Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

Глава

ПРАКТИЧЕСКАЯ

КИНЕТИКА

Одним

из

необходимых условий проведения любого кинети-

ческого исследования является наличие

удобного

метода

изме-

рения

скорости образования продуктов

или

скорости

расходова-

ния

субстратов.

Для

проведения подобных измерений использу-

ются самые разные методы, начиная

таких классических

методов,

как

манометрический, вискозиметрический

поляри-

метрический,

кончая самыми современными

—

ЯМР

и ЭПР.

Однако наиболее широко применяются спектрофотометрия,

спектрофлуориметрия, автоматическое титрование,

также

ме-

тоды

использованием субстратов, меченных радиоактивными

изотопами.

этой

главе

мы не

будем

рассматривать

всех

имею-

щихся методов,

остановимся только

на

самых распространен-

ных,

да и то

ограничимся лишь областью

их

применения

практической стороной вопроса.

А. Кинетические методы

1. Спектрофотометрия

Многие соединения поглощают

свет

ультрафиолетовой

или

видимой областях спектра. Если интенсивность света, падающе-

го

на

раствор вещества, равна

/о,

интенсивность света, прошед-

шего через этот раствор,

— /, то

поглощение

равно

= lg

(У/).

(6.1)

Согласно

закону

Ламберта

—

Бэра,

А =

гс1,

(6.2)

где

е —

коэффициент

поглощения (или

экстинкции) данного

со-

единения,

—его

концентрация (обычно молярная),

— оп-

тический путь,

или

толщина образца

(в см).

Спектрофотометрический анализ особенно ценен

для

иссле-

дования природных хромофоров. Например, скорости реакций

192

ГЛАВА

участием многих дегидрогеназ можно измерить по скорости

появления

NADH, регистрируя поглощение света с К = 340 нм

(е = 6,23- Ю'М-'см"

), поскольку NAD в этой области не погло-

щает. Иногда в таких исследованиях используют искусственные

субстраты, например в реакциях с участием эстераз — п-нитро-

фениловые эфиры, так как n-нитрофенолят-ион имеет максимум

поглощения при Я = 400 нм (е=

1,8-10

М-

см-

Чувствительность метода зависит от коэффициента экстинк-

ции

соединения; для соединения с е = 10

М-

см-' предельное

его количество, которое еще можно определить, составляет

0,5 нмоль (имеется в виду обычный спектрофотометр, когда для

измерений необходимо по крайней мере 0,5 мл раствора, а по-

глощение должно составлять ~0,01).

Возможные

источники

ошибок

Чаще всего к ошибкам приводит невыполнение закона Лам-

берта^ Бэра. Такая ситуация возникает по ряду причин.

1. Концентрация хромофора настолько высока, что он агрегирует

или образует мицеллы; это сопровождается изменением

коэффи-

циента поглощения. 2. При высоком фоновом поглощении погло-

щается так много света, что проходящий через монохроматор

свет с другими длинами волн становится существенным («по-

бочный свет»). 3. Ширина щели монохроматора слишком вели-

ка,

и на образец попадает свет с длинами волн, лежащими вне

полосы поглощения хромофора. 4. Раствор мутный и рассеивает

свет.

2. Спектрофлуориметрия

Некоторые соединения способны поглощать свет, а затем

испускать его (но уже с большей длиной волны). Это явление

называется флуоресценцией. Эффективность процесса характе-

ризуется квантовым выходом q, который равен отношению числа

испускаемых квантов к числу поглощаемых (q всегда меньше

единицы).

К природным флуорофорам относится NADH, погло-

щающий свет с К = 340 нм, а испускающий — с к = 460 нм,

Основной флуорофор в белках — триптофан — поглощает в об-

ласти

275—295

нм, а испускает свет с % =

330—340

нм. Слабо

флуоресцирует в этой же области и тирозин. В основе многих

синтетических субстратов эстераз, фосфатаз, сульфатаз и гли-

козидаз лежит 4-метилумбеллиферон — сильно флуоресцирую-

щее производное фенола.

Теоретически спектрофлуориметрия примерно в 100 раз чув-

ствительнее спектрофотометрии. Флуоресценция измеряется под

ПРАКТИЧЕСКАЯ

КИНЕТИКА

193

прямым

углом

пучку падающего света. Изменение интенсив-

ности возбуждающего света, скажем,

на 5%

изменяет интенсив-

ность флуоресценции

на те

же5%. При спектрофотометрическом

анализе измеряются небольшие изменения интенсивности

про-

шедшего света,

здесь любые флуктуации

интенсивности

падающего света усиливаются; изменение

ее на 5%

эквивалент-

но

изменению поглощения

на 0,02

единицы.

Хотя интенсивность флуоресценции пропорциональна интен-

сивности возбуждающего света, невозможно

до

бесконечности

уменьшать концентрацию флуоресцирующего соединения,

ком-

пенсируя

это

уменьшение увеличением интенсивности возбуж-

дающего света.

Это

связано

наличием рассеяния света

— рэ-

леевского,

при

котором рассеянный свет имеет

ту же

длину

волны,

что и

падающий,

рамановского,

при

котором длина

волны рассеянного света

иная;

все это

существенно уменьшает

интенсивность падающего света. Кроме того,

при

высокой

ин-

тенсивности возбуждения исследуемое соединение может

под-

вергаться фотолизу.

Некоторые свойства

флуоресценции

Флуоресценция наблюдается

в том

случае, когда фотон

по-

глощается соединением (которое переходит

возбужденное

со-

стояние

временем жизни

~ 10 не), а

затем испускается

им.

Однако молекула, находящаяся

возбужденном состоянии,

может потерять свою энергию, столкнувшись

другой

молеку-

лой (например,

иодид-ионом)

или

передав энергию

другой

группе

той же

молекулы.

таких случаях говорят,

что про-

изошло

тушение

флуоресценции.

Исследование тушения флуо-

ресценции триптофана

составе белка

при

связывании субстра-

тов является весьма ценным способом оценки степени связыва-

ния.

Интенсивность флуоресценции может

не

только умень-

шаться,

но и

увеличиваться. Например, соединение, лишь слабо

флуоресцирующее

водном растворе, зачастую интенсивно

флуоресцирует

при

переносе

неполярную

среду.

Таким свой-

ством обладают, например, красители толуидин-

нафталин-

сульфоновые кислоты

— при

связывании

гидрофобных карма-

нах белков

они

начинают сильно флуоресцировать. Интересно,

что, если

эти

красители связываются

молекуле белка рядом

триптофановым остатком,

они

могут

возбуждаться светом,

по-

глощенным триптофаном,

т. е.

светом

с к =

275—295

нм, в ре-

зультате

переноса энергии

триптофана

на

краситель.

воде

триптофан

NADH флуоресцируют слабо, однако

их

флуорес-

ценция

усиливается, когда

они

находятся

неполярных обла-

стях молекулы белка.

При

возбуждении небольших молекул плоскополяризован-

194

ГЛАВА

ным

светом испускается неполяризованный свет, поскольку в

растворе эти молекулы непрерывно вращаются, причем время

вращательной релаксации значительно меньше времени жизни

возбужденного состояния. Однако крупные молекулы вращают-

ся

медленно. Согласно эмпирическому правилу, время враща-

тельной релаксации в наносекундах приблизительно равно мо-

лекулярному

весу

в тысячах дальтон (химотрипсин с мол. весом

25 000 имеет время вращательной релаксации около 20 не).

Свет, испускаемый группами, которые являются частью молеку-

лы белка или связаны с ней,

будет

частично плоскополяризован-

ным,

если они вращаются с такой же скоростью, как и вся мо-

лекула. Данное свойство можно использовать для изучения по-

движности различных групп.

Возможные

источники

ошибок

Обычно источником ошибок является тушение флуоресцен-

ции.

Оно может быть обусловлено попаданием в раствор посто-

ронних

примесей (например, иодида калия), но чаще всего имеет

место

концентрационное

тушение,

наблюдающееся в том случае,

когда флуорофор или лиганд сильно поглощают свет и умень-

шают интенсивность возбуждающего или испускаемого света.

Так,

если поглощение раствора равно А, то средняя интенсив-

ность возбуждающего света в кювете

будет

[согласно урав-

нению

(6.1)] равна

7=/

Ю""'

. (6.3)

Истинную

интенсивность флуоресценции можно вычислить, ис-

ходя или из этого уравнения, или из более сложного,

куда

введены соответствующие поправки, а также с помощью стан-

дартных кривых [1].

3. Автоматизированные спектрофотометрические

спектрофлуориметрические методы

Наиболее удобно проводить спектроскопический анализ в

том случае, когда продукты и реагенты имеют разные спектры и

могут

непосредственно регистрироваться; в этом

случае

дости-

гается и наивысшая точность. Методы, основанные на окраши-

вании

реакционной смеси с помощью специальных реагентов

(например,

окрашивание аминокислот нингидрином), можно

автоматизировать, используя насос, смешивающий реагенты в

требуемых

соотношениях и пропускающий раствор через ячейку

спектрофотометра или флуориметра (рис. 6.1). При этом иссле-

ПРАКТИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА

195

дования становятся менее трудоемкими,

получающиеся

дан-

ные—

значительно

более

воспроизводимыми

точными.

л».

-Вывод

з,

UXWJ

СФг-

Рис.

6.1.

Автоматическое устройство

для

анализа аминокислот, образующихся

ходе

реакции

окрашиваемых нингидрином. Перистальтический насос

(П)

смешивает нингидрин

(Н) с

гидразином

(Г) и

азотом.

(В

проточной трубке

образуются пузырьки азота

разделяют жидкость

на

несмешивающиеся

друг

другом последовательные участки.) Гидразин

нингидрин интенсивно пере-

мешиваются

первом змеевике, образуя активный аналитический раствор.

Затем этот раствор смешивают

инкубируют

реакционной смесью

(PC)

змеевике

3\ при 95 °С в

течение

мин.,

результате чего смесь окраши-

вается. После охлаждения

до 25 °С в

змеевике

Зг

пузырьки азота удаляют

через специальное устройство

(Д),

реакционную смесь пропускают через

про-

точную ячейку спектрофотометра

(СФ) и

измеряют поглощение раствора.

Объем каждой порции смешиваемого раствора зависит

от

диаметра трубки.

Тот

же

перистальтический насос откачивает раствор

из

ячейки прибора.

Диа-

метр выводящей трубки существенно меньше суммы диаметров трубок, через

которые

все

компоненты смеси поступают

ячейку, поэтому часть раствора

пузырьки азота

силой выбрасываются через устройство

Д.

[Fersht

A. R.,

Renard

M.,

Biochemistry

13, 1416

(1974); Lenard

J.,

Johnson

L., Hyman R.

W.,

Hess

G. P.,

Anal. Biochem.,

11, 30

(1965),

изменениями.]

4. Использование сопряженных реакций

Реакции,

ходе

которых

не

образуются

окрашенные

или

флуоресцирующие соединения,

могут

быть

сопряжены

другими

ферментативными реакциями, позволяющими

получать

такие

соединения. Многие

из

этих реакций

идут

образованием

или

расходованием NADH. Образование

пирувата

можно связать

превращением NADH

в NAD с

помощью

лактатдегидрогеназы:

Лактатдегидрогеназа

Пируват

NADH

Лактат

NAD.

(6.4)

Образование

же АТР

можно связать

реакцией

(6.4) с по-

мощью пируваткиназы,

как

будет

показано ниже.

Для

определе-

ния

фосфофруктокиназы можно воспользоваться

следующей

196

ГЛАВА

совокупностью реакций:

Г6Р . ,АТР . .Pjr .- ""

•

Lac

FDP

)\ } \

NADH

NAE

*ADP

.VF.P

PFK

РК

(F6P

— фруктозо-6-фосфат, FDP — фруктозо-1,6-дифосфат,

Руг — пируват, PEP — фосфоенолпируват, PFK— фосфофрукто-

кинанза,

РК — пируваткиназа, LDH — лактатдегидрогеназа).

Другой

метод

исследования фосфофруктокиназы основан на

превращении

фруктозодифосфата в диоксиацетонфосфат и гли-

церальдегид-3-фосфат с

участием

альдолазы, изомеризации

триозофосфатов с помощью триозофосфатизомеразы и

последу-

ющем измерении количества образовавшегося NADH в

ходе

реакции

окисления глицеральдегидфосфата глицеральде-

гид-3-фосфат—дегидрогеназой.

5. Автоматическое титрование кислоты или основания

Гидролитическую реакцию, в

ходе

которой происходит вы-

свобождение кислоты,

удобно

исследовать с помощью титрова-

ния

основанием.

Лучше

всего использовать для этого автомати-

ческое титрование с применением рН-стата, когда рН раствора,

регистрируемый стеклянным электродом, поддерживается по-

стоянным

благодаря добавлению основания с помощью шприца,

управляемого электронным устройством. Объем, в котором

протекает реакция, составляет всего 1 мл, а минимальное коли-

чество основания, которое можно зарегистрировать, равно

~50 нмоль (5—10 мкл раствора основания с концентрацией

5-Ю"

—1-Ю"

М). Обычно источником ошибок здесь является

изменение

рН раствора под действием растворенного СОг.

6. Применение радиоактивных изотопов

Наиболее чувствительные методы анализа основаны на ис-

пользовании

радиоактивных субстратов. Объем реакционной

смеси составляет в этом

случае

всего

20—100

мкл.

Радиоактивность измеряется в кюри (Ки); 1Ки =

2,22-10

расп-мин-

. На практике ее

характеризуют

числом

импульсов в 1 мин. Для измерения радиоактивности используют

сцинтилляционные

счетчики, способные регистрировать излуче-

ние,

испускаемое радиоактивными изотопами

Н,

С,

S и

Р.

ПРАКТИЧЕСКАЯ

КИНЕТИКА

197

Эти изотопы

при

распаде испускают Р-частицы (электроны),

которые вызывают свечение сцинтиллятора, регистрируемое

фо-

тоумножителем

(см.

приложение). Эффективность счета

при

низкоэнергетическом

излучении, испускаемом изотопом

Н, со-

ставляет

15—40%,

а для

изотопов

С,

S и

Р эта

величина

достигает

80%.

Благодаря тому что энергетический спектр излу-

чения

существенно отличается

от

спектров излучения

других

изотопов,

распад

можно регистрировать

в их

присутствии,

проводя измерение радиоактивности

разных областях энерге-

тического спектра (опыты

двойной меткой) (табл.

6.1.).

Таблица 6.1

Некоторые

часто использующиеся радиоактивные изотопы

Изотоп

32р

125J

131]

Период

полураспада

5730

лет

12,35

лет

87,4

сут

14,3

сут

8,06

сут

120

сут

Удельная

ак-

тивность

при

100%-ном

обо-

гащении,

Ки-моль~'

62,4

2,9-10

1,49-

9,13-

2,18 •

1,62 •

1,09 •

Тип

излучения

Р-частицы

Y-лучи

р-частицы

у-лучи

Y-лучи

Максимальная

энергия

излу-

чения,

МэВ

0,156

0,0186

0,167

1,709

0,247—0,806

Излучение изотопа

характеризуется настолько высокой

энергией,

что его

можно регистрировать

без

сцинтиллятора,

используя эффект Черенкова.

При

прохождении через

воду

или

полиэтиленовую ампулу электроны движутся

так

быстро,

что

Таблица 6.2

Некоторые

меченные радиоактивными изотопами субстраты,

имеющиеся в Радиохимическом центре

(Amersham)

Субстрат

Метионин

(обогащение

90%)

[Ме

Н]

Метионин

[

Метионин

— -

Атр

Удельная

активность,

Ки-моль~'

280

•

3-Ю

1,5-Ю

Чувствитель-

ность,

пмоль

)

0,1

0,01

•

10"<

2 •

10""

) Определяется исходя

из

того,

что

минимальное

число

импульсов

минуту,

которое можно зарегистрировать, равно

50.

198

ГЛАВА 6

спонтанно

испускают фотоны, которые удается регистрировать

эффективностью

порядка

40% с

помощью счетчика

открытым

окном.

Этот эффект

был

использован

для

подсчета числа распа-

дов изотопов

Р и

С,

одновременно присутствующих

образ-

це,

сначала

помощью излучения Черепкова,

затем повтор-

ным

подсчетом

присутствии сцинтиллятора.

Чувствительность методов

использованием радиоактивных

изотопов зависит

от

удельной активности препарата (табл.

6.2).

Иногда

удается обнаружить соединение, когда

его

количество

не

превышает

10~

моль,

что на 6—7

порядков меньше,

чем

мини-

мальное количество, которое можно зарегистрировать спектро-

фотометрически.

Возможные источники ошибок

а.

Тушение.

Излучение трития настолько слабое,

что

прак-

тически целиком поглощается фильтровальной бумагой, хрома-

тографической пластинкой,

на

которой адсорбирован образец,

или

осадком. Излучение изотопа

регистрировать легче,

но

иногда максимум энергетического спектра смещается

сторону

меньших энергий.

Следует

иметь

виду,

что

окрашенные соеди-

нения

или

древесный

уголь

могут

поглощать свет, испускаемый

сцинтиллятором.

б. Перенос

Н. В

ряде случаев тритий переносится

с суб-

страта

на

растворитель

или

белок.

связи

этим,

также имея

виду сказанное выше, лучше использовать

другой

изотоп

—

С,

хотя более высокая удельная активность

относительно

небольшая стоимость соединений, меченных тритием, часто

ком-

пенсируют указанные недостатки.

в. Другие

источники

ошибок.

Вода

уменьшает эффектив-

ность счета, поэтому

она

должна присутствовать

образцах

строго фиксированном количестве. Иногда

артефактам приво-

дит добавление основания. Необходимо также иметь

виду,

что

освещение сцинтнлляторов вызывает

их

фосфоресценцию, кото-

рая

может длиться несколько минут.

Разделение продуктов реакции

Совершенно

очевидно,

что для

исследования

той или

иной

реакции

необходимо отделить продукты

от

исходных реагентов,

а затем измерить радиоактивность. Весьма удобными методами

разделения являются хроматография

высоковольтный элект-

рофорез,

поскольку

бумагу

можно разрезать

на

полоски

точно

измерить

их

относительную

радиоактивность.

Еще

удобнее

ис-

пользовать

для

избирательной адсорбции

или

выделения

нуж-

ного соединения прокладку

из

фильтра Например, меченую

АТР

ПРАКТИЧЕСКАЯ

КИНЕТИКА 199

можно адсорбировать на древесном

угле,

который затем соби-

рается на стеклянном фильтре, или на диске, содержащем дре-

весный уголь. Для избирательной адсорбции анионов использу-

ются фильтры из диэтиламмонийметилцеллюлозы, а катионов —

фильтры из карбоксиметилцеллюлозы. Белки и любые прочно

связанные с ними лиганды часто адсорбируют на фильтрах из

нитроцеллюлозы. Ковалентно меченные белки или полинуклео-

тиды можно осадить кислотой и собрать на стеклянном фильтре

(если образуется плотный осадок) или на нитроцеллюлозе (если

осадок рыхлый). Эти фильтры не уменьшают эффективности

регистрации излучения

С и

Р.

Б.

Графическое представление кинетических данных

1. Экспоненты

а.

Простая экспонента

Для реакции первого порядка

-^ В (6.5)

концентрация

вещества

В в

момент времени

t, [B]t,

связана

конечной

концентрацией

1В]оо

соотношением

[В],-[В^П-ехр

(-*/)],

(6.6)

или

in([B]

-[B]

)

ln[B]

(6.7)

[сравните с уравнением (4.5)]. Обычно k находят из графика,

построенного в координатах {t; ln([B]oo— [В]*)}. Использова-

ние

этой анаморфозы

требует

предварительного определения

предельной концентрации [В]оо;

следует

отметить, что неболь-

шие отклонения в оценке этой величины не

будут

приводить

существенным искажениям параметров, которые определяются

из

прямой, проведенной с помощью метода наименьших квад-

ратов.

б. Метод Гуггенгейма

В тех

случаях,

когда не удается найти предельное значение

1В], можно воспользоваться методом Гуггенгейма [2], исполь-

зуя зависимость

1п

([

Ь+м~[В],) = const ~kt. (6.8)

Константа k определяется из графика, построенного в коорди-

натах {t; 1п([В](+

( — [В]/)}, где А^ — постоянный отрезок вре-

мени,

составляющий по крайней мере два-три периода полу*

превращения.

200

ГЛАВА

в. Разность

экспонент

Найти

константы скорости для процесса, описываемого

уравнением

[В] = X {ехр (- kit) - ехр (- k

t)} (6.9)

[сравните с уравнением (4.29)], относительно просто, если одна

из

констант скорости в 5—10 раз больше

другой.

Используя

ln[B]

-2-

0,02 0,04 0,06

Время,

0,2

0,4-

0,6

Время,

0,8 1

Рис.

6.2. Графический метод анализа

кинетики

реакции,

подчиняющейся урав-

нению

(6.9). График построен в координатах {t; In [В]}. Константа скорости

медленного

процесса определяется из

наклона

линейного участка

кривой,

когда

быстрый процесс уже завершился. Константа скорости быстрого про-

цесса

определяется из графика зависимости 1пД (разность между значением

концентрации

В в данный момент времени и значением, полученным экстра-

поляцией

линейного участка, как показано на рисунке) от времени, построен-

ного

по начальным точкам

кривой.

Для рассматриваемого примера константы

скорости

равны 20 и 2 с~'.

точки кривой, соответствующие временам t, в 5—10 раз превы-

шающим время полупревращения для первого процесса, строят

по

ним в полулогарифмическом масштабе прямую, которая от-

носится только ко второму процессу, поскольку первый уже

завершился. Затем подставляют полученные данные в уравнение

(6.9) и находят константу скорости более быстрого процесса.

Часто эта процедура выполняется графически, как показано на

рис.

6.2. Если константы скорости разделить таким способом не