Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Транспорт соединений железа микробами (сидерохромы.) 223

кильная группа [-GON(OH)R]. Все гидроксаматы такого типа

гладко превращаются при обработке периодатом в легко обна-

руживаемый димер цыс-нитрозоалкана (а

м при 267 нм ~ 10)

[3]. Можно предполагать, что карбокоилатные группы, образую-

щиеся после окисления периодатом, присоединены к гидроксил-

аминогруппам по связям шдроксамовой кислоты в первоначаль-

ной молекуле. Изменения в спектре гидроксамата железа(Ш) при

изменении рН могут помочь детально установить структуру же-

лезосодержащего центра.

И диоксибензоильные кольца, и свободные гидроксиламино-

группы неустойчивы в щелочной области рН до соответствующих

им значений рK

2.2. Феноляты

2.2.1. Энтеробактин

¢::19

C=O

I-N

C = O

О N-H

O=C

О N-H

-C-CH

-O-C-C-CH

-O-C-C-H

I=C-

-СНг

энтеробактин (I)

О N-H О

Il I Il I

H-C-CH

-O-C - C-CH

-O-C-C-H

I H I

O=C О CH

железо (III) энтеробактин (Ia)

Энтеробактин (I) был получен из культуры Salmonella typhi-

гиг1ит LT2 с низким содержанием железа, к которой были до-

авлены ионы марганца [2]* в относительно высокой ,концентра-

ии. Соединение кристаллизуется из смеси этанол—вода, т. пл.

02—203 °С.

* Идентичное соединение, названное энтерохелином, было выделено из

/льона Escherichia coli и других кишечных бактерий Гибсоном с сотр. [62а].

, typhimurium образует приблизительно только 6 мг на 10 л среды. Для получе-

1я большего количества этого соединения можно использовать штамм 62-1

лбсона Aerobacter aerogenes.

224

i лава 2

Энтеробактин практически нерастворим .в воде, но легко рас-

творяется в ацетоне, диоксане, диметилсульфоксиде или метаноле.

Его растворимость в воде увеличивается при значениях рН 7—8,

при которых шдроксильная группа в положении 2 начинает иони-

зоваться. Эта группа нейтральна при электрофорезе на бумаге

при рН 5 и обнаруживает яркую голубую флуоресценцию в

ультрафиолетовом свете, характерную для 2,3-диоксибензоильных

колец. Гидролиз под действием 6 н. HCl в качестве единственных

идентифицируемых фрагментов дает L-серии и 2,3-диоксибензой-

ную кислоту; элементный анализ на С, H и N позволяет предпо

ложить, что структура энтеробактина представляет собой ангид

рид, состоящий из этих двух фрагментов.

HK- и ПМР-спектры энтеробактина напоминают спектрь

2,3-диоксибензоилсерина. Сильное поглощение при 1760 см

-1

мож

но отнести к деформационным колебаниям .сложноэфирной карбо

нильной группы. ПМР-спектры при 220 МГц в дейтеродиметил

сульфоксиде с тетраметилсилаяом в качестве внутреннего стан

дарта имеют следующие характеристики: 5 = 8,90, дублет (амид)

6 = 7,30, дублет (ароматические протоны), 6 = 6,96, дублет (арома

тичеокие протоны), 6=6,71, триплет (ароматические протоны)

6 = 4,91, сложная полоса (анпротоны), 6=4,64, сложная полос

(метиленовые протоны) и 6 = 4,41, сложная полоса (метиленовы

протоны). В масс-спектре главный ион имеет т/е 223, что соот

ветствует мономеру; метилирование энтеробактина диазометано

дает ионы, Miacca которых соответствует димеру или более высокс

молекулярному соединению. Седиментационное равновесие в вол

и D

O показало, что энтеробактин является тримером с молек)

лярной массой 669 и структурой, изображенной формулой I. I;

ким образом, энтеробактин является циклическим триэфиро

L-серина, в котором все три аминогруппы ацилированы остаткаN

2,3-диоксибензойной кислоты.

Железо(III)энтеробактин (Ia) проявляется при электрофоре:

на бумаге при рН 6,5 как трехвалентный анион; предполагаете

что его структура такая, как показано формулой La. Три пирок

техиновые группы расположены по одну сторону от плоское:

12-членного циклического полиэфира и образуют левосторонш

пропеллер вокруг иона Fe(III). Это абсолютно такое же расп

ложение, как D-конфигурация, обнаруженная в феррихроме

кристаллографически [14].

Мутанты S. typhimurium, не способные синтезировать ко

плекс I, реагируют с ним при молярных концентрациях на д

порядка меньших, чем те, которые требуются, когда сидерохр

мом является 2,3-диоксибензоилсерин. Последнее соединение, г

видимому, может использоваться для транспорта железа, хотя N

нее эффективно у Salmonella и, возможно, в других видах. Одг

Транспорт соединений железа микробами (сидерохромы) 225

ко вполне вероятно, что энтеробактин является главным

активным сидерохромом в этих микроорганизмах*.

Энтеробактин проявляет пацифариновую активность в мыш-

цах [626]; очевидно, она идентична ингибированию колицина В,

которое обнаружено в ,кишечных бактериях [62в].

2.2.2. 2-Ц,6-Н-Ди(2,3-диоксибензоил)-ь-лизин (II)

C=O C=O

I I

H-N N-H

I I

H-C (CH

)

C-H

' I

O=C-OH

Это соединение было получено в виде белого аморфного по-

рошка с выходом приблизительно 90 мг/л при росте Azotobacter

vinelandii О в среде с низким содержанием нитрата железа [30].

Эно отличается от соединения, полученного химически путем аци-

тирования обоих атомов азота L-лизина 2,3-диоксибензойной кис-

ютой. Хотя комплекс с железом не был исследован, интересно

отметить, что точно такое же число атомов, а именно 5, разделяет

1ве ацилированные 'аминогруппы в энтеробактине. Это позволяет

1редположить, что соединение II участвует в транспорте железа

г A. vinelandii.

2.2.3. 2,3-Диокси-№-бензоил-1.-серин (III)

C = O

H-N

H-C-CH

-OH

O=C-OH

III

* Мутации, влияющие на транспорт железа у Escherichia coli, сравнимы

теми, которые имели место у Salmonella typhimurium с предполагаемым заме-

[ением в хромосоме. Однако в отличие от Salmonella. Е. coli, по-видимому,

меет индуцируемую систему для усвоения цитрата железа (III) [Сох G. В..

ibson F., Luke R. К., Newton N. A., O'Brien J. G., Rosenberg H., J. Bact., 104,,

19 (1970)].

16—2451

226 i лава 2

Брот с сотр. [29] установили, что .при росте ауксотрофа ,метио-

нин— витамин Bi

Е. coli Ki

на среде из солей глюкозы без до-

бавления железа с выходом 75 мт/л образуется соединение, выде-

ляемое в виде комплекса с Fe(III). Раствор этого соединения

обесцвечивается при рН 2 или в присутствии 0,1 M ЭДТА. Лиганд

был идентифицирован как 2,3-диокси-1Ч-беизоилсерин (III); его

структура подтверждена О'Брайном с сотр. [46] посредством син-

теза D- и D,L-!конфигураций. Полагают, что конфигурация при-

родного соединения должна быть L, хотя синтетический продукт,

содержащий п -серии, по активности сопоставим с мутантным

штаммом Escherichia coli. Железо действует как мощный угнета-

ющий агент как для фермента, соединяющего 2,3-диоксибснзойную

кислоту с ь-серином в Е. coli [63], так и для ©сей ферментативной

системы, превращающей хоризмат в 2,3-диоксибензоат у Л. aero-

genes [8]. Соединение III было получено из A. aerogenes [46] и

typhimurium [31, 50], так что можно было провести корреляцию

вирулентности S. typhimurium с его способностью извлекать же-

лезо из сыворотки человека [50].

2.2.4. 2,3-Диоксибензоилглицин (итоевая кислота) (IV)

C-O

H-N

H-C-H

O=C-OH

итоевая кислота (IV)

Итоевая кислота (IV) — глицин, конъюгированный с 2,3-диок

сибензойной !кислотой, был первым описанным фенолятным сиде

рохромом [19]. Он был выделен в количестве около 50 мг/л и

культуры Bacillus subtilis с низким содержанием железа. Химичс

ски это соединение было синтезировано взаимодействием 2,3-диоз>

сибензойной кислоты с эфиром глицина с последующим омыленг

ем. Было показано, что образование этого соединения полносты

подавлено у В. subtilis при концентрациях железа 3-Ю

-6

г-атом/

[64]; при этом железо(III)шизокинин более активен, чем неор

ганическое железо [65]. Было обнаружено, что фенолокислот

способствуют транспорту железа в В. subtilis [26]; это подтве]

ждает предположение, согласно которому такие «мояомерные

сидерохромы, как IV, могут играть роль, эквивалентную роли Э1

теро'бактина.

Транспорт соединений железа микробами (сидерохромы) 227

2.3. Гидроксаматы

2.3.1. Семейство феррихрома

Феррихром (Va): R = R' = R" = Н; R'" = CH

Феррихром A (V6): R=R'= HOCH

-; R" =H;

сн

(транс)

Феррихризин (VB) : R=R'= HOCH

-; R" =H; R"' = CH

Феррикрокин (VR): R =R" =H; R'=HOCH

-; R" = CH

Феррирубин (Vp): R=R'= HOCH

сн

(транс)

Ферриродин (Ve): R = R'= HOCH

(цис)

CH,

* !Кристаллическая структура, установленная Залкиным'соотр. [14] для фер-

шхрома А. Нумерация а-углеродных атомов дана Залкиным с сотр. [14]. 06-

уждение вопроса о конформации феррихромных соединений см.: Emery, Bio-

hemistry, 6, 3858 (1967); Llinas M.. Klein Af. P., Neilands I. В., J. Mol. Biol., 52,.

!99 (1970); Llinas M., Doctoral Dissertation, University of California, Berkeley,

971.

228

i лава 2

Феррихром С (Уж): R = R" = H; R' = R'" = CH

Краситель Сейка А (Уз): R =HOCH

-; R' = R'" =CH

-; R" H

! //О

Альбомицин а

(Уи): R = Ацил—N=/ XN-SO

-O-CH

R' = R'' = HOCH

-; R'" = CH

N. ^

Альбомицин е (VK) : R=H-N=,/ ^N-SO

-O-CH

R' = R" = HOCH

-; R'" = CH

/О

Альбомицин 6i (Ул): R =O=/ XN-SO

-O-CH

R' = R" = HOCH

-; R'" = CH

Гризеин: этот антибиотик может быть идентичен одному из компонентов альбо-

мицин а.

Феррибактин: циклический декапептид, содержащий и D- и L-формы 6-N-0KCH0P

нитина.

Характерной структурной особенностью семейства феррихро-

ма является то, что все его члены — циклические гексалептиды

содержащие трипептид из б-Ы-ацил-ь-б-Ы-оксиорнитина и трипеп-

тид, состоящий из маленьких нейтральных аминокислот. Послед-

ний может быть построен либо из одного глицина, серина илг

аланина, либо из некоторой определенной комбинации этих ами

нокислот. Так, феррихром (Va) содержит тригл-ицин, в то врем5

как альбомицин (VN—VN) состоит из трисерина. Последователь

ность серилсерилглицип является общей для феррихрома A (V6)

феррихризина (VB), феррирубина (VA) и ферриродина (Ve). Kpa

ситель Сейка А [86] и феррихром С [7] содержат аланин. Такил

образом, конформации альбомицинов могут быть отличными о

•конформаций других феррихромов, так как только они из всегс

ряда не содержат остатков глицина в положении R" в формуле V

Соединения ряда феррихрома образуют устойчивые нейтраль

ные комплексы с ионами металлов с координационным числом 6

преимущественно с октаэдрической конфигурацией. Из всех био

элементов ион Fe(III) образует наиболее прочные комплексы

логарифмы констант устойчивости триацетилгидроксамата желе

за, феррихрома и феррихрома А равны соответственно 28,3, 29,1

32 (табл. 5.1). Несмотря на прочное связывание, неорганическо

Последовательность аминокислот определена методом ПМР (Llinas M

частное сообщение)

Транспорт соединений железа микробами (сидерохромы.) 229

железо наполовину обменивается в феррихроме при нейтральных

значениях рН всего за несколько минут [35]. В ряду феррихрома

положение максимумов поглощения и миллимолярные коэффици-

енты поглощения зависят от таких факторов, как число связанных

ионов железа, рН и природа ацильного заместителя. Как прави-

ло, при нейтральных значениях рН а„м равно 3—4 в области

420—440 нм [3]. Гидроксаматные комплексы Fe(II) бесцветны и

относительно неустойчивы. Свойства железо (III) гидроксаматов

несовместимы с окислительно-восстановительным механизмом для

железа, но, с другой стороны, идеально подходят для выполнения

биологической роли —- транспорта металла.

Полная кристаллографическая структура феррихрома A (V6),

установленная Залкиным с сотр. [14], подтвердила формулу, ос-

нованную на разложении и синтезе феррихромов, и, кроме того,

позволила определить конформацию молекулы. Пептидные части-

цы примерно планарны, антипараллельны («кросс-(3») углам с

двумя гидроксаматными остатками (и, следовательно, иону ме-

талла), расположенными на другом конце молекулы. В кристалле

определено положение только одной трансаннулярной водородной

связи, образуемой остатком орнитина [3]; вторая водородная

связь образуется между орнитином [2] и гидроксаматным кисло-

родом того же остатка. В растворе комплексы имеют четыре мед-

ленно обменивающихся атома водорода, которые с помощью

ПМР-исследования отнесены следующим образом: алюмихром —

орнитин [1] («внутренний»), орнитин [2] (участвующий в обра-

зовании водородной связи), орнитин [3] (участвующий в образо-

вании водородной связи) и глицин [3] (связанный водородной

связью или «внутренний»). Пептиды, не содержащие железа, ни-

когда не образуют кристаллов и не имеют медленно обмениваю-

щихся протонов в водной среде; в диметил сульфоксиде для двух

протонов в деметаллированной молекуле обнаружена пониженная

температурная зависимость химического сдвига. Методом ПМР

было установлено, что эти протоны принадлежат глицину [3] и

орнитину [3]. Таким образом, в неводной среде не содержащая

металла пептидная частица, по-видимому, имеет конформацию,

соответствующую конформации циклогексапептида типа Швайце-

ра с двумя трансаннулярными водородными мостиками.

Было найдено, что поликристаллический феррихром А пара-

магнитен до по крайней мере 10 К, и для него были рассчитаны

значения ^-фактора, собственные значения энергии и собственные

значения функции. Были измерены также параметры Мессбауэра

для феррихрома А [17] и синтетических железо (III) гидроксама-

тов [67]. В трех железо(III)гидроксаматных кольцах длины свя-

зей гидроксиламин—кислород составляют 1,97, 1,96 и 2,00 А;

в этих же трех кольцах длины связей с карбонильным кислородом

равны 2,02, 2,03 и 2,06 А соответственно [14]. Эти измерения по-

230

i лава 2

называют, что все три гидроксаматные группы могут ,подходить .к

центральному иону металла и, следовательно, все они увеличива-

ют устойчивость комплекса (табл. 5.1).

Предполагают, что феррихромы образуются при окислении ор-

нитина по б-атому азота с последующим ацилированием углерод-

ного фрагмента, связанного с 3,5-диокси-3-метилвалериановой кис-

лотой, что приводит к производному кофермента А. Феррихромы

обычно продуцируются аскомицетами, базидиомицетами и несо-

вершенными грибами; они представлены формулами V и были

выделены из культур Aspergillius, Petticillium, Neurospora, Usti-

Iago и других головневых грибов [3]. Кроме того, одна дрожже-

вая Crypotococcus melibiosus .форма феррихрома С (Уж) [7] \

альбомицины (VH—Vrc) продуцируются Actinomyces griseus.

Независимо от вида организма феррихром эффективно обра

щает токсичность альбомицина и обычно активен как фактор

роста при понижении концентрации до нанограммов на милли

литр. С другой стороны, феррихром А обычно лишен биологиче

ской активности и поэтому может рассматриваться как специаль

ный сидерохром, специфичный для первичных организмов.

2.3.2. Семейство родоторулиевой кислоты

НО

-N

I « н J Г

« I

R-N-C

О Ot

-N-R

ОН

роЪоторулиевая кислота (Vl)

VJ Fe

ретрородоторулиевые кислоты Cl

VIIa(L) R-H)

VII^(L

R = CH

)

VIIe(D

R-=CH

)

VIIe(L

R = CH

)

железо!III)родоторулат (VIU)

Циклический дипептид или дикетопиперазин б-1Ч-ацетил-ь -(S

б-Ы-оксиорнитина, химически идентифицированный как N,N',3,(

диоксопиперазин-2 (S) ,5(S) -ди (триметилен) - бмс-ацетогидроксам<

Транспорт соединений железа микробами (сидерохромы.) 231

вая кислота или родоторулиевая кислота (VI), был выделен из

лишенной железа культуры Rhodotorula pilimanae и родственных

ей дрожжей [32]. Это соединение было охарактеризовано 'восста-

новлением известного дикетопиперазина 6-Ы-ацетил-ь-орнитина,

а также с помощью ряда физических 'методов, таких, ка.к ИК-,

ЯМР- и масс-спектрометрия. Как и ожидали, в ПК-спектре соеди-

нения VI г|ис-пептидные связи кольца проявляются по отсутствию

либо полос «амид II», либо полос валентных колебаний связей

NH в области выше 3250 см

-1

и по отчетливым плоским деформа-

ционным колебаниям вблизи 1450 см

-1

. Предполагаемая структу-

ра соединения VI подтверждена сравнением характеристичных

сигналов кольцевых протонов в ПМР-спектре с аналогичными сиг-

налами модельного дикетопиперазина. Исследования дисперсии

оптического вращения в дальней УФ-области показали, что это

соединение должно иметь конфигурацию L,L.

Несмотря на то что нет никаких сомнений относительно струк-

туры родоторулиевой кислоты, химически она не была синтези-

рована. Однако был получен ряд ее L- И D-аналогов, представлен-

ных общей формулой VII; все они имеют более короткие боковые

цепи, чем соединение VI [68]. Эти соединения называются «ретро-

родоторулиевыми кислотами», поскольку в них и относительное

положение дикетопиперазиновых колец, и ацильных заместителей

относительно звена гидроксамовой кислоты обратно их располо-

жению в VI.

Из спектра поглощения родоторулата железа(III) при низких

значениях рН можно заключить, что обе гидрокоаматные группы

могут быть связаны с расположенным в центре ионом металла

(VIII). Растворы, содержащие

моля соли Fe(III) на 1 моль

соединения VI, ведут себя как полиядерные комплексы, молеку-

тярная масса которых составляет несколько тысяч. По-видимому,

эодоторулиевая кислота претерпевает такой же путь биосинтети-

!еских превращений, как и феррихром.

Обзор 142 различных культур, представляющих 19 классов

!рожжей, показал, что гидроксамат образуют два неклассифици-

юванных штамма и 52 штамма из Aessosporon (3 из 3), Crypto-

:oceus (1 из 43), Leucosporidium (3 из 11), Rhodosporidium (4 из

4), Rhodotorula (27 из 39), Sporidiobolus (2 из 2) и Sporobolomy-

'es (12 из 13). За исключением одного штамма Cryptoeoecus, ко-

орый образует феррихром С, большинство других дрожжей обра-

зует родоторулиевую кислоту в количествах, позволяющих выде-

шть ее в виде кристаллов [7].

В то время как родоторулиевая кислота является потенциаль-

[ым фактором роста для Arthrobacter JG-9 (половинный рост при

•10~

М), она не может обращать токсичность альбомицина для

:. coli или В. subtilis [32]. Дезоксиродоторулиевая кислота, ди-

етопиперазин fi-N-ацетил- ь-орнитина, неактивна. Интересно, что

232 i лава 2

ее аналоги VI16 и VIIB проявляют одинаковую активность с

Arihrobacter JG-9 и обеспечивают половинный рост при IO

-5

М;

ретрородоторулиевая кислота VIIR всего на порядок менее актив-

на [68]. Эти эксперименты ясно показывают, что родоторулиевая

кислота не может служить в Arthrobacter sp. агентом для перено-

са ацильной группы и что ее 'биологическая активность должна

быть связана со способностью связывать железо.

Димерумовая кислота (Villa), дикетопиперазин транс-изомера

фузаринина, была получена в конце ферментативного периода из

культур Fusarium dimerum [68а]. В этом соединении уксусная

кислота в ацильной части феррирубина (Уж) замещена родото-

рулиевой кислотой. Однако, по-видимому, не это соединение яв-

ляется предшественником родоторулиевой кислоты [686].

Копроген (VI116) —один из первых выделенных агентов, пере

носящих железо, продуцируемый Neurospora и другими грибковы

ми частицами, недавно был охарактеризован как комплекс желе

HOCH

V,,,2

Ъимерумовая нислота (VIIIQ)

копроген (VWd)