Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Вакцины из продуктов метаболизма патогенных микроорга-

низмов

Анатоксины (токсоиды) — см. раздел "Токсины и

анатоксины" в данной главе.

Вакцины вирусные.

По аналогии с бактериальными вакцинами вирусные также

подразделяют на живые и инактивированные. Для

приготовления обоих типов вирусных вакцин необходимо нако-

пить вирусный материал (вирионы), используя либо куриные

эмбрионы, либо культуры тканей из почек обезьян, куриного

эмбриона, диплоидных клеток человека. Так вакцинный вирус

гриппа (авирулентный) накапливают в аллантоисной жидкости

эмбриона, которую затем отсасывают и центрифугируют. Если

предполагают готовить живую вакцину, то вирус суспендируют и

разводят до нужной концентрации и подвергают лиофильному

высушиванию.

Для получения вакцины против желтой лихорадки также зара-

жают куриный эмбрион, в нервных тканях которого накапливается

патоген (аттенуированный штамм 17 D). Последующие этапы

технологии получения вакцины заключаются в гомогенизации

эмбриона в стерильной

воде,

получают "пюре", которое центрифу-

гируют, осадок представляет отход, а надосадочную жидкость,

содержащую вирус, лиофильно высушивают.

Культуры тканей, зараженные вирусами, выращивают в жид-

ких средах, поэтому вирусный материал можно получить после

фильтрации культуральной жидкости. Учитывая тот факт, что

вакцинные штаммы вирусов являются, как правило, аттенуирован-

ными, то стадия инактивации при их изготовлении отпадает сама

собой. Однако, имеются исключения из этого правила — вакцины

против бешенства и полиомиелита; первую инактивируют 3-про-

пиолактоном, вторую — либо Р-пропиолактоном, либо формали-

ном.

Очищенный вирусный материал, готовый для приготовления

вакцин, или готовые вирусные вакцины сохраняют при -70°С.

Вирусные вакцины не сочетают в себе разные виды, но,

например, инактивированная и живая полиомиелитные вакцины

или убитая гриппозная вакцина почти всегда содержат разные

серотипы вирусов.

Живые ослабленные вирусные вакцины в виде суспензий

теряют свою потенциальную активность достаточно быстро, поэ-

тому их сохраняют либо в замороженном состоянии, или добавля-

ют стабилизаторы — сахарозу, магния хлорид.

Живыми вирусными вакцинами являются: гриппозные интра-

назальные для детей и взрослых (профилактические), гриппозная

пероральная для детей и взрослых (лечебно-профилактическая),

485

против желтой лихорадки, коревая, против краснухи, полиомие-

литная пероральная, против свинки.

К инактивированным вирусным вакцинам относятся: антира-

бические сухая МИВП и типа Ферми, против клещевого энцефа-

лита.

Субъединичные, или расщеп л.е иные вак-

цины. Такие вакцины можно получать из оболочечных вирусных

конъюгированных или неконъюгированных белков. Пока внедре-

на в производство лишь субъединичная гриппозная вакцина, вклю-

чающая гликопротеин-гемагглютинин из одного или нескольких

штаммов вируса. Клиническим, испытаниям подвергаются вариан-

ты субъединичных вакцин вируса иммунодефицита человека, уси-

ленные мурамилди- и мурамилтрипептидами.

Технология получения гемагглютинина из гриппозных вирио-

нов заключается в следующем: накопленный вирусный материал

в аллантоисной жидкости куриного эмбриона сепарируют, подвер-

гают микрофильтрации и фильтрационному концентрированию

примерно в 50 раз, при необходимости дополнительно очищают

ультрацентрйфугированием в градиенте плотности сахарозы; кон-

центрированный вирионный материал обрабатывают катионным

ПАВ и отделяют гемагглютинины ультрафильтрацией с последую-

щими диализом и стерилизующей фильтрацией. На последней

стадии стандартизируют и контролируют субъединичную вакцину

(особенно — на отсутствие живых гриппозных вирусов).

Генно-инженерные вакцины

Биотехнология таких вакцин базируется на возможности пере-

носа фрагментов хромосомной ДНК или плазмид из бактерий или

вирусов в клетки других видов бактерий или дрожжей, то есть не

в природные для них реципиентные клетки. Таким путем создана

возможность продукции поверхностного антигена вируса гепатита

В (HBsAg) дрожжевыми клетками. Этот антиген отделяют от

дрожжей-продуцентов и используют для приготовления вакцины.

рДНК-биотехнология в этом направлении "становится на ноги"

и за ней большое будущее на пути создания генно-инженерных

вакцин, а также белковых иммуногенов и других белков, включая

стафилококковый белок А и стрептококковый белок М.

На подходе к широкому внедрению вакцины против некоторых

протозойных инфекционных заболеваний (например, малярии).

Диагностикумы

Диагностические приемы при инфекционных заболеваниях

могут быть сведены к серодиагностике, аллергодиагностике и

фагодиагностике, если иметь в виду лишь использование биопре-

паратов. Серодиагностику выполняют с сыворотками крови, при-

меняя соответствующие антигенные препараты, называемые

диагностикумами; аллергодиагностику проводят в форме

486

аллергических проб с аллергенами на людях (на животных — в

эксперименте или при наличии у них инфекционных заболеваний);

фаги оценивают по логическому действию на чувствительные

клетки соответствующих видов бактерий. Аллергены и бактерио-

фаги выделены в самостоятельные подразделы (см.).

Диагностикумы могут представлять из себя убитые клетки с

выраженной чувствительностью к специфическим антителам, а

также отдельные, хорошо изученные антигенные компоненты. Так

у энтеробактерий известны Н-, О- и\ Vi-антигены, из которых

первый термолабилен, второй и третий — термостабильны. На

этом основано их выделение из клеток. Жгутиковый Н-антиген

изолируют

помощью

0,2%

раствора формалина спустя сутки после

его добавления и выдержки при 37°С; О- и Vi-антигены экстраги-

руют при повышенных температурах водой или другими раство-

рителями. Такие антигены используют как таковые или в адсор-

бированном виде на эритроцитах, предварительно обработанных

таннином или формалином.

Бактериальные и эритроцитарные диагностикумы применяют

соответственно в реакциях агглютинации и гемагглютинации.

Для диагностики сифилиса выпускают кардиолипиновый анти-

ген для реакции микропреципитации. Этот антиген включает 3

очищенных липида: 0,03%

1,3-дифосфатглицерина

(кардиолипин),

0,27% фосфатидилхолина (лецитин) и 0,9% холестерина в абсолют-

ном этаноле. Препарат выпускают в ампулах по 2 мл. Срок

хранения — 4 год. Инактивированные вирусные диагностикумы

используют в реакциях связывания комплемента, нейтрализации

и торможения гемагглютинации.

Кроме вышеназванных диагностикумов производят: единый

бруцеллезный диагностикум из убитых фенолом бруцелл и под-

крашенный метиленовым синим; гриппозный диагностикум в виде

взвеси инактивированных формалином или мертиолатом вирионов

в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов; диагностикум инак-

тивированного вируса клещевого энцефалита (суспензия мозга

белых мышей, зараженных этим вирусом); эритроцитарный Vi-ди-

агностикум, содержащий Vi-антиген Salmonella typhi, и О-диагно-

стикум сальмонеллезный, включающий

О-антиген

из разных групп

сальмонелл.

Аллергены

Аллергень! по своему происхождению подразделяют на микро-

бные, растительные и животные. Их используют для диагностики

патологических: процессов, в развитии которых заметную роль

играет сенсибилизация макроорганизма соответствующим антиге-

ном-аллергеном.

Микробные аллергены изготавливают разными способами. На-

тивные аллергены — это взвесь убитых бактерий и растворимых

487

продуктов их метаболизма; очищенные аллергены — это осажден-

ные и лиофильно высушенные термостабильные фракции фильт-

ратов 5—6 суточных бульонных культур бактерий, в которых

содержатся свыше 80% белков, около 7% углеводов и до 10%

нуклеиновых кислот.

К разряду бактериальных относятся аллергены: антраксин,

бруцеллин, дизентерии, дифтероида, листерийный, малеин, ката-

ральной нейссерии, лепромин, орнитозный, палочки дифтерийной

нетоксигенной, кишечной палочки, ложнодифтерийнрй палочки,

синегнойной палочки, пестин, стафилококковые видовые, стреп-

тококковые видовые, токсоплазмин, энтерококковый, альттубер-

кулин Коха, туберкулин очищенный (PPD-Л), туберкулин очищен-

ный сухой (PPD), тулярин и др.

Грибковые аллергены обычно выделяют из клеток зрелых

культур, реже — из культуральных жидкостей. Они представляют

собой белково-углеводные комплексы. Выпускают их в ампулах по

1 мл.

Из грибковых аллергенов известны: бластомицин, гистоплаз-

мин, кандидин, кокцидиоидин, а также аллергены из некоторых

плесневых грибов (аепергиллов, пенициллов) и дерматофитов.

Бактериофаги

Бактериофаги используют для фаготипирования бактерий и с

лечебно-профилактическими целями.

Для индикации бактерий изготавливают так называемые видо-

вые и типовые фаги: брюшно-тифозные Vi-типовые, дизентерий-

ные индикаторные, паратифозные В-типовые, сальмонеллезный

идикаторный, стафилококковые типовые.

Фаги для профилактики и лечения инфекционных заболеваний

выпускают моно- и поливалентными, их нельзя подменять диагно-

стическими фагами, равно как и наоборот

—

диагностические фаги

нельзя использовать вместо лечебно-профилактических фагов. Из

числа последних отечественные предприятия выпускают жидкие

моновалентные стафилофаги, стрептококковый фаг, фаг пиоциа-

неус,

фаги протейный и коли-протейный, коли-фаг, поливалентный

дизентерийный (жидкий, сухой и в суппозиториях), поливалентные

сальмонеллезные (жидкий и сухой).

Производство фагов основано на заражении бактериофагами

чувствительных бульонных культур определенных видов и штам-

мов.

"Вегетация" фагов сопровождается при этом лизисом бакте-

риальных клеток. От части нелизировавшихся клеток и клеточного

детрита освобождаются стерилизующей фильтрацией. Фаги про-

ходят через фильтр, фильтраты тестируют по эталонным культурам

чувствительных бактерий.

жидкие препараты лечебно-профилактических фагов можно

добавлять консерванты.

488

Глава 10.

ФИТОБИОТЕХНОЛОГИЯ

Фитобиотехнология — составная часть биотехнологии. Объек-

тами ее являются клетки и ткани растений — фотоавтотрофных

эукариот, а также биоактивные молекулы растительного проис-

хождения (ферменты, нуклеиновые кислоты, стероиды и некото-

рые другие сложные органические вещества). Следует обратить

внимание на тот факт, что растительные клетки в культуре обычно

являются хемогетеротрофамй.

Название фитобиотехнология слагается из четырех слов гре-

ческого происхождения: phyton — растение, bios — жизнь, teken

— искусство, logos — наука, слово. Следовательно, это наука об

использовании растительных объектов в технике и промышленном

производстве. На первый взгляд выращивание растений (злаковых,

лекарственных, декоративных и

т.

д.)

в полевых условиях подпадает

под рубрику "фитобиотехнология", однако, как и с животными,

здесь отсутствуют специфические методы промышленного куль-

тивирования цельных растений в биореакторах. Таким образом, к

фитобиотехнологическим процессам относят те из них, которые

базируются на клеточном уровне, если даже клетки несут генети-

ческую информацию, воспринятую ими в результате генно-инже-

нерного эксперимента,

Клетки и ткани высших растений, выращиваемые на питатель-

ных средах in vifro в строго контролируемых условиях, все шире

используют в фитобиотехнологии. Общирное царство растений

—

потенциально неограниченный источник клеток и тканей, которые

могут быть введены в культуру и, как следствие, существуют

неограниченные возможности для создания новых фитобиотехно-

логических процессов, в которых нуждается человечество.

настоящее время царство растений на земном шаре включает

порядка 300 000 видов. От рационального и бережного отношения

к растениям зависит благополучное выживание человечества на

планете Земля.

Представители царства растений (Plantae)

Надцарство — Eucaryota

Царство — Plantae

Отделы: 1. Водоросли — Algae

Типы: а) Красные — Rhodophyta .

б) Золотистые — Chrysophyta

489

в) Желтозеленые — Xanthophyta

г) Диатомовые — Bacillariophyla

д) Динофлагелляты и криптомонады

—

Dinophyta

е) Бурые — Phaoephyta

ж) Зеленые — Chlorophyta

з) Эвгленовые — Euglenophyta

Некоторые биологи выделяют дополнительный

(девятый) тип пиррофитовых водорослей —

Pyrrophyta.

Печеночники и мхи — Bryophyta

Папоротники, плауны и хвощи — Pteridophyta

Семенные растения — Spermatophyta

Типы: а) Голосеменные — Gymnospermae

б) Покрытосеменные (цветковые) —

Angiospermae.

В таком смысле фитобиотехнология является "палочкой-выру-

чалочкой", способной освободить отдельные регионы и страны от

импорта и интродукции растений, им не свойственных или совсем

неспособных культивироваться в неподходящих климатических

зонах. Это тем более резонно, когда речь идет о растениях —

продуцентах БАВ.

Хотя растительные клетки и ткани принадлежат к более диф-

ференцированным организмам в сравнении, например, с бактери-

ями, тем не менее они способны культивироваться в форме

неорганизованной клеточной массы (каллус). Каллусную ткань

можно "заставить" формировать зародышеподобные структуры,

почки, побеги, а на их основе — растения-регенеранты. Все это

происходит благодаря т.о тип

о'тент

н ости растительных

клеток (от лат. torus — все, целый, potentia — сила, потенция).

Понятие "тотипотентность" является клеточной характеристикой;

в нем отражен потенциал клетки воспроизводить все типы клеток,

присущих взрослому организму. Другими словами клетка обладает

способностью воспроизводить целый организм.

Если в качестве биообъекта применяют изолированный заро-

дыш, меристему верхушечных или пазушных почек, то есть интег-

рированную систему, то все получаемые растения-регенеранты

будут полностью соответствовать исходному растению, из которо-

го была взята какая-либо интегрированная система из числа вы-

шеназванных. Этим добиваются клонирования интересующих нас

растений (рис. 140).

_ 490

Исходный материал

на

растеши, выращиваемого

традиционных методом

Культура тканы

J3« стекле

мужской

гаплоид

Раотенке

женский

гаплоид

Индукщя рост

быстро-

го раямноыеяыя добавочных

мермстем (стеблевые апек-

ен ялы. ааредыво!] •непосред-

ственно

на

родительской

тканы»

талые черва про-

межуточный каллус

ил*

суспенаыониув культуру

клеток

Рис. 140. Клетки, органы и ткани, используемые

фитобиотехнологии.

В случаях применения изолированных клеток

протопластов

удается получать измененные варианты исходной формы, которые

передают полученные новые признаки потомству. Этим добивают-

ся возможностей искусственного создания новых форм растений,

пригодных для выборки, или селекции (рис. 141).

ядро

мишроорганкм

7 ^-*^

митохондрия

6 ~~~.

хлоропласт

-*^^

цктопласт

протопласт

хроагосоам(»

ы)

**•

.—

ДНК

протопласт

Рис.

141.

Пути искус-

ственного создания

но-

вых форм растений (1 —

трансгенез,

2 —

хромо-

сомная инженерия,

—

генная инженерия, 4,8 —

клеточная (геномная) ин-

женерия, 5—7 — цибри-

дизация).

В течение последних трех десятилетий удалось массовое раз-

множение культивируемых растений

уникальными характери-

стиками,

выращивание растительных клеток стало основой для

получения многих природных веществ, образуемых различными

растениями

качестве продуктов вторичного обмена (гликозиды,

алкалоиды

другие вещества).

Таким образом, клеточная

молекулярная биология растений

составляет основу фитобиотехнологии, а главными направлениями

стали создание новых форм полезных растений для сельского

лесного хозяйства, а также разработка промышленного производ-

ства химических веществ из растений.

В сравнении с микробной биотехнологией фитобиотехнология

является совсем молодой научной дисциплиной, становление ко-

торой

на

промышленные рельсы происходит

настоящее время.

491

Для нее характерна и своя терминология, совпадающая или не

совпадающая

общепринятой в биотехнологии в целом. Отдельные

термины типичны для фитобиотехнологии. Примеры некоторых ^

из них приведены ниже. I

10.1 Термины, используемые в фитобиотехнологии |

Адаптация — приспособление наследственно компетентной '}

клетки (организма) к изменившимся условиям существования.

Адвентивный

—

развитие из необычных точек происхождения,

например почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса,

или зародыши, развивающиеся из других источников, а не из зигот.

Этот термин также может быть использован для описания агентов,

загрязняющих клеточные культуры. j

Аксеническая культура — культура без чужеродных или^не^

'~£

желательных форм жизни; аксеническая культураможет включать %

запланированное сокультивирование различных типов клеток, тка-

ней или организмов. -,

Андрогенез — процесс развития растения из микроспоры, или *

пыльцевого зерна, либо через гаметический эмбриогенез, либо из -J

каллуса. ••

Анеуплоид — организм, клетка, ядро с числом хромосом,

отклоняющимся от х и от чисел, кратных х; хромосомы могут/не

могут перестраиваться.

Апекс — верхушка. ^

Апикальное доминирование — подавление роста боковых |

почек растительного побега или наличие терминальной почки. I

Апикальная (верхушечная) культура почечная — структура, *

состоящая из почечной апикальной меристемы с одним — до ;

нескольких примордиальных листьев и обычными размерами от ' j

0,1 до

мм в длину; если включаются более зрелые листья, то такая \

структура может достигать в длину нескольких сантиметров.

Апикальная меристема почечная — недифференцированная i

ткань, локализованная в пределах верхушечной почки, представ- I

ляющаяся обычно в виде блестящей куполоподобной структуры,

дистальной к самому молодому листовому примордию и размером

менее, чем 0,1 мм в длину при вырезании. <i

Асептические процедуры (методы, техника работы) — проце- |

дуры, обеспечивающие предотвращение попадания микробов в <

клетки, ткани и органы растительных культур, или перекрестное •

загрязнение одной клеточной культуры другой. Эти процедуры j

могут/нё могут исключить занесение инфицирующих молекул. |

Асептическое состояние — состояние без инфекции или мик-

робов-контаминантов.

Бессмертие

—

приобретение ограниченной во времени клеточ-

ной культурой признаков непрерывной клеточной

линии.

Бессмер-

тная клетка не обязательно та, которая неопластически, или зло-

качественно трансформируется.

Вариант — культура, проявляющая стабильное фенотипиче-

ское изменение — генетическое или эпигенетическое по природе.

Вегетативный рост — воспроизведение растений, используя

бесполый процесс (части стебля или листьев).

Время генерации клетки — интервал времени между двумя

последовательными делениями клетки. Этот интервал может быть

лучше определен с помощью кинофотомикрографии (цейтрафер-

ная съемка); этот термин не является синонимом "времени удвое-

ния популяции".

Время удвоения популяции — интервал времени, в течение

которого число клеток в популяции возрастает вдвое; другими

словами

—

это интервал, соответствующий логарифмической фазе

роста, за который, например, число клеток

•

увеличивается до

•

клеток. Этот термин не является синонимом термина "время

генерации клетки".

Габитуация — приобретенная способность популяции клеток

расти и делиться независимо от экзогенно добавляемых ростовых

факторов.

Гаметоклон — растение, регенерированное из клеточной куль-

туры, произошедшей из мейоспоры, гаметы или гаметофита.

Гаметоклональная вариация — вариация в фенотипе, либо

генетическая или эпигенетическая по природе, выраженная гаме-

токлонами.

Гаплоид — ядро, клетка, организм с половинным набором

хромосом (п или In).

Гетерокарион

—

клетка, с одержащая два или более генетически

различных ядер в общей цитоплазме (обычно является результатом

слияния клеток).

Гетероплоид — термин относится к клеточной культуре, в

которой клетки обладают ядрами, содержащими иное число хро-

мосом в сравнении с диплоидным числом (2п). Данный термин

используют только для описания культуры, а не отдельных клеток.

Следовательно, гетероплоидная культура должна быть той культу-

рой, которая содержит анеуплоидные клетки.

Гибридная клетка — термин используют для описания моно-

493

ядерной клетки, произошедшей из слившихся двух различных

клеток с образованием синкариона.

Гиногенез — процесс возникновения растения из клеток заро-

дышевого мешка.

Гомокарион — клетка, содержащая два или более генетически

идентичных ядер в общей цитоплазме (результат слияния клеток).

Дедифференциация — переход специализированных, неделя-

щихся клеток к пролиферации.

Диплоид — состояние клетки, в которой все хромосомы (за

исключением половых) находятся в удвоенном числе (2п) и струк-

турно идентичны хромосомам видов, от которых произошла куль-

тура.

Дифференциация— комплекс процессов, в результате которых

наступают различия между дочерними клетками, а также между

материнскими и дочерними клетками.

Дифференцированные

клетки

— клетки в культуре, в которых

поддерживаются все или многие из специализированных структур

и функций, типичные для этих клеток in vivo; другими словами

дифференцировка — состояние специализации клеток, отличаю-

щее их от других.

In vitro — опыты, выполненные в пробирке, колбе и т. д., то

есть вне живого организма.

In vivo — опыты, проведенные на живом организме.

Индукция — инициация структуры, органа или процесса in

vitro.

Инокулюм (трансплант)

—

часть суспензионной или каллусной

культуры, переносимой в свежую питательную среду.

Каллус

•—

неорганизованная, пролиферирующая масса диффе-

ренцированных растительных клеток.

Кариопласт — клеточное ядро, полученное из клетки посред-

ством энуклеации, окруженное узким ободком цитоплазмы и

клеточной мембраны.

Кариотип — набор хромосом, характерный для данного вида.

Клеточная линия — возникает из первичной культуры при

первом удачном субкультивировании; название "клеточная линия"

относится к таким культурам, которые включают линии клеток,

изначально присутствующих в первичной культуре. Если известен

статус культуры, то используют термины "прерывная" или "непре-

рывная" культура. Если же статус неизвестен, то достаточен термин

"линия".

Клон — популяция клеток, вози иктих из одной клетки посред-