Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

клонирования. Из семейства векторов MLV известны: рМХ1112,

рМХ

1122,

рМХ262 и др.

Ретровирусный вектор может включить лишь около 10000 пн.

Имея в руках готовый вирусный вектор, им можно инфицировать

подходящие клетки-мишени, например, фибробласты, экспресси-

рующие соответствующие поверхностные рецепторы.

Чтобы заразить рекомбинантным ретровирусом эмбриональ-

ные клетки, в культуральную емкость с инфицированными фиб-

робластами, продуцирующими рекомбинантный вирус, помещают

восьмиклеточную морулу (группа бластомер, возникшая после

равномерного дробления оплодотворенного

яйца),

освобожденную

от яйцевой оболочки. Морула инфицируется и после достижения

стадии бластоцисты ее вводят в матку псевдобеременной матери.

Часть бластоцист может погибнуть, а часть нормально развивается

и в соответствующие сроки трансформируется в трансгенное

потомство, которое затем подвергается тщательному генетическо-

му анализу и может использоваться для выведения трансгенных

линий.

Бластоцисты стали родоначальницами плюрипотентных эмбри-

ональных стволовых клеток типов ES и ЕК. Показано, что, напри-

мер,

ES-клетки доступны культивированию in vitro и после каких-

либо манипуляций (например, после введения клонированных

генов путем инфекции или трансфекции) можно инъецировать их

в бластоцисту и вернуть в живой макроорганизм. ES-клетки коло-

низируют эмбрион и составляют с ним единое целое, хотя коло-

низация ими зародышевого пути по разным причинам удается не

всегда. Последующие этапы работы с трансгенными животными

во многом сходны с ранее описанными. Таким образом, все три

метода получения трансгенных животных можно представить в

виде следующей схемы по Д. Мерфи и Дж. Хенсону 1987 г. (см.

рис.

166).

С конца XIX века и до середины текущего столетия были

разработаны методы пересадки эмбрионов от различных живо-

тных с последующим рождением полноценного потомства (клеточ-

ная инженерия). Следовательно, получение популяции, состоящей

из генетически идентичных особей (клонирование), возможно

не только с помощью рассмотренных выше трех способов (микро-

инъекций ДНК, вирусная инфекция и пересадка

ES-

и ЕК-клеток),

но и с помощью пересадки эмбрионов, которая может быть

585

осуществлена на раз-

личных представителях

царства Animalia, напри-

мер,

на кроликах, козах,

коровах, мышах, овцах,

свиньях и др. Так, для

получения элитного ста-

да коров в сравнительно

короткий временной

ин-

тервал (с учетом естест-

венного процесса от за-

чатия до отела) отобран-

ной родоначальнице

вводят фолликулостиму-

лирующий гормон

ч™— (ФСГ)-

ответ

на ФСГ

Рис.

166. Схема получения трансгенных живо-

ее

организм выбрасы-

тных методом микроинъекции ДНК в оплодотворен- вает 10 15 яйцеклеток

ную одноклеточную яйцеклетку: 1 - яйцеклетка, 2 - вместо ОДНОЙ в норме,

микроинъекция ДНК, 3 - трансфекция ДНК, 4 -

Все эти

яйцеклетки ОП-

пересадка ядра, 5 - пересадка клетки в бластоцисту.

тт

лодотворяются. Через

4—5

дней, когда сформировавшиеся 32-клеточные эмбрионы (око-

ло 0,2 мм в диаметре) еще не прикрепились к стенкам матки и

свободно плавают в ней, их вымывают, определяют полноценность

и вводят микрошприцем непородистым коровам, находящимся в

воспроизводительном цикле благодаря предварительному введе-

нию им простагландинов. Коровы-реципиенты эмбрионов вына-

шивают и рожают элитных телят в нормальные сроки.

Таким путем удается получить от одной элитной коровы в

среднем 5 элитных телят за 15 месяцев. В этот срок с интервалом

в 2—3 месяца у нее дважды забирают яйцеклетки и один раз она

разрешается собственным теленком. На этом пути открываются

заманчивые перспективы, связанные с возможностями оплодотво-

рения яйцеклеток in vitro, а также длительным хранением эмбри-

онов в замороженном состоянии. Тогда в целях экономии можно

продавать такие эмбрионы в соответствующие агрохозяйства.

С учетом религиозных воззрений, гражданских законода-

тельств и этики в ряде стран решаются проблемы искусственного

осеменения женских яйцеклеток зародышевыми клетками от муж-

586

ДНК

ретромрусная

ннфскцня

ES(EK)

чин. Лишь только во Франции на начало 1992 г. родилось свыше

10000 детей от женщин-доноров.

11.7.

Иммуномодуляторы. Иммуномодуляция (от

лат.

immunitas

— избавление, освобождение, modulatio — мерность, размерен-

ность) — термин интегративный, объединяющий представления о

каком-либо целенаправленном вмешательстве в работу иммунной

системы, функционирующей в условиях нормы и патологии. Со-

ставными частями иммуномодуляции являются: иммуностимуля-

ция и иммунодепрессия (иммуносупрессия), т. е. иммунокоррек-

ция. При иммуностимуляции. происходит активизация иммунной

системы, при иммунодепрессии (иммуносупрессии) — ее частич-

ное угнетение; следовательно иммунокоррекция сопровождается

выравниванием деятельности иммунной системы. Индивидуаль-

ные вещества или средства, применяемые в качестве иммуномо-

дуляторов, соответственно подразделяют на иммуностимуляторы

и иммуносупрессоры (иммунодепрессанты).

Все иммуномодуляторы условно можно еще подразделить на

специфические и неспецифические. Первые из них выступают

преимущественно специфическими антигенами, индуцирующими

антителообразование, вторые, влияя на иммунную систему, выра-

женно или совсем не являются антигенноактивными. Неспецифи-

ческие иммуномодуляторы бывают двух типов: .

а) действующих при нормально функционирующей иммунной

системе (вакцина BCG, Corynebacterium parvum),

б) максимально действующих на супрессированную иммунную

систему (левамизол, препараты тимуса, интерфероны); они мало

активны или совсем неактивны, когда их вводят пациентам с

нормальной иммуной системой.

Все иммуномодуляторы используют в качестве средств лечения

соответствующих заболеваний, связанных с дефектами иммуной

системы, или иммунодефицитами.

11.7.1.

Иммуностимуляторы. Иммуностимуляторы повышают

устойчивость организма к инфекционным заболеваниям, активи-

зируют иммунитет у онкологических больных, получающих цито-

статики, радиоактивное

облучение.

Их подразделяют на природные

и синтетические. К природным относят иммуноглобулин-у (Ig-y),

являющийся также средством заместительной терапии; препараты

из зобной железы крупного рогатого скота (тактивин, тималин,

тимопоэтин и др.), интерфероны (см.), фактор переноса, или

лейкоцитарный трансфер-фактор (ЛТф), специфические опухоле-

вые вакцины, иммунную РНК (И-РНК), натрия нуклеинат, проди-

587

гиозан, сальмозан, грибные гликаны, апатогенный штамм

Mycooacterium tuberculosis (вакцина BCG) и другие вакцинные

штаммы различных микроорганизмов, анатоксины.

Синтетическими иммуностимуляторами неспецифического

действия являются батилол, йзопринозин, левамизрл, "хлоридйн и

некоторые другие. Поскольку эти вещества представляют собой

продукты органического синтеза, то они не рассматриваются в

настоящей книге.

•' Иммунный гамма-глобулин (IgG) -т- продукт матричного син-

«•

теза, 'являющийся гликопротеином и способный проникать через

плаценту. Его получают в очищенном и концентрированном видах

из донорской, плацентарной и абортной крови человека в виде 10% •

или

16%*

раствора. Препарат изготавливают из смеси большого

числа сывороток крови взрослых людей, ранее болевших, напри-

мер,

гриппом, корью и другими инфекционными заболеваниями,

или получавших вакцины в качестве профилактических средств.

Поэтому так называемый нормальный глобулин может содержать

Ig-ы против возбудителей дифтерии, кори, оспы и других заболе-

ваний.

Специфические гипер-1д-ы изготавливают из крови специально -

иммунизированных людей, например, против бешенства, клеще-

вого энцефалита, стафилококковых инфекций, столбйяка и др.

Основной метод выделения иммуноглобулинов является их

фракционированное осаждение этанолом (по Е. Дж. Кону, 1945—

1946) на холоду при строгом контроле рН и ионной силы раствора.

На процесс разделения белков сыворотки крови влияют следую-

* щие основные факторы: концентрация белка, диэлектрическая j

постоянная раствора, концентрация этанола, изоэлектрическая

.точка, рН, ионная сила-'раствора, температура.--' *

Необходимо иметь» в виду, тот факт, что в сыворотке крови

' • содержатся различные белки (альбумины —

57—65%,

ос-глобулины

— 13%, Р-глобулины —

12,5%,

у-глрбулины.— 11.-19%).

В.

случае

сильного разбавления растворов белков.увеличйвается диссоциа-

ция молекул (закон Действующих -масс) преимущественно благо-

даря 'внутреннему электростатическому- отталкиванию, и -тогда

белки труднее осаждадется; при высокой конценхраций

бел&од.

растворе больше возможностей для ценообразования с последую-

щей денатурацией белковых молекул. Денатурация-также возра-

стает, если создаются реальные условия для формирования моно-

молекулярной белковой пленки на границе раздела фаз, например,

"жидкость—воздух" (учитывать свойства ПАВ у белков).

588

Способность белковых растворов увеличивать или уменьшать

диссоциацию находящихся в них солей, характеризуется диэлек-

трической постоянной таких растворов (D); чем выше полярность

молекул, тем больше D; для растворов неполярных соединений

величины D низкие. Существует обратнопропорциональная зави-

симость между D и силами электростатического притяжения и

отталйивания молекул — возрастание D сопровождается стабили-

зацией молекул, снижение D — их притяжением и агрегацией.

Напомним, что D для воды при 20°С равна — 80-:82,

*дл£

етанола

— 24, то есть в 3,5 раза меньше,, поэтому if иловый спирт исполь-

зуют в качестве фракционирующего агента белковых молекул. К

тому же он дегидратирует эти молекулы. ts

В изоэлектрической точке (pi) при данном рН, когда число

положительных зарядов белковых молекул равно общему числу их

отрицательных зарядов, белок становится наименее растворимым,

и он легче выпадает в осадок. D белковых растворов изменяется в

зависимости от "их рН и достигает максимума в изоэлектрической

точке. *

Ионная сила раствора (|i) выступает мерой интенсивности

электрического поля, создаваемого в растворе каждым ионом; ц

равна полусумме произведений молярности каждого иона (т) на

квадрат его валентности (z

• ц * _ V w.iz

. Изменяя ц, достигают более эффективного

осаждения белков. ' - .

Температура — важный фактор для сохранения белков в

нативном состоянии. При их. фракционировании стремятся под-

держивать температуру ниже

0°С,

при которой снижаются раство-

римость белковых молекул и рост случайно подавших в раствор

микроёов-контаминантов. . - ••',''.•

Известны два1способа производст&а^дС; -^ камерный-и внека-

мерный (последний применяют при крупносерийном производс%ве

препарата; он предложен

Г.

Я."

Розенбергом.в i959

г.).

Общая схема

внекамерного способа фракционирования IgG представлен ниже.

.Фракционирование, например, донорской крови включает се-

парирование-форменных элементов^о^деление'фибрйнаГполучён

ную сыворотку очищают от остатков фибриногена", балластных

белков, а затем ее передают на последующие ступени выделения

IgG. Полученный иммуноглобулин растворяют и подвергают сте-

рилизующей фильтрации.

'589

-"•••-.- ....

В целях улучшения качества продукта указанный выше метод

неоднократно модифицировали.

Сыворотка ! *

I—стадия

предвари

—

тельного осаждения

стадия первого

осаждения

этанол, 8% рН

7,2-7,3

V = -3°С

центрифугирование

супернатант

этанол, 26% рН

7,1-7,2

Г=-8° - 10'С

центрифугирование

супернатанта

осадок общих глобулинов

в центрифуге растворяют

в изотоническом растворе

натрия хлорида

-» осадок в отходы

•

Осадок (альбумин,

а-глобулин, часть

Р-глобулина)

в последующую

утилизацию

III-

стадия второго

осаждения

IV-

стадия третьего

осаждения

этанол, 17% рН

4,95-5,15

ацетатный буфер

ц=0,02;Г = -5*С

возможна +

фильтрация

центрифугат /фильтрат/

этанол, 26%

натрия бикарбонат

рН

7,2-7,3

ц=в,05;Г=-8-1(ГС

центрифугирование

Осадок Р-глобулин,

часть ос- и

у-глобулинов

на дополнитель-

ное фракциони-

рование

К иммуноглобулинам, получаемым из крови человека, относят-

ся Ig-ы: антирабический, нормальный, противогриппозный, проти-

востафилококковый, противостолбнячный, противоэнцефалитныи

(титрованный на антитела к вирусу клещевого энцефалита); из

590

крови животных получают Ig-ы, или сыворотки, содержащие Ig-ы:

антирабический, противоботулиновые, противогангренозные, про-

тиводифтерийный, противолептоспирозный, против клещевого эн-

цефалита, противосибиреязвенный, против столбняка.

Антитоксины — обычно это препараты лечебно-профилакти-

ческого действия, изготавливаемые из сывороток крови лошадей,

иммунизированных соответствующими анатоксинами (см. также

главу

9).

Схема получения антитоксинов в общем виде может быть

сведена к следующим этапам:

Выращивание токсигенных бактерий

(ботулинических, дифтерийных, столб-

нячных или других) на благоприятной

для токсинообразования жидкой

питательной среде

Иммунизация лошадей

по принятой схеме

Кровопускание (частичное

или тотальное)

Сепарирование форменных

элементов крови и

получение плазмы

Приготовление конечного

продукта

Мембранная

фильтрация

Фильтрат с содержанием

токсичного белка 0,2

—

обрабатывают водным

раствором формальдегида

0,3-

5%,

39—«ГС.рН 7,0,

в течение 21

—

35 суток

Дефибрирование плазмы

и получение анти —

токсичной сыворотки

Выделение

антитоксического Ig

Обезвреживание токсина возможно с помощью других деток-

сикаторов ([J-пропиолактон, протеазы или окислители и пр.).

В некоторых случаях отделение форменных элементов крови

осуществляют одноактно с дефибринированием крови. При этом

фибриновый сгусток включает в себя эритроциты, лейкоциты и

тромбоциты. Однако при работе с большими объемами крови

названный одноактный процесс сопровождается частичным гемо-

лизом эритроцитов, что осложняет последующую очистку антиток-

сина.

591

На практике получают от гипериммунизированных соответст-

вующими анатоксинами лошадей лечебные или лечебно-профи-

лактические антитоксические сыворотки: противоботулиновые ти-

пов А и В (в жидком виде), концентрированные жидкие противо-

гангренозные очищенные (моно- и поливалентные), противодиф-

терийную и противостолбнячную.

Очищенный сорбированный на алюминия гидроксиде столб-

нячный анатоксин применяют для ревакцинации людей, являю-

щихся затем донорами специфического Ig. Схема его выделения

аналогична той, которая описана ранее для IgG. Выпускают про-

тивостолбнячный Ig в жидком виде в ампулах.

Кроме Ig-ов другие белковые фракции сыворотки крови обла-

дают важными биологическими функциями и поэтому могут быть

выделены в очищенном виде для последующего использования в

практическом здравоохранении и медицине в целом.

Препараты из зобной железы. К ним относят тактйвин, тима-

лин, тимопоэтин и некоторые другие, получаемые методами экст-

ракции и последующей очистки из зобной железы (Glandus thymus)

крупного рогатого скота, поступающего на мясокомбинаты для

убоя и последующей комплексной переработки. Зобную железу

относят к центральным органам иммуной системы.

ней проходят

специальную обработку будущие тимоциты, приобретающие соот-

ветствующие функции (Т-хелперы, Т-супрессоры, Т-киллеры). В

этой железе содержатся гормоноподобные субстанции, которые и

составляют основу иммуностимулирующих веществ. Одна из схем

получения иммуностимуляторов из Gl. thymus представлена на

странице.

Фактор переноса,

или

лейкоцитарный трансфер-фактор (ЛТФ)

— это составная часть диализата экстракта лейкоцитов, ответст-

венная за пассивный перенос реакции гиперчувствительности

замедленного типа (ГЗТ) от сенсибилизированных лиц-доноров к

несенсибилизированным реципиентам. Впервые открыт К. Ланд-

штейнером и М. Чейзом в 1942 г. в лейкоцитах морской свинки.

ЛТФ является медиатором клеточного компонента иммунной сис-

темы и его можно причислить к лимфокинам; вырабатывается

нормальными лимфоидными клетками. Кроме индукции кожных

реакций (ГЗТ) он тормозит миграцию клеток и вызывает транс-

формацию лимфоцитов. ЛТФ не является антителом, не обладает

иммуногенностью и не проявляет свойств трансплантационного

антигена. Он устойчив к ДНК-азе, РНК-азе и трипсину, но термо-

лабилен (инактивируется при 56°С в течение 30 мин.). В составе

592

ЛТФ обнаружены полипептиды и олигонуклеотиды, ММ менее 10

кДа, хорошо растворим в воде.

Ткань зобной железы

Гомогенизация в

3 М

КС1

в ФСБ

с последующим

выдерживанием

при4*С 12-16ч.

Центрифугирование

(20—40 тыс. g

1-2ч.)

Диализ супернатанта против

водопроводной воды

(примерно Зч.),

затем против ФСБ

(1 сутки)

Концентрирование до

1/10 объема

Осадок лиофильно

высушивают и хранят

при t" ниже 0*С

(предпочтительнее при

-25'С)

Выделение иммуностимулирующих средств ("суммарный препарат") из ткани

зобной железы крупного рогатого скота (ФСБ — фосфатно-солевой буфер)

Под влиянием ЛТФ отрицательная ГЗТ переходит в положи-

тельную. Такой эффект одной дозы фактора переноса продолжа-

ется до 6 месяцев. В настоящее время за одну дозу ЛТФ принято

его количество, получаемое из 10

лимфоцитов. ЛТФ можно

применять в больших дозах в течение нескольких месяцев при

иммунодефицита*.

Схема получения фактора переноса заключается в следующем.

От здоровых доноров с выраженной реакцией ГЗТ на соответст-

вующий антиген отбирают кровь в асептических условиях. Кровь

собирают в стерильные емкости, куда добавляют антикоагулянт

гепарин и 6% раствор декстрана 250 в 0,15 М натрия хлорида (из

расчета 500 ME гепарина и 10 мл декстрана на каждые 100 мл

крови). Емкость закрывают, несколько раз встряхивают и термо-

593

Соотношение

ткань/среда

1:5-1:10

статируют при 37°С. Осаждение эритроцитов по времени не

должно продолжаться более часа. Надосадочную жидкость цент-

рифугируют в асептичных условиях (1500 g 10 минут), плазму

осторожно сливают (декантируют). Остающийся осадок включает

эритроциты, на поверхности которых располагается слой лейко-

цитов (1 мл осевших лейкоцитов соответствует примерно 10

клеток, что достаточно для получения 1—10 доз ЛТФ). Из числа

белых клеток этого слоя

70%

приходится на лимфоциты. На осадок

осторожно наслаивают

0,15

М стерильный раствор натрия хлорида,

приготовленный на апирогенной воде (0,5 мл на 100 мл крови), и

осторожно отсасывают лейкоциты в виде суспензии в изотониче-

ском растворе NaCl. Полученную суспензию замораживают

смесью сухого льда с этанолом и размораживают при 37°С деся-

тикратно (до полного разрушения лейкоцитов). В полученный

вязкий раствор добавляют ДНК-азу и катионы магния для гидро-

лиза ДНК при 37°С (эта процедура возможна в процессе замора-

живания и оттаивания, поскольку ДНК-аза стабильна в таких

условиях). Деполимеризованныи экстракт лейкоцитов диализуют

против дистиллированной воды (на 1 л экстракта берут 50 мл

дистиллированной воды) в течение суток при +

4°С,

после чего его

подвергают фильтрующей стерилизации через мембранный

фильтр и лиофильно высушивают.

Полученный диализат экстракта лейкоцитов растворяют в сте-

рильном фосфатно-солевом буфере с рН 7,4 (0,01 М фосфатный

буфер +8,5 г/л NaCL) в соотношении 1:20 и асептично подают на

хроматографическую колонку, заполненную сефадексом G-25, ра-

нее законсервированную 0,2% натрия азидом и промытую тем же

ФСБ,

разведенным в 20 раз.

Хроматографию проводят в указанном выше стерильном бу-

фере со скоростью до 90 мл/час. Собирают активные фракции

(восстановление способности лимфоцитов к розеткообразованию

трипсинизированных эритроцитов барана в присутствии фактора

переноса) — это и есть ЛТФ.

ЛТФ не рекомендуют применять при кандидозах кожи и сли-

зистых оболочек, кокцидиоидозе, лепре, туберкулезе и остеоген-

ной саркоме.

Специфические опухолевые вакцины, а таже иммунная РНК

(И

= РНК) еще не вышли за пределы лабораторий, поэтому их

крупномасштабное производство пока не освоено.

594