Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Потребность людей в аминокислотах достаточно велика и этим

определяется уровень их производства в мире (порядка 500 тыс.

тонн в год).

Специфические ферменты, регулирующие биосинтез амино-

кислот, широко распространены у бактерий; они с определенной

глубиной изучены у Escherichia coli, Salmonella typhimurium,

Bacillus subtilis и пр. У грибов, в ответ на аминокислотное лимити-

рование, отмечается некоординированное, параллельное возраста-

ние уровня ферментов, катализирующих реакции биосинтеза раз-

личных аминокислот. Этот "общий контроль биосинтеза амино-

кислот" был также назван "метаболическим интерблоком", или

"перекрестнопутевой регуляцией", впервые выявленной у

Neurospora crassa в 1965 г. М. Карсиотисом и сотрудниками, а

позднее

—

у Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans и других

грибов.

В гиперпродукции отдельных аминокислот культурами Е.соИ,

Serratia marcescens и

др.

важную роль играют Feedback-ингибиция

и Feedback-репрессия, например, при биосинтезе ароматических

аминокислот на последних стадиях. Штаммы — суперпродуценты,

эксплуатируемые в производстве, как правило, получены с исполь-

зованием методов генетики и селекции.

любом живом организме аминокислоты расходуются прежде

всего на биосинтез первичных метаболитов — ферментных и

неферментных белков. Следовательно, кроме биосинтеза амино-

кислот de пото.возможен другой путь их получения, а именно —

из гидролизатов соответствующих белков (триптофан разрушается

при кислотном гидролизе), в том числе — из нативной биомассы

микробных клеток.

Природные аминокислоты являются, как правило, оптически

активными L-формами, тогда как аминокислоты, получаемые хи-

мическим синтезом, являются рацемическими смесями L- и D-

форм, которые трудно разделить. Вот почему микробный синтез с

помощью коринебактерий и некоторых других микробов является

ныне основным и экономически выгодным. Первое место здесь по

праву занимает Япония, где лишь глутаминовой кислоты изготав-

ливается свыше 100 тыс. тонн в год; большинство природных

незаменимых аминокислот производит фирма "Такеда". С. Кино-

шита, впервые в 50-е годы открывший и доказавший перспектив-

ность микробного синтеза, уже в 1963 г. прогнозировал: "Мало

сомнения в том, что недалеко то время, когда с помощью микро-

организмов будет возможно производить все известные аминокис-

лоты". Это время наступило уже к 70-м годам. Получены микробы

— суперпродуценты из родов Brevibacterium, Corynebacterium,

Micrococcus и др., с помощью которых освоено крупнотоннажное

445

производство не только глутамата, но и

L-лизина,

L-валина,

L-гис-

тидина и других.

При суперпродукции уровень экспрессии клонированного гена

выражается в синтезе специфического белка в количестве не менее

от всех растворимых белков клетки-хозяина.

настоящее время

имеются суперпродуценты, у которых количество синтезируемого

специфического белка достигает 10—50% (здесь важнейшую роль

играют многокопийные плазмиды, несущие встроенные гены).

Генно-инженерными методами во ВНИИ генетики и селекции

промышленных микроорганизмов (Москва) был получен штамм

E.coli, обладающий сверхпродукцией L-треонина

(30

г/л за 40 часов

ферментации).

С любым штаммом — продуцентом какой-либо аминокислоты

необходимо внимательное и бережное обращение в целях поддер-

жания ее в активном состоянии в течение длительного времени.

Технология получения аминокислот базируется на принципах

ферментации продуцентов и выделении вторичных метаболитов,

то есть размножают маточную культуру вначале на агаризованной

среде в пробирках, затем— на жидкой среде в колбах, инокуля-

торах и посевных аппаратах, а затем в головных (основных)

ферментаторах. Отработку культуральных жидкостей и выделение

аминокислот проводят по схеме, аналогичной схеме получения

антибиотиков (см.). Изолированные чистые кристаллы целевого

продукта обычно высушивают под вакуумом и упаковывают.

Если аминокислота предусмотрена в качестве добавки к кор-

мам,

то биотехнологический процесс кормового продукта включает

следующие стадии: ферментацию, стабилизацию аминокислоты в

культуральной жидкости перед упариванием, вакуум-упаривание,

стандартизацию упаренного раствора при добавлении наполните-

ля,

высушивание и упаковку готового продукта, в котором должно

содержаться не более 10% основного вещества. Например, в про-

мышленности изготавливают сухой кормовой и жидкий кормовой

концентраты лизина наряду с кристаллическим лизином (рис. 136).

Рве.

136.

Технологическая схема пол-

учения лизина: 1 — емкость для культу-

ральной жидкости (КЖ), 2

—

ионообмен-

ные колонны, 3 — сборник элюата, 4 —

сборник фильтрата, 5

—

емкость для элю-

ата, 6 — насос, 7 — вакуум-выпарной

аппарат, 8 — циклон, 9 — сушилка кор-

мового концентрата, 10 — сборник, 11 —

реактор-кристаллизатор,

— центрифу-

га, 13 — сушилка.

446

Если концентрат содержит 70—80%- сухих веществ, то он

достаточно устойчив против микробной порчи за счет повышенной

осмотической концентрации ингредиентов.

Известны два способа получения аминокислот: одноступенча-

тый и двухступенчатый. Согласно первому способу, например,

мутантныи полиауксотрофныи штамм

—

продуцент аминокислоты

культивируют на оптимальной для биосинтеза среде. Целевой

продукт накапливается в культуральнои жидкости, из которой его

выделяют согласно схеме на рис. 137.

доамтмга юнсермнп»

Рис.

137. При-

мерная технологи-

ческая схема пол-

учения ферментов:

—

ферментатор, 2

-— охладитель, 3, 9

— рефрижерато-

ры,

4 —

емкость для

предварительной

обработки, 5 —

центрифуга, 6 —

вакуум - упарива-

тель,

7 — аппарат

прямой предобра-

ботки фермента, 8

— барабанный

фильтр,

А,

—

пути

(при необходимо-

сти смыкающиеся),

10 — аппарат для

ультрафильтрации,

II — емкость для

консервации рас-

твора фермента, 12

— мембранный

фильтр, 13 — нако-

питель жидкого

концентрата, 14 —

емкость для осаж-

дения фермента, 15

—

фильтр-пресс, 16

— распылительная

сушилка, 17_— на-

копитель сухого

концентрата.

447

двухступенчатом способе микроб-продуцент культивируют

среде, где он получает и синтезирует все необходимые ингредиен-

ты

для

последующего синтеза

(в

идиофазу) целевого продукта.

Схема двухступенчатого процесса может быть представлена

следующем виде:

аминокислоты

культивирование

жидкой

питательной среде

анников аминокислоты

ующих биосинтез целевого

биосинтез целевого продукта

участием ферментов

та

—

целевой продукт

Если ферменты биосинтеза аминокислоты накапливаются

внутриклеточно,

то

после

1-й

ступени клетки сепарируют, дезин-

тегрируют и применяют клеточный сок.

других случаях для целей

биосинтеза целевых продуктов применяют непосредственно клет-

ки.

Экономически целесообразными являются способы получения

аминокислот

помощью иммобилизованных ферментов

клеток.

Сравнительно давно реализован процесс получения L-аспарагино-

вой кислоты

из

фумаровой

аммиака

одну стадию

помощью

иммобилизованных клеток

E.coli

или Pseudomonas aeruginosa,

об-

ладающих аспартазной активностью (Е):

NH,

НС СООН . |

И » NHi— »> НООС—СН«—СН—СООН

ноос—сн

фуюровая mcram аспарапмомя шею»

Аспартаза катализирует реакцию присоединения аммиака

фумаровой кислоте. Фермент

иммобилизованном состоянии

сохраняет активность на исходном уровне до

2—2,5

недель и более.

L-Аспарагиновую кислоту можно получить

и с

помощью иммо-

билизованных клеток,

что

существенно повышает длительность

функционирования системы, производительность которой

по

це-

левому продукту составляет около 2000

кг с

биореактора.

Периодические ферментации используют при получении дру-

гих L-аминокислот (глутаминовой, фенилаланина, лизина, трипто-

448

Микроб

—

продуцент

1 ступень

II ступень

Биосинтез предт

ферментов, катализи]:

продукта

еств!

Аминокислс

фана и др.). При этом культивируют обычно специальные мутан-

тные штаммы, метаболизм которых по целевому продукту изучен

достаточно

полно.

Так, например, установлено, что лимитирующим

агентом коринебактерий, образующих глутаминовую кислоту, яв-

ляется биотин (витамин В?, витамин Н) в дозе 1—5 мкг/л. Биотин

индуцирует структурно-функциональные изменения в клеточной

мембране, благодаря чему увеличивается ее проницаемость для

глутаминовой кислоты, выходящей из клетки в культуральную

жидкость. Отдельные штаммы продуцентов способны накапливать

ее более 50 г/л на мелассных средах.

Роль биотина аналогична в случае получения L-пролина, явля-

ющегося производным L-глутаминовой кислоты.

9.3.5. Получение витаминов. Витамины поставляются в орга-

низм с пищей или их назначают в форме лекарственных препара-

тов при определенных патологических процессах. Среди липидо-

и водорастворимых витаминов известны реализованные биотех-

нологические процессы производства витаминов А

и D, рибофла-

вина, аскорбиновой кислоты, цианкобаламина (Bi

Каротиноиды — это изопреноидные соединения, синтезирую-

щиеся многими пигментными микроорганизмами из рода Aleuria,

Blakeslea, Corynebacterium, Flexibacter, Fusarium, Halobacterium,

Phycomyces, Pseudomonas, Rhodotorula, Sarcina, Sporobolomyces и

др.

Всего описано около 500 каротиноидов.

Из одной молекулы З-к&ротина при гидролизе образуются две

молекулы витамина A

. Это имеет место, например.в кишечнике

человека.

?"» . г»

LJL сн=сн—с=сн—сн=сн— с=сн—сн

он

сн,^сн

аимымнА1

Каротиноиды локализуются в виде сложных эфиров и глико-

зидов в клеточной мембране микроорганизмов, либо в свободном

состоянии — в липидных гранулах в цитоплазме. Каротиноид

"ретиналь", например, у галофильного вида — Halobacterium

halobium — соединен с белком через остаток лизина (опсинопо-

добный белок); он участвует в синтезе АТФ благодаря генерации

трансмембранного потенциала. В целом, основная функция каро-

тиноидов — защитная. Их биосинтезу в клетках способствует свет.

15 т. 8524 449

В качестве продуцентов каротиноидов можно использовать

бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Более часто применяют

зигомицеты Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta. Спариваю-

щиеся (+) и (—) особи этих видов при совместном культивирова-

нии могут образовать 3—4 г каротина на

л среды.

Питательные среды для них достаточно сложные и включают

источники углерода, азота, витаминов, микроэлементов, специаль-

ных стимуляторов (гидрол, кукурузно-соевая мука, растительные

масла, керосин, Э-ионон или изопреновые димеры, и пр.). Стиму-

ляторы целесообразно вносить в культуральные среды в конце

трофофазы, то есть когда продуцент переходит в продуктивную

фазу (идиофазу).

Вначале штаммы выращивают раздельно, а затем — совместно

при 26°С и усиленной аэрации с последующим переносом в

основной ферментатор. Условия культивирования сохраняют

прежними. Длительность ферментации — 6—7

дней.

Каротиноиды

извлекают ацетоном (можно каким-либо другим полярным раство-

рителем), переводят в неполярный растворитель. В случаях извле-

чения белково-каротиноидных комплексов, то применяют повер-

хностно-активные вещества в концентрации 1—2%. В целях очи-

стки и более тонкого разделения гомологов можно прибегать к

методам хроматографии или к смене растворителей. Витамин А!

из Р-каротина сравнительно легко можно получить при гидролизе.

случае изготовления каротинсодержащей биомассы для скар-

мливания животным и птицам возможно ее сочетанное примене-

ние с витамином А или без него. В медицинских целях витамин А

изготавливают в капсулах для приема через рот.

Витамин D — это группа родственных соединений, в основе

которых находится эргостерин, который обнаружен в клеточных

мембранах эукариот. Поэтому, например, пекарские или пивные

дрожжи применяют для получения эргостерина, как провитамина,

обладающего антирахитическим действием. Содержание эргосте-

рина в дрожжевых клетках колеблется в пределах

0,2—11%.

При недостатке в организме гормона 1,25-дигидроксихолекаль-

циферола, предшественником которого является витамин D

, у

детей развивается рахит (аналог рахита у взрослых — остеомаля-

ция).

Трансформация эргостерина в витамин D

(кальциферол) про-

исходит под влиянием ультрафиолетового облучения. При этом

разрывается связь в кольце (позиции 9,10) и образуется двойная

связь в боковой цепочке (позиции 22, 23). Эта последняя гидриро-

450

вана в витамине D

(холекальциферол). Физиологическая актив-

ность обоих витаминов (D

и D

) равноценна.

Кроме дрожжей продуцентами эрогостерина могут быть мице-

лиальные грибы

—

аспергиллы и пенициллы, в которых содержится

1,2—2,2%

эргостерина. Замечено, что полиеновые антибиотики,

действующие на клеточную мембрану дрожжей, заметно стимули-

руют их содержание в биомассе.

Получение эргостерина в производственных условиях можно

подразделить на следующие этапы: размножения исходной куль-

туры и накопление инокулюма, ферментация, сепарирование кле-

ток, облучение клеток ультрафиолетовыми лучами, высушивание

и упаковка целевого продукта.

Так, применительно к дрожжам, инокулюм получают на средах,

обеспечивающих полноценное развитие клеток, после чего основ-

ную среду с ацетатом (активатором биосинтеза стеринов), обога-

щенную источником углерода и содержащую пониженное коли-

чество азота (высокое значение C/N), засевают сравнительно

большим объемом инокулята. Культивирование дрожжей (фермен-

тацию) проводят при температуре, близкой к максимальной для

конкретного штамма, и выраженной аэрации (2% 0

в газовой

фазе).

Спустя 3—4 суток, в зависимости от ростовых характеристик

и биосинтетической активности культуры, клетки сепарируют и

подвергают вакуум-высушиванию. Затем сухие дрожжи облучают

ультрафиолетовыми лучами — УФЛ (длина волны 280—300 нм) в

течение оптимального по продолжительности времени, при требу-

емой температуре и с учетом примесных веществ. Эти контроли-

руемые показатели, установленные опытным путем, указываются

в регламентной документации. Облучение дрожжей можно прово-

дить до сепарирования клеток в тонком слое 5% суспензии, учи-

тывая малую проникающую способность УФА

Облученные сухие дрожжи применяют в животноводстве; в

промышленности их выпускают под названием "кормовые гидро-

лизные дрожжи, обогащенные витамином D

". В таком препарате

содержится не менее 46% сырого белка, незаменимые аминокис-

лоты (лизин, метионин, триптофан) и 5000 ME витамина D

/г.

В случае получения кристаллического витамина D

клетки

продуцента гидролизуют соляной кислотой при 110°С, затем тем-

пературу снижают до 75—78°С и добавляют этанол. Смесь фильт-

руют при 10—15°С, оставшуюся после фильтрации массу промы-

вают

водой,

высушивают, измельчают, нагревают до 78°С и дважды

обрабатывают тройным объемом этанола. Спиртовые экстракты

451

объединяют и упаривают до 70%-го содержания сухих веществ.

Полученный "липидный концентрат" обрабатывают раствором ед-

кого натра. Эргостерин кристаллизуется из неомыленнной фрак-

ции концентрата при 0°С. Его можно очистить повторными пере-

кристаллизациями. Кристаллы высушивают, растворяют в серном

эфире, облучают УФЛ, эфир отгоняют, раствор витамина D

кон-

центрируют и кристаллизуют.

"Кислотный фильтрат" обычно упаривают до 50%-го содержа-

ния сухих веществ и применяют как концентрат В-витаминов.

Производят также масляный концентрат витамина D

Рибофлавин, или витамин В

— содержится в клетках различ-

ных микроорганизмов, будучи коферментом в составе флавопро-

теинов (прежде всего — соответствующих ферментов из класса

оксидоредуктаз — ФМН, ФАД). Поэтому в качестве продуцентов

рибофлавина (флавопротеинов) могут быть бактерии, дрожжи и

нитчатые грибы. Однако наиболее заманчивыми являются те штам-

мы,

которые образуют на жидких средах 0,5

и более рибофлавина

в 1 л среды. К подобным организмам относятся Ashbyii gossypii,

Erembthecium ashbyii и Candida guilliermondii. Учитывая изменчи-

вость активных продуцентов названных видов по способности

синтезировать витамин

необходим систематический поддержи-

вающий отбор культур в процессе их эксплуатации на производ-

стве.

Обычно активные продуценты первых двух видов формируют

яркооранжевые колонии на агаризованных средах. Методами ген-

ной инженерии удалось получить штамм сенной палочки, образу-

ющий около 6 г рибофлавина в

л среды, включающей мелассу,

белково-витаминный концентрат и его гидролизат.

Высокий выход рибофлавина у E.ashbyii коррелирует с азотом

пуринов и другими азотистыми источниками, содержание которых

должно быть достаточным. В качестве источников углерода при-

меняют глюкозу или сахарозу, практикуют использование дрож-

жевого и кукурузного экстрактов, соевой муки, масла (жира).

Жидкие питательные среды для получения инокулюма и для

основной ферментации могут несколько различаться между собой.

Например, для получения посевного материала известна среда,

содержащая сахарозу, пептон, кукурузный экстракт, калия дигид-

рофосфат, магния сульфат, подсолнечное масло, время выращива-

ния продуцента на этой среде — 2 суток при 27—30°С (в зависи-

мости от штамма). Ферментационная среда обычно включает ку-

курузную и соевую муку, сахарозу, кукурузный экстракт, калия

452

дигидрофосфат, кальция карбонат, натрия хлорид и ненасыщен-

ный жир.

Обычно ферментацию проводят в течение 5 суток при рН 5,5—

7,7. После использования сахарозы (примерно через 30 часов)

начинает заметно накапливаться витамин

вначале

—

в мицелии,

а затем — в культуральной жидкости. Всю биомассу можно

подвергнуть высушиванию и полученный сухой продукт с остаточ-

ной влажностью 8%, содержащий

1,5—2,5%

рибофлавина, 20%

белка, тиамин, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин,

микроэлементы и другие вещества, рекомендуют для кормления

животных.

В случае высоких выходных показателей по рибофлавину,

витамин можно выделять в индивидуальном состоянии и, наряду

с синтетическим рибофлавином, использовать в медицине.

Для Candida guilliermondii важно регулировать содержание

железа в питательной среде; оптимальные концентрации колеб-

лются, в среднем, от

0,005

до 0,05 мкг/мл. При этом определенные

штаммы дрожжей могут образовывать за 5—7 дней до 0,5 г/л и

более витамина. Однако для целей промышленного производства

рибофлавина предпочитают использовать более продуктивные ви-

ды и штаммы грибов — E.ashbyii и Ashbyii gossypii.

Аскорбиновая кислота, или витамин С — это противоцингот-

ный витамин, имеющийся у.всех высших растений и животных;

только человек и микробы не синтезируют ее, но людям она

неотложно необходима, а микробы не нуждаются в ней. И, тем не

менее, определенные виды уксуснокислых бактерий причастны к

биосинтезу полупродукта этой кислоты — L-сорбозы. Таким обра-

зом, весь процесс получения аскорбиновой кислоты является

смешанным, то есть химико-ферментативным.

Gluconotoader oxydans

HOH;C(CH0H)

D-еорбиг

биологическое окисление,

рН-5,0

процесс

нон£со(снон),сн,он- .»(5о—с=с—Ъ— с-сн,ои

(трансформация)

111]

Ucopo=

OK ОН Н ОН

ижжорбиношая кислота

453

Биологическая стадия процесса катализируется мембраносвя-

занной полиолдегидрогеназой, а последняя (химическая) включает

последовательно следующие этапы: конденсация сорбозы с диаце-

тоном и получение диацетон — L-сорбозы, окисление диацетон —

L-сорбозы до диацетон-2-кето-Ь-гулоновой кислоты, подвергаемой

затем гидролизу с получением 2-кето-Ь-гулоновой

кислоты;

послед-

нюю подвергают энолизации с последующей трасформацией в

L-аскорбиновую кислоту.

Ферментацию

G.oxydans

проводят на средах, содержащих сор-

бит (20%), кукурузный или дрожжевой экстракт, при интенсивной

аэрации (8—10 г 0

/л/ч). Выход L-сорбозы может достичь 98% за

одни-двое суток. При достижении культурой log-фазы можно

дополнительно внести в среду сорбит, доводя его концентрацию

до

25%.

Также установлено, что

G.oxydans

может окислять и более

высокие концентрации полиспирта (30—50%), создаваемые на

последних стадиях процесса. Это происходит благодаря полиолде-

гидрогеназы, содержащейся в клеточной биомассе. Ферментацию

бактерий проводят в периодическом или непрерывном режиме.

Принципиально доказана возможность получения L-сорбозы из

сорбита с помощью иммобилизованных клеток в ПААГ.

Аскорбиновую кислоту используют как антиоксидант в здра-

воохранении и пищевой промышленности.

Цианкобаламин, или витамин В

— получают только микроби-

ологическим синтезом. Его продуцентами являются прокариоты и,

прежде всего, пропионовые бактерии, которые и в естественных

условиях образуют этот витамин. Мутанты Propionibacterium

shermanii M-82 и Pseudomonas denitrificans

M-2436

продуцируют на

жидкой среде до 58—59 мг/л цианкобаламина.

Учитывая важную функцию витамина в организме человека

(он является противоанемическим фактором), его мировое произ-

водство достигло 10 т в год из которых 6,5 т расходуют на

медицинские нужды, а 3,5 т — в животноводстве.

Отечественное производство цианкобаламина базируется на

использовании культуры P.freudenreichii var. shermanii, культиви-

руемой в периодическом режиме без доступа кислорода. Фермен-

тационная среда обычно содержит глюкозу, кукурузный экстракт,

соли аммония и кобальта, рН около 7,0 поддерживают добавлением

NH4OH; продолжительность ферментации 6 суток; через 3 суток в

среду добавляют 5,6-диметилбензимидазол — предшественник ви-

тамина

и продолжают ферментацию еще 3 суток. Цианкобала-

мин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по

454