Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Т а б л и ц а 49. Белковые продукты микробного происхождения

Название и назначение

Пищевые дрожжи

Лечебные

(пивные) дрожжи

Паприн (дрожжевой

кормовой белок)

Гаприн

(бактериальный

кормовой белок)

Пищевой

микопротеин

Торутин

Дигитатин

Содер-

жание

белка,

Продуцент

Sacch. cerevisiae

— " —

Candida maltosa

разные бактерии

Fusarium

graminearum

Candida utilis

Penicillium digitatum

Источник углерода

углеводы, этанол

углеводы

твердые парафины

метан

углеводы

этанол

крахмал

картофельный

Микробный белок заманчив в перспективе, поскольку его

экономическая целесообразность представляется несомненной хо-

тя бы из следующего сравнения: на 1 кг корма для крупного

рогатого скота можно получить около

70 г

говядины с содержанием

14 г белка, тогда как на

кг углеводов с добавкой неорганического

азота для F. graminearum в Англии получают около 1100 г. сырой

мицелиальнои массы, содержащей 136 г белка.

Сепарирование клеток из культуральной жидкости проводят

одним из следующих способов (в зависимости от биообъекта):

фильтрованием через ротационные вакуум-фильтры, фильтр-прес-

сы (например для отделения мицелиальнои массы); коагуляцией

или электрокоагуляцией с последующим центрифугированием,

исключая фильтрацию (например, для отделения бактериальной

массы); центрифугированием, используя центрифуги непрерывно-

го действия, например, для дрожжей, или корзинчатые — для

нитчатых грибов.

На последних стадиях отсепарированную клеточную массу

можно подвергать либо высушиванию (не чрезмерному) различ-

475

ными методами, либо подсушиванию, либо эффективному отжиму.

В конечном продукте все клетки микроорганизмов должны быть

погибшими. На рис. 128а показана принципиальная схема получе-

ния кормовых дрожжей.

Получение микробных гликанов и гликоконъюгатов

Микробные полисахариды, или гликаны можно подразделить

на внеклеточные и внутриклеточные, или экзо- и эндогликаны.

Внутриклеточные могут быть структурными в клеточных стенках

(нерастворимые хитин, глюканы) и структурно-метаболическими

(относительно растворимые маннаны, гликоманнаны, определяю-

щие антигенную специфичность видов), способными переходить

в культуральную жидкость при гиперпродукции и оказываться в

разряде внеклеточных. К эндогликанам относятся запасные угево-

ды и различные гликоконъюгаты (нуклеозиды и полинуклеотиды,

отдельные ферменты, гликолшшды, пептидогликаны и др.).

Выраженными продуцентами экзогликанов являются молочно-

кислые и уксуснокислые бактерии, ксантомонасы и псевдомонасы,

отдельные виды дрожжевых и нитчатых грибов. В разных странах

производят альгиновую кислоту с помощью Azotobacter vinelandii,

Pseudomonas aeruginosa, аубазидан — с помощью Aureobasidium

pullulans, декстран (продуценты — Leuconostoc mesenteroides,

L. dextranicum), курдлан (продуцент — Alcaligenes faecalis var.

mixogenes), маннаны (продуценты — разные дрожжи из родов

Hansenula, Rhodotorula и др.), пуллулан (продуцент — Aure-

obasidium pullulans) и др.

Из эндогликанов (в виде гликоконъюгатов) на практике изве-

стны:

пирогенал, продигиозан, сальмозан, выделяемые из биомассы

клеток следующих микроорганизмов соответственно: Salmonella

spp.,

Serratia marcescens и Salmonella typhi; мурамилпептиды из

клеточных стенок грамположительных бактерий; некоторые гли-

копротеины или пептидогликаны (их включают в состав иммуно-

генных препаратов, например, пептидогликан из Klebsiella

pneumoniae входит в состав рибосомальной вакцины "Рибомунил",

выпускаемой во Франции).

Технологические процессы получения экзогликанов заметно

различаются на стадии их выделения, очистки и высушивания. Это

обусловлено неодинаковыми структурой и физико-химическими

свойствами экзополисахаридов (молекулярная масса, раствори-

мость, конфигурация гликозидных связей и пр.). Ферментацию

продуцентов проводят в аэробных или анаэробных условиях, асеп-

тично, в периодическом режиме, на средах с подходящими источ-

476

никами углерода и азота. В большинстве случаев стремятся под-

держивать такие условия, когда соотношение C/N в среде больше

так как в противном случае микроорганизм будет находиться

преимущественно в трофофазе без выраженной продукции экзог-

ликана.

конце ферментации, при :*шетном накоплении полисахарида,

культуральная среда может приобретать консистенцию геля. Если

необходимо отделять клетки от гелеобразной культуральной жид-

кости, то нередко прибегают к многократному ее разбавлению

водой (иногда в 10—15 раз) в потоке перед подачей в сепаратор

или в специальные емкости. При необходимости клетки продуцен-

та убивают прогреванием до сепарирования.

некоторых случаях,

например, при изготовлении полисахаридов медицинского назна-

чения, сепарирование повторяют 2—3 раза.

Если экзополисахарид резко изменяет вязкостные характери-

стики в водном растворе при подкислении и подщелачивании (без

разрушения своей первичной структуры), то перед сепарировани-

ем экзогликан разжижают добавлением соответствующего реаген-

та (например, щелочи), сепарируют клетки продуцента без разбав-

ления культуральной жидкости, а затем подкисляют раствор по-

лисахарида (например, соляной кислотой), восстанавливающего

при этом свои первоначальные свойства (курдлан).

Последующая стадия заключается в вакуум-упаривании или

"мембранном" концентрировании, используя соответствующие

фильтры типа "Владипор" или "Миллипор", с последующим осаж-

дением экзогликана каким-либо полярным растворителем.

На последней стадии технологического процесса полученный

экзогликан подвергают высушиванию, измельчению с последую-

щей упаковкой в соответствующую тару, или используют его для

приготовления коммерческого продукта (раствор для инъекций,

гранулы для приема внутрь, гели косметические, пасты, кремы и

пр.).

В таких случаях возможен гидролиз полисахарида на какой-

либо стадии технологического процесса в целях его деполимери-

зации (декстран).

Эндогликаны выделяют из клеточной массы либо экстракцией

соответствующими экстрагентами в водных или водно-спиртовых

растворах, либо используют предварительный гидролиз клеток

(ферментный, щелочной, кислотный) или дезинтеграцию в каких-

либо дезинтеграторах, либо протопластирование (в случае выделе-

ния небольших количеств целевого продукта).

477

Полученный тем или иным способом водный раствор эндогли-

кана (гликоконъюгата) подвергается выделению и очистке таким

же образом, как и экзогликаны.

Гликаны, выполняющие общебиологические защитные функ-

ции в живых организмах на молекулярном и клеточном уровнях,

находят широкое практическое применение в качестве основных

и вспомогательных веществ: плазмозамещающие агенты (6% вод-

ный раствор декстрана—полиглюкин), лекарственные (пирогенал,

родэксман, продигиозан) и диагностические средства (см. раздел

об антигенах и аллергенах), иммуноадыованты (грибные полиса-

хариды, сальмозан), гидрофильные основы для мазей, суспензий,

кремов, паст и др. (аубазидан, декстран, пуллулан).

Ассортимент углеводных полимеров может быть расширен за

счет изготовления на их основе полусинтетических производных,

например, сульфатированных декстранов, маннанов и других гли-

канов, относящихся к группе гепариноподобных веществ — гепа-

риноидов.

Микробные липиды пока не внедрены в промышленное про-

изводство, хотя некоторые продуценты являются заманчивыми для

этих целей, поскольку могут накапливать липиды до 40% и более

в расчете на сухие вещества клеток. К тому же в составе этих

липидов содержатся биологически ценные ненасыщенные жирные

кислоты. К таким продуцентам могут быть отнесены: Cryptococcus

terricolus, Iipomyces lipoferus, Rhodotorula gracilis, Sporobolomyces

roseus, Trichosporon pullulans и др. На первых порах перспективно

использование "липидных дрожжей" в качестве кормовых добавок,

особенно :— тех их них, которые синтезируют также заметные

количества и витаминов (например, каротина).

Получение полиоксибутирата

Поли В(-)Р-оксимасляная кислота — это запасной энергетиче-

ский материал у прокариот с ММ от

кДа до 250 кДа.

отсутствии

экзогенного источника энергии он деполимеризуется и участвует

в снабжении клетки АТФ.

Полиоксибутират накапливается в клетках (иногда до 70% от

сухих веществ) в форме гранул диаметром

0,1—0,7

нм,

окруженных

мембраной. По своим физико-химическим свойствам он перспек-

тивен в радиоэлектронике (обладает хорошими пьезоэлектриче-

скими свойствами), в медицине (хирургический материал), фарма-

ции (вспомогательное средство при создании некоторых лекарст-

венных форм), в органическом синтезе (сходен с полиизопропи-

478

леном по термопластическим характеристикам, t° плавления 166—

188°С).

НО—CH—CHj—СО-

СИ,

-о—сн—сн

—со-

си.

-О—СИ—СН

—СООН

сн,

полиоксибутират

(Ы*

300-1300)

Заметные количества полиоксибутирата накапливают бактерии

из родов: Alcaligenes, Chromatium, Hyphomicrobium, Methyl-

obacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhizobium, Spirillum,

Streptomyces, Vibrio и др. Однако лишь три рода являются перс-

пективными для промышленного биосинтеза биополимера:

Alcaligenes, Azotobacter и Methylobacterium. Они способны накап-

ливать полиоксибутират на относительно недорогих субстратах

(ацетат, водород, меласса, метанол, сахароза, этанол). Контроль за

накоплением полимера в клетках относительно легко проводить с

помощью ИК-спектрофотометрии.

При лимитировании роста продуцента по какому-либо источ-

нику питания (углерод, азот, сера, фосфор) или по кислороду

происходит накопление полиоксибутирата, синтезирующегося че-

рез АцКоА. Процесс ферментации может быть одностадийным или

двухстадийным, когда вначале накапливают биомассу клеток на

сбалансированной среде по источникам питания и дыхания, а затем

ее переводят в условия лимитированного роста и развития.

Для выделения полимера отсепарированные клетки экстраги-

руют, например, 1,2-дихлорэтаном, или дезинтегрируют с после-

дующей обработкой, исходя из целевых установок на получение

целевого продукта.

Получение микробных иммунобиологических препаратов

К микробным иммунобиологическим препаратам относят вак-

цины, диагностикумы, аллергены.

Вакцины - по праву занимают ведущее место в профилактике

инфекционных заболеваний. Миллионы детей и взрослых ежегод-

но "прививают" во всем мире вакцинами из бактерий и вирусов.

Вакцины давно подразделяют на корпускулярные и растворимые.

К числу первых относят, как правило, вакцины из убитых или

479

ослабленных живых клеток патогенов. К вторым — так называе-

мые химические вакцины. Однако, такое деление теперь оказыва-

ется недостаточным и наиболее адекватной классификацией вак-

цин является следующая:

из клеток

прокариот и

эукариот

живые

убитые

из клеточных

компонентов

полисаха—

ридные

рибосо—

мальные

— Вакцины -

из продуктов

обмена клеток

анатоксины

(токсоиды)

Вирусные

А. из вирионов

живые

инактиви—

рованные

Б.

из компо-

нентов вири-

онов

субъеди —

ничные

Генноинже —

нерные

Подбор или создание вакцинных штаммов

—

дело чрезвычайно

важное, кропотливое и ответственное. В настоящее время под

эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и под

контролем соответствующих служб здравоохранения стремятся

повсеместно (в том числе — в России) проводить мероприятия по

профилактике эпидемических инфекционных заболеваний с по-

мощью стандартных вакцинных препаратов. Основные требования

к вакцинам — высокая иммуногенность и безвредность для людей

и животных.

Вакцины могут быть в виде монопрепаратов, предназначенных

для профилактики специфических инфекций, а также в ассоции-

рованной форме для создания иммунитета против нескольких

инфекций.

Вакцины из клеток патогенных микробов

Вакцины живые. Это взвеси клеток вакцинных штаммов

микроорганизмов, стойко утратившие способность вызывать ин-

фекционное заболевание у человека, животного, но приживающи-

еся в нем. Такие штаммы, называемые аттенуированными (от лат.

attenuatus — ослабленный, тонкий, уменьшенный), могут быть

природными (спонтанные мутанты) или полученными искусствен-

но в лабораторных условиях (созданные мутанты).

Технология получения живых вакцин включает следующие

этапы:

480

1) размножение вакцинного штамма в несколько пассажей от

культуры на средах в пробирках и до ферментатора в оптимальных

условиях. Продолжительность этапа зависит от скорости размно-

жения микроорганизма (для сравнения можно назвать сальмонел-

лы и микобактерии туберкулеза). Режим культивирования - как

правило периодический;

"^^сепарирование клеток от^ культуральной жидкости, напри-

мер,

центрифугированием;

3) ресуспендирование клеток в подходящем растворителе

(смесь сахарозы и желатина - для вакцины БЦЖ, вода - для

туляремийной вакцины и т. д.);

4) розлив суспензии по ампулам или флаконам;

5) лиофильное высушивание, запаивание ампул или укупори-

вание флаконов.

Живые вакцины не должны содержать консервантов или ка-

ких-либо других ингибиторов роста и развития вакцинных штам-

мов.

Если живые вакцины выпускают в живом виде, то в качестве

суспензионной среды можно использовать какие-либо стабилиза-

торы или забуференный изотонический раствор натрия хлорида.

В России изготавливают следующие живые вакцины: М-44

против лихорадки Ку, бруцеллезную накожную, БЦЖ для внутри-

кожного применения, сибиреязвенную (для людей) - вакцина СТИ

для накожного или подкожного применения, сыпнотифозную ком-

бинированную (ЖКСВ-Е), туляремийную накожную, чумную.

Живые вакцины вводят обычно однократно.

Вакцины убитые из клеток патогенов

представляют собой взвеси клеток болезнетворных бактерий или

грибов, обладающих выраженной иммуногенностью, но лишенные

патогенности. Технология изготовления таких вакцин принципи-

ально сводится к следующему: выращивание стандартного произ-

водственного штамма на подходящей питательной среде; обезвре-

живание (инактивирование) клеток одним из нижеуказанных ме-

тодов; сепарирование клеток (чаще — с помощью центрифугиро-

вания); ресуспендирование клеток в изотоническом растворе на-

трия хлорида до определенной концентрации; контроль на отсут-

ствие живых клеток патогена, на иммуногенность и по другим

показателям, предусмотренным в научно-технической документа-

ции.

Обезвреживание клеток проводят одним из следующих мето-

дов:

прогреванием, обработкой формалином, ацетоном, этанолом.

Инактивированные разведенные взвеси микробов разливают в

16 т. 8524 481

ампулы или флаконы и хранят при 2—10"С. Основной способ

применения убитых вакцин — подкожные инъекции.

Убитыми являются вакцины против бруцеллеза (лечебная),

брюшного тифа, гонореи, дизентерии Флекснера-Зонне, коклюша,

лептоспироза, паратифов, холеры.

Крупномасштабного производства убитых вакцин против гриб-

ковых заболеваний пока нет, но в некоторых случаях в лаборатор-

ных условиях изготавливают аутовакцины для лиц с гипоэргией

при микозах или для пациентов, состояние которых оценивают

близким к анергии (например, при кандидозе).

Вакцину против брюшного тифа, инактивированную ацетоном,

выпускают в сухом виде.

Вакцины из клеточных компонентов патогенных микробов

Вакцины полисахаридные. Полисахариды, или

гликаны определяют антигенную специфичность ряда возбудите-

лей инфекционных заболеваний, поэтому антигенноактивные из

них выделяют в индивидуальном состоянии. Такими вакцинами

являются менингококковая и пневмококковая. Вакцинные штаммы

выращивают на жидких питательных средах, клетки сепарируют,

промывают водой и капсульный материал экстрагируют каким-ли-

бо методом, переводя полисахарид в водный раствор. Если гликан

также накапливается в культуральной среде, то его можно выде-

лить в чистом виде.

Из водных растворов менингококковые полисахариды осажда-

ют катионным ПАВ — гексадецилтриметиламмоний бромидом,

пневмококковые полисахариды

—

этанолом. Дополнительную очи-

стку таких препаратов можно проводить с помощью этих же

реагентов из водных растворов.

Менингококковые и пневмококковые полисахаридные вакци-

ны,

как правило, являются поливалентными. Из них первые вклю-

чают обычно 4 типа гликана, вторые — 23 типа (всего типировано

свыше 80 сероваров пневмококков).

В России (на предприятии НИИЭМ им. Г. Н. Габричевского) к

1982 г. освоены менингококковые полисахаридные вакцины —

моновалентная типа А и бивалентная типов А+С. Культуры вак-

цинных штаммов менингококков выращивают 8—10 часов в опти-

мальных условиях при 37°С до плотности 6—7

•

клеток в 1 мл

(для менингококков типа А) и 8—10

•

клеток в 1 мл (для

менингококков типа С). Затем клетки сепарируют и подвергают

обработке по следующей схеме:

482

Бактериальная культура

+ цетавлон

Осадок комплекса "цетавлон—полисахарид"

—

ЦП

экстрация IM раствором CaClj

ЦП в экстракте

+ этанол до концентрации 25%

Осадок

—

отход «—

(нуклеиновые кислоты

+ ЛПС)

Надосадок

+ этанол до концентрации 80%

Осадок полисахарида—сырца

+0.3М раствор натрия ацетата

(рН 7,2)

Полисахарид—сырец в растворе

I + фенол

Депротеинизированный раствор полисахарида

I диализ против 0,1М раствора

СаС1

Диализованный раствор полисахарида

А—полисахарид

Aa-j

С—полисахарид

ультрацентри—

фугирование

Надосадок полисахарида С

+ этанол (4 объема) +

Осадок полисахарида А Осадок полисахаридаС

промывание этанолом, ацетоном;

высушивание над СаСЦ

Очищенный полисахарид А

Очищенный полисахарид С

Очищенные полисахариды с лактозой — наполнителем реко-

мендованы в качестве вакцинирующих препаратов.

Полисахаридныи Vi-антиген из Salmonella typhi (штамм Ту2)

входит в состав брюшнотифозной спиртовой вакцины. В 1 мл

такого препарата содержится 5

•

клеток S. typhi и 400 мкг

Vi-антигена. Вакцину вводят подкожно.

483

В США изготавливают полисахаридные вакцины из некоторых

видов Pseudomonas (в частности, P. fluorescens).

Рибосомальные вакцины. У прокариот рибосомы

содержат примерно 60% РНК и 40% белка, у эукариот —

55%

и 45%

соответственно.

стационарной фазе размножения бактериальная

клетка содержит 10

рибосом; это число возрастает в период

log-фазы. Впервые рибосомальный препарат из авирулентного

штамма Mycobacterium tuberculosis приготовили Юманс А. С. и

Юманс Г. П. (1965). Рибосомы в чистом виде не применяют в

качестве вакцин, но обогащенные ими полисахаридные и другие

антигенные препараты используют на практике. Наиболее извест-

ный из них "Рибомунил

D-53",

выпускаемый во Франции. Он

включает рибосомы из клеток Klebsiella pneumoniae, Streptococcus

pneumoniae, S. pyogenes и Haemophilus influenzae с добавлением

протеогликана из К. pneumoniae: Применяют рибомунил интрана-

зально.

Его

рекомендуют для профилактики заболеваний дыхатель-

ной системы и для лечения ринитов, риносинусйтов и ринофарин-

гитов — в особенности.

Известен препарат в виде экстракта из клеток Streptococcus

mutans, обогащенный рибосомами. Схема его приготовления сле-

дующая:

Streptococcus mutans серотип g, нативные клетки — 100 г

Дезинтеграция клеток с помощью стеклянных бус

—

баллотини

(100 г) в 100 мл 10"

М фосфатного буфера (рН 7,4) с 10"

МдС1

(РМВ) и 3 мкг ДНК-азы/мл.

1 -

Неразрушенные клетки и остатки клеток отделяют низкоско-

ростным центрифугированием (дважды по 10 мин. при 27000 g и

47000 д).

Рибосомы отмывают

раз в РМВ в течение 2,5 часов при 250000

д с последующим двухкратным центрифугированием в течение 20

мин. при 47000 д, а затем фильтруют через стерильный мембран-

ный фильтр (0,45 мкм).

Препарат-экстракт

S.mutans,

обогащенный рибосомами.

В Японии для предупреждения коклюша у детей используют

вакцину из филаментозного гемагглютинина и лимфоцитстимули-

рующего фактора из Bordetella pertussis.

484