsons

S. M., Raftery M. A., Biochemistry, 41, 1623, 1630, 1633 (1972).

26.

Fersht

A. R.,

Sperling

L, J. molec. Biol., 74, 137 (1973).

27.

Kaplan H., Stephenson K. I., Hartley B. S., Biochem. J., 124, 289 (1971).

28.

Murdock A. L,

Grist

K. L, Hirs С. Н. W., Archs. Biochem. Biophys., 114,

375 (1966).

29.

Hill R. J., Davis R. W., J. biol.

Chem.,

242, 2005 (1967).

30. Cruickshank W. H., Kaplan H., Biochem. biophys. Res.

Commun.,

46, 2134

(1972).

31.

Matsuo H., Ohe M., Sakiyama F., Narita K-, J. Biochem., Tokyo, 72, 1057

(1972).

32.

Ohe M., Matsuo H., Sakiyama F., Narita K-, J. Biochem., Tokyo, 75, 1197

(1974).

33.

Inagami Т., Sturtevant J. M., Biochim. Biophys. Acta, 38, 64 (1960).