Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

В производственных условиях основной технологический про-

цесс с участием иммобилизованных ферментов проводят, как

правило, в проточных биореакторах (колоннах), в которых биока-

тализатор может быть в виде неподвижного или перемешиваемого

слоя; в биореакторах со взвешенным слоем объединены принципы

двух предыдущих аппаратов (рис. 138).

Рас.

138. Биореакторы

I—V типов, используемых в

инженерной энзимологии: I

— периодического действия

(1 — биореактор, 2

—

мешал-

ка, 3 — иммобилизованный

фермент), II — проточный с

перемешиванием

(1 —

биоре-

актор, 2 — мешалка, 3 — им-

мобилизованный фермент, 4

— вход субстрата, 5

—

выход

целевого продукта), Ш — с

подвижным ферментным

слоем, IV — со взвешенным

слоем, V

—

с рециркуляцией

(для

III—V:

— колонна, 2 —

иммобилизованный фер-

мент, 3 — вход субстрата, 4

— выход целевого продукта,

5 — рециркуляция).

Если профиль водного раствора субстрата распространяется

(течет) равномерно по всему сечению аппарата, то такой реактор

функционирует по "поршневому типу". При этом концентрация

субстрата максимальна на входе в аппарат, а концентрация целе-

вого продукта — на выходе из аппарата. Реактор IV типа напоми-

нает хемостат для культивирования микробов (удобен для контроля

рН,

температуры). Если конечный продукт может выступать инги-

битором фермента, то в подобных случаях удобна конструкция III,

если же при определенных условиях ингибитором оказывается

субстрат, то лучше использовать конструкцию I. В IV реакторе

поток раствора субстрата должен быть таким, чтобы постоянно

удерживать фермент во взвешенном состоянии и не уносить его

с выходящим потоком раствора целевого продукта.

Крупномасштабное производство приходится в основном на

такие гидролазы, как протеазы и гликозидазы. Различают три

категории протеаз — сериновые, кислые и металлопротеазы. Пер-

вые термостабильны, оптимум рН для них выше 8,0. Поэтому

сериновые протеазы широко используют в моющих средствах.

Основными продуцентами этих ферментов являются бациллы.

465

Кислые протеазы имеют рН-оптимум

1,5—3,7.

Они полезны в

изготовлении сыров. Их продуцируют, например, различные виды

низших грибов (Mucor, Endothea и

др.).

Грибной реннин с успехом

заменяет сычужный фермент из желудков телят. Однако необхо-

димо подчеркнуть, что рекомендации использовать термофильный

штамм вида Mucor pusillus, образующего реннин, должны быть

восприняты с большой осторожностью, поскольку из научной

литературы и медицинской практики известно, что этот вид может

вызывать заболевания у людей (мукороз, или мукоромикоз).

Металлопротеазы

оптимумом рН в нейтральной зоне (6,5—7,5)

применяют в пищевой промышленности. Их основными продуцен-

тами являются бациллы.

Из гликозидаз большое значение приобрели грибные и бакте-

риальные амилазы, катализирующие реакции гидрол*иза крахмала.

Сегодня в мире организовано крупнотоннажное производство

глюкозо-фруктозных сиропов на основе эксплуатации иммобили-

зованной глюкозоизомеразы, обеспечивающей превращение глю-

козы во фруктозу (рис. 139). Фруктоза (левулеза) слаще глюкозы

и такими сиропами заменяют сахарозу в соответствующих видах

подслащенных или сладких изделий пищевых продуктов. Следует

иметь в виду возможность получения фруктозных сиропов из

жидких отходов в производстве декстрана, где до сих пор на

заводах в странах СНГ фруктоза "уходит в трапы".

Пектиназы успешно применяют при изготовлении фруктовых

соков. Эти ферменты включают комплекс индивидуальных биока-

тализаторов: пектинлиаз, пектатлиаз и полигалактуронидаз (пек-

тинэстераз). С их помощью осветляют и снижают вязкость соков

Рис. 139. Технологическая схема

трансформации глюкозы во фруктозу с

помощью иммобилизованной глюкозоизо-

меразы: 1 — емкость для приготовления

раствора глюкозы, 2

—

теплообменники, 3

— биореакторы с иммобилизованной глю-

козоизомеразой, 4 — реактор для глюко-

зо-фруктозного раствора с системой регу-

лирования рН, 5

—

установка для обесцве-

чивания раствора углем, 6, 8 — сборники

раствора, 7 — фильтр, 9 — ионообменные

колонны, 10 — вакуум-выпарная установ-

ка, 11 — сборник глюкозо-фруктозного

сиропа (по М. Е. Бекеру, Г. К. Лиепиньшу,

Е. П. Райпулису, 1990).

466

благодаря гидролизу пектина, что весьма важно при концентриро-

вании

соков.

Основным продуцентом пектиназ является Aspergillus

niger.

В промышленных условиях производят и другие ферменты,

названные в таблице 47.

Т а б л и ц а 47. Промышленноважные микробные ферменты и их продуценты

I Фермент

Гидролазы

Гликозидазы:

а-Амилаза

Р-Глюканаза

Глюкоамилаза

Глюкоизомераза

Декстраназа

Инвертаза

Лактаза

Пектиназы

Протеазы

Липазы

Пенициллиназа

(пеницилдинацилаза,

пенициллинамидаза)

Продуцент

Asp.niger, Asp. oryzae, Bac.amyloliquefaciens,

Вас.

1 icheniformis

Asp.niger, Bac.amyloliquefaciens

Asp.niger, Rhizopus niveus, Endomycopsis sp.

Astinoplanes missouriensis, Arthrobacter sp., Вас.

coagulans, Streptomyces sp.

Penicillium sp.

Asp.

sp., Saccharomyces cerevisiae

Asp.

niger, Kluyveromyces marxianus

Asp.

awamori, Asp. niger, Klebsiella pneumoniae

Asp.

niger, Asp. oryzae, Алкалифильные бациллы,

Вас.

amyloliquefaciens, Вас. licheniformis, Вас.

stearothermophilus

Asp.

awamori, Asp. oryzae, Candida cylindrica, Mucor

miehei, Rhizopus sp.

Eschericliia coli

467

Другие белки и белковые продукты.

Токсины и анатоксины. Отдельные виды болезнетворных мик-

роорганизмов образуют экзотоксины, которые могут быть отнесе-

ны к "факторам агрессии". Они представляют собою высокополи-

мерные термолабильные белки — продукты матричного синтеза,

секретирующиеся в окружающую среду. При попадании в орга-

низм человека экзотоксины вызывают серьезные повреждения

функций определенных тканей или систем. Например, столбняч-

ный токсин относят к числу нейротоксинов, нарушающих функ-

цию нервно-мышечного аппарата; гангренозные токсины являются

некротоксинами, индуцирующими повреждение тканей; экзоток-

сины определенных штаммов кишечной палочки повреждают ки-

шечник и т. д. По механизму действия на ткани они сходны с

ферментами. Некоторые токсины применяют для диагностики

соответствующих заболеваний. Например, токсин дифтерийный

рекомендуют для постановки внутрикожной реакции Шика. Ток-

син изготавливают по обычной схеме выделения экзобелков из

жидких питательных сред после выращивания определенных

штаммов дифтерийных бактерий. Препарат для реакции Шика

готовят из очищенного дифтерийного токсина, разводя его глице-

рин о-желатиновой смесью до необходимой концентрации (1/40

часть одной смертельной дозы для морских свинок — одна Шик-

доза).

Выпускаемый препарат — бесцветная прозрачная жидкость

в ампулах по 1 мл. Срок годности — 2 года, хранят при 3—10°С.

Обработка экзотоксинов формалином сопровождается их пол-

ным обезвреживанием при сохранении антигенных свойств. Обез-

вреженные токсины называют анатоксинами, или токсоидами. Их

используют для получения антитоксических сывороток (глобули-

нов) . В

практике здравоохранения находят применение следующие

анатоксины: ботулинический, гангренозный, дифтерийный, стафи-

лококковый, столбнячный.

Технология получения экзотоксинов включает следующие ста-

дии: культивирование соответствующего штамма патогенного мик-

роба-продуцента на определенной питательной среде и при опти-

мальных режимах (рН, температура, аэрация или анаэробиоз,

продолжительность выращивания), обезвреживание формалином

при 37—40°С, сепарирование клеток (отход) от культуральной

жидкости, содержащей анатоксин; очистка, концентрирование,

добавление адсорбента, фасовка, упаковка.

В качестве адсорбентов обычно используют неорганические

вещества — алюминия гидроксид, алюминия фосфат, кальция •

468

фосфат и

т.

п. (в России применяют гидроксид алюминия), которые

создают депо в организме при введении анатоксинов. Таким

образом, удается повысить эффективность иммунизации.

Очищенные адсорбированные анатоксины — это жидкие пре-

параты-суспензии, расслаивающиеся на белый, светло-коричне-

вый или желтоватый осадок и прозрачную надосадочную жид-

кость.

Ботулинические и гангренозные анатоксины применяют для

иммунизации лошадей в целях получения специфических лечеб-

ных иммунопрепаратов.

Дифтерийный анатоксин рекомендуют в качестве профилак-

тического антидифтерийного средства для активной иммунизации.

Его выпускают в виде монопрепарата и в составе ассоциированных

вакцин и в каждом из них токсин адсорбирован на гидроксиде

алюминия. Монопрепарат— адсорбированный дифтерийный, или

АД-анатоксин

—

представляет собой очищенный концентрирован-

ный продукт, содержащий в

мл

антигенных (флоккулирующих)

единиц анатоксина и не свыше 2 мг адсорбента. Флоккуляция —

это реакция взаимодействия дифтерийного анатоксина или токси-

на с антитоксином (иммунной сывороткой). Флоккулирующая

единица — это минимальное количество антигена (токсина), обра-

зующего флоккулят (от лат. flocculi — клочок).

АДС-анатоксин — это ассоциированный препарат из очищен-

ных концентрированных дифтерийного и столбнячного анатокси-

нов,

адсорбированных на А1(ОН)

и содержащих в 1 мл 60 анти-

генных единиц дифтерийного анатоксина и 20 единиц (антиток-

синсвязывающих) столбнячного анатоксина и не более 2 мг адсор-

бента. Известен и другой вариант препарата с содержанием в

мл

тех же ингредиентов в соотношении 1:1, адсорбент, как и в первом

варианте.

АКДС-вакцина - ассоциированный препарат, включающий те

же вещества, что и АДС-анатоксин, а также коклюшную вакцину.

В 1 мл такой вакцины содержатся дифтерийный и столбнячный

анатоксины по

антигенных единиц соответственно, не более

2 мг алюминия гидроксида и 20 млрд. клеток коклюшных бактерий,

убитых формалином или мертиолатом. Мертиолат используют как

консервант в концентрации

0,01%;

в 0,5 мл вышеназванных пре-

паратов содержится одна прививочная доза. Перед употреблением

их необходимо взбалтывать. Форма выпуска — ампулы с 1 мл

препарата. Хранят ампулы с АД- и АДС-анатоксинами при

3—10°С

до 3 лет (срок повторного контроля и определения возможности

469

дальнейшего хранения еще в течение

года). Что касается АКДС-

вакцины, то ее срок хранения в тех же условиях сокращается в 2

раза, т. е. до 1,5 лет с вероятностью продления его на 6 месяцев

после переконтроля. Прививки делают согласно схеме, утвержден-

ной МЗ России.

В 1994 г. в Канаде введена в практику пентавалентная вакцина

против коклюша, дифтерии, столбняка, полиомиелита и заболева-

ний, вызванных гемофильной палочкой серотипа b(Hib).

Дифтерийный анатоксин, как монопрепарат используется так-

же для гипериммунизации лошадей в целях получения лечебной

противодифтерийной сыворотки, содержащей антитоксический

иммуноглобулин.

Профилактику столбняка осуществляют либо одним столбняч-

ным анатоксином (20 ЕС в

мл с адсорбентом), либо в ассоциации

с другими препаратами, в частности, его применяют в составе

АДС-анатоксина и АКДС-ващины (см. выше), а также в составе

ТАВТе-вакцины — "химической" сорбированной тифо-паратифоз-

но-столбнячной вакцины, содержащей по 0,2 мг брюшнотифозного

и А-паратифозного, 0,25 мг В-паратифозного антигенов, 10 ЕС

столбнячного анатоксина и 1,5—2 мг

А1(ОН)

Выпускают во фла-

конах, содержащих 8 мл препарата для инъекций, и консервант

мертиолат. Срок хранения — 3 года при

8—10°С

(срок переконт-

роля с возможностью хранения еще в течение 1 года). Иммуниза-

цию людей проводят по схеме, утвержденной МЗ России.

Столбнячный анатоксин, реже — токсин используют для ги-

периммунизации лошадей в целях изготовления противостолбняч-

ной сыворотки, содержащей антитоксический иммуноглобулин.

Иммунопрепарат используют в качестве лечебного и экстренно-

профилактического средства.

Стафилококковый анатоксин представляет собой стерильный

фильтрат бульонной культуры золотистого стафилококка, содер-

жащий экзотоксин, обезвреженный формалином. Количество ток-

сина в такой жидкости должно быть не менее

ЕС в

мл препарата;

консервант не добавляют. В готовом виде нативный стафилокок-

ковый анатоксин — прозрачная желтоватая жидкость для подкож-

ного введения. Форма выпуска — ампулы по 2 мл. Из этого

анатоксина получают очищенный адсорбированный анатоксин

осаждением трихлоруксусной кислотой с последующей очисткой

этанолом и адсорбцией на гидроксиде алюминия. В

мл препара-

та-суспензии содержится 10 ЕС.

470 '

Токсические белки энтомопато генных

бацилл.

Некоторые энтомопатогенные бациллы применяют в качестве

биологических средств защиты и борьбы с вредными насекомыми

(от греч. entomon-насекомое). К их числу относят Вас. popilliae и

Вас.

thuringiensis, образующих в процессе спорообразования так

называемые параспоральные белковые кристаллы. Синтез такого

белка находится под контролем промотора гена, содержащегося в

плазмиде.

Вас.

popilliae способна вызывать хроническое инфекционное

заболевание у насекомого, передающееся другим особям и распро-

страняющееся среди популяции.

Вас.

thuringiensis токсический параспоральный белковый кри-

сталл действует на вредных насекомых как пестицид. К сожалению,

во внешней среде этот токсин длительно не сохраняется, поэтому

требуются повторные обработки данной культурой территорий с

вредными насекомыми.

Вас.

popilliae и родственные ей микробы (Вас. lentimorbus, Вас.

euloomarhae и др.) индуцируют так называемую молочную болезнь

у жуков-скарабеев. Эти виды бацилл трудно культивировать на

искусственных питательных средах, но все же удается, если под-

держивать анаэробные

условия.

Собирают спорулирующую массу,

споры сепарируют, смешивают с наполнителем, фасуют и упако-

вывают. Применяют в виде порошка - дуста. Споры Вас. popilliae

заглатываются личинками насекомых, прорастают в кишечнике и

делятся, давая потомство. Бактерии попадают в гемолимфу и через

10 дней у насекомых возникают признаки молочной болезни.

Клетки затем спорулируют, образуя к моменту гибели одной

личинки порядка 5«10

спор.

Препарат на основе Bac.popilliae длительное время изготавли-

вают в США в целях контроля численности японского жука—

Popillia japonica.

В России изготавливают препараты (дендробациллин, инсек-

тин, токсобактерин, энтобактерин-3 и др.) на основе Вас.

thuringiensis. Данный вид микроба образует два токсина — р и 6,

из которых Р-экзотоксин обладает широким спектром действия на

насекомых; он представляет собой адениннуклеотид, конкурентно

ингибирующий ферменты, которые катализируют реакции гидро-

лиза АТФ и пирофосфата.

471

При введении Р-токсина млекопитающим животным он оказы-

вается для них губительным. Поэтому в производстве используют

штаммы, не продуцирующие Р-экзотоксин, но образующие

8-ток-

син, который и представляет собой белковое кристаллическое

вещество - "параспоральное тело" - правильный восьмигранник.

Чтобы проявить токсичность, 6-токсин должен попасть в кишечник

личинок насекомых прежде всего - листогрызущих из отряда

чешуекрылых Lopidoptera), где растворяется в щелочной среде и

частично гидролизуется протеазами. Такой модифицированный

белок взаимодействует со стенкой кишки и изменяет ее так, что

содержимое кишечного тракта попадает в кровоток, вызывая

общий паралич. Смерть личинок наступает от септицемии.

5-Токсин безвреден для млекопитающих животных, человека,

птиц.

литературе о Вас. thuringiensis описано более 20 серотипов

(сероваров) микроба и 15 вариантов 5-токсина, часть из которых

имеет промышленное значение, например, thuringiensis или

berliner(I), alesti(III), dendrolimus(IV), galleria(V) и др.

Коммерческие препараты представляют собой сумму спор и

белковых кристаллов в клетках микроба-продуцента.

Технология получения энтомопатогенных препаратов включает

следующие стадии: 1) проверка маточной культуры на отсутствие

свободного фага, продуктивность спор и кристаллов, на вирулен-

тность; 2) выращивание культуры в колбах до титра спор не менее

1,7* 10

в 1 мл; 3) пересев культуры из колб в посевной аппарат

(0,05%

на объем среды); 4) засев посевным материалом основного

ферментатора (вносят 0,0012% инокулюма от объема среды в

биореакторе). Продолжительность выращивания в посевных и

головных ферментаторах - 35-40 часов при 28-30°С (исходное

значение рН 6,3) до получения указанной выше плотности спор в

1мл среды. В процессе культивирования среда защелачивается до

рН 8, 0-8, 5, поэтому перед тем, как передать ее на сепарирование,

рН доводят до

6,0-6,2

подкислением. После сепарирования получа-

ют пасту (в среднем 100 кг из 1м

культуральной жидкости) с

влажностью 85% и содержанием спор 2

•

в 1 г.

Готовый продукт может быть в виде стойкой вязкой жидкости

кремового или светло-серого цвета, без запаха •< она содержит

наполнитель

—

кристаллическую микроцеллюлозу; другой вариант

- смачивающий порошок, приготовленный после высушивания на

распылительной сушилке (остаточная влажность 10%) и смешения

с каолином. Концентрация спор в препаратах 3

•

в 1 г.

472

Белки одноклеточных и многоклеточ-

ных микроорганизмов

На белки приходится часть сухих веществ микробной клетки

от 19 до 90% (таблица 48).

Таблица48. Содержание белка

от сухой массы) в клетках

некоторых бактерий и грибов

Микроорганизм

Aspergillus flavus

Aspergillus niger

Rhizopus nigricans

Penicillium notatum

Bacillus megaterium

Candida arborea

Lactobacillus casei

Candida utilis

Hansenula suaweolens

Бе-

лок,

Микроогранизм

Rhodotorula rubra

Saccharomyces cerevisiae

Streptomyces griseus

Bacillus subtilis

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Lactobacillus fermentans

Methanobacterium sp.

Бе-

лок,

Следовательно необходимо иметь в виду, что в случае исполь-

зования микробной биомассы как белкового продукта, фактически

имеют дело с суммой различных веществ (в том числе — небелко-

вых, содержащихся в клетках). Не существует природных белков

с эквимолярным количеством составляющих его аминокислот, но

их (аминокислот) относительное содержание является строго оп-

ределенным для каждого белка.

На практике чаще прибегают к использованию убитых клеток

в качестве белкового продукта, так как любые методы выделения

протеинов из клеточной биомассы сопровождаются незначитель-

ным выходом целевого продукта.

473

В разные годы и в разных странах применяли следующие

микроорганизмы как источники белка: Saccharomyces cerevisiae,

Candida utilis, Fusarium graminearum, Methylomonas clara, Candida

tropicalis (апатогенные штаммы), Candida maltosa, Hansenula sp. и

др.

Выращивание производили и производят на различных средах,

нередко используя отходы или конечные продукты в других про-

изводствах (деревообрабатывающей промышленности

—

сульфит-

ные щелока, сельского хозяйства — меласса, гидролизаты соломы,

кукурузных кочерыжек и пр., нефтеперерабатывающей промыш-

ленности — н-алканы,

—Cm;

спиртовой промышленности —

этанол; газовой промышленности — метан).

Пивные

дрожжи

с разной интенсивностью стали использовать

в пищу с конца

XIX

в.,

особенно

—

в периоды разрухи и недостатка

пищевых продуктов, например, во времена первой и второй миро-

вых войн. В 1980 г. в Англии был разрешен к использованию в

пищу микопротеин — мицелий гриба Fusarium graimnearum, тек-

стура которого удобна для включения различных наполнителей и

формования, например, мясоподобных изделий.

Технология получения кормового или пищевого белка однокле-

точных и многоклеточных микроорганизмов сравнительно неслож-

ная и заключается в наращивании по возможности наибольшего

количества биомассы клеток, ее денуклеинизации, сепарировании

и приготовлении целевого продукта. Культивирование того или

иного микроорганизма проводят в оптимальных условиях (до

получения десятков-сотен граммов дрожжей в

1 л)

в периодическом

или непрерывном режиме, в стерильных или нестерильных усло-

виях; денуклеинизацию клеточной биомассы можно проводить

различными способами — экстракцией метанолом или щелочами,

обработкой нуклеазами, температурным шоком для активизации

эндонуклеаз (в частности — РНКазы); отделением белка от нукле-

иновых кислот из дезинтеграта клеток. Повышенное количество

нуклеиновых кислот в белке нежелательно из-за возможного

повышения мочевой кислоты in vivo и, как следствие, потенциаль-

ное возрастание опасности заболеть подагрой и почечно-каменной

болезнью (содержание нуклеиновых кислот в микробном протеине

не должно превышать 2 г в сутки).

Известны различные коммерческие белковые продукты, изго-

тавливаемые в промышленности тех или иных стран мира

(таблица 49).

474