Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ством митоза или группа растений, развившихся вегетативным или

бесполым Путем, все члены которой произошли из одной повторно

культивируемой клетки.

Клональное микроразмножение — получение in vitro неполо-

вым путем растений, генетически идентичных исходному.

Криоконсервация — сохранение клеток, тканей, зародышей

или семян при ультранизкой температуре (ниже -100°С).

Культура зародышей — стерильное выращивание in vitro на/в

питательной среде незрелых или зрелых изолированных зароды-

шей.

Культура изолированных протопластов — выращивание про-

топластов на/в среде in vitro в присутствии стабилизатора. При

регенерации клеточных стенок культура протопластов трансфор-

мируется в клеточную культуру.

Культура каллусных тканей — длительно выращиваемая пе-

ресадочная культура тканей, возникших вследствие пролиферации

клеток изолированных фрагментов органов или самих органов

растений (пыльники, семяпочки и т. д.).

Культура корней — выращивание in vitro на питательной среде

изолированных корней в пересадочном режиме.

Культура меристем побега — выращивание in vitro на пита-

тельной среде изолированного из верхушки или пазушной почки

побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми примор-

диями, с первоначальным размером менее 0,1 мм в длину.

Культура-нянька — рост клетки или клеток на подлежащей

культуре различного происхождения, которая в свою очередь

находится в контакте с культуральной средой. Культивируемая

клетка или ткань может быть отделена от питательного слоя

пористым материалом — фильтрованной бумагой или мембранны-

ми фильтрами.

Культура опухолевых тканей

—

длительная культура фрагмен-

тов,

изолированных из опухолей растений разного происхождения

и освобожденных от патогенов, индуцировавших развитие опухо-

ли.

Культуры тканевые — общий термин, который относят к

изучению клеток, тканей и органов, поддерживаемых или выра-

щиваемых in vitro в течение свыше 24 часов. Обычно используют

следующие варианты термина: клеточная культура — растущие

in vitro

клетки,

включая культуру из одиночных

клеток;

в клеточных

культурах клетки не организуются в ткани; тканевая культура —

поддержание роста тканей in vitro в состоянии, при котором может

495

происходить дифференциация и сохранение их строения и/или

функции; органная культура — поддержание или рост органного

примордия или целого (или части) органа in vitro в состоянии, при

котором может происходить дифференциация и сохранение стро-

ения и/или функции; культура растительной ткани — рост или

поддержание растительных клеток, тканей, органов или целых

растений in vitro.

Линия — культура, возникшая из штамма путем селекции или

клонирования, имеющая маркерные признаки (см. также "клеточ-

ная линия").

Липосома -— закрытый липидный пузырек, содержащий вод-

ную фазу; используют для включения экзогенных веществ, достав-

ляемых в клетки посредством слияния липосом с клетками.

Микроклетка — клеточный фрагмент, содержащий одну —

несколько хромосом и который образуется при энуклеации или

разобщении микроядерной клетки.

Микрокультивирование — in vitro клональное культивирова-

ние растений из почечных верхушек или узловатых эксплантов,

обычно .с ускоренной пролиферацией почек в течение субкульти-

вирования.

Микроядерная клетка — клетка с блокированным митозом и

в которой малые группы хромосом функционируют как фокусы

для переустройства ядерной мембраны, формируя таким образом

микроядра, максимум которых должен быть равен общему числу

хромосом.

Морфогенез: а) развитие структуры от недифференцирован-

ного состояния к дифференцированному; б) процесс роста и

развития дифференцированных структур.

Мутаген — фактор, обусловливающий мутацию.

Мутант — фенотипический вариант, возникший в результате

действия измененного или нового гена.

Мутация — генотипическое и необратимое (наследуемое) из-

менение нормы реакции клетки (организма).

Непрерывная клеточная культура — культура, способная к

неограниченному числу удвоения популяции; часто ее называют

"бессмертной культурой" клеток. Такие клетки могут или не могут

проявлять in vitro свойства неопластической или злокачественной

трансформации.

Норма реакции организма — проявление фенотипа в разных

условиях существования вида.

Омнипотентность — всесильность.

496

Органогенез

—

процесс дифференциации в каллусных клетках,

сопровождающийся образованием органов (корней, побегов) de

novo или из предсуществующих структур.

Пассаж — перенос или пересадка клеток (с разведением или

без разведения) из одной культуральной емкости в другую. Этот

термин является синонимом термина "субкультура", а число пере-

носа клеток или субкультур равнозначно числу пассажей.

Первичная культура — культура, берущая начало от клеток,

тканей или органов, взятых непосредственно от организмов. Пер-

вичная культура может расцениваться таковой до тех пор, пока не

удаются субкультуры в первое время. Затем она становится "кле-

точной линией".

Плотность насыщения — максимальное число клеток в куль-

туральном сосуде при специальных условиях выращивания. Плот-

ность насыщения выражается числом клеток на

см

в монослой-

ной культуре или числом клеток на

см

в суспензионной культуре.

Плотность популяции

—

число клеток на единицу поверхности

или объема среды. Общее число удвоений популяции (уровень

удвоения популяции) клеточной линии или штамма за один пассаж

in vitro определяют со времени посева в расчете на одно удвоение:

Nd = In (N/N

x 3.33), где N

—

число клеток в культуральном сосуде

на конечный период роста, N

— число клеток, засеянных в

культуральный сосуд, Nd — число популяционных удвоений. Луч-

ше всего использовать число прикрепившихся клеток.

Полиплоид

—

ядро клетки, организм с умноженным основным

числом хромосом (Зх, 4х и т. д.).

Популяция клеток — совокупность клеток в культуре.

Примордий — первый, первичный.

Пролиферация — разрастание клеток и тканей путем размно-

жения.

Пропагула

—

общий термин для обозначения органов и тканей,

служащих для вегетативного размножения (синоним термину "ди-

аспора").

Протопласт — клетка с удаленной клеточной стенкой.

Псевдодиплоид

—

клетка, в которой число хромосом является

диплоидным, но в результате хромосомных перестроек нарушают-

ся нормальный кариотип и родственные связи.

Регенерация — морфогенетический ответ на стимул, который

приводит к образованию органов, зародышей или целых растений.

Редифференциация

—

переход специализированных клеток из

одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими

497

делениями или непосредственно.

Рекон

—

жизнеспособная клетка, реконструированная слияни-

ем кариопласта с цитопластом.

Реконструированная клетка — синоним термина "рекон".

Ростовый цикл — рост популяции клеток в цикле периодиче-

ского выращивания, характеризуется S-образной кривой. Фазы

ростового цикла: латентная, экспоненциальная, замедления роста,

стационарная, деградации.

Синкарион — гибридная клетка со слившимися ядрами.

Сомаклональная вариация — фенотипическая вариация среди

соматических клонов генетической или эпигенетической природы.

Соматическая (парасексуальная) гибридизация — слияние in

vitro растительных протопластов соматических клеток, которые

различаются генетически.

Соматический клеточный гибрид — клетка или растение,

возникшее от слияния протопластов соматических клеток, разли-

чающихся генетически.

Соматический клон, или соматоклон — растение, возникшее

из любой формы клеточной культуры растительных соматических

клеток.

Соматический эмбриогенез — образование эмбриоидов (заро-

дышевых структур) в культурах клеток и тканей способом, напо-

минающим нормальный зиготический эмбриогенез; другими сло-

вами соматический эмбриогенез — это процесс эмбриоинициации

и развития из вегетативных или не гаметических клеток.

Стадии по Мурасиге:

— культивирование in vitro, характери-

зующееся посадкой растительной тканевой культуры в асептиче-

ских условиях; II — ступень в культивировании in vitro, характе-

ризующаяся быстрым численным возрастанием органов или дру-

гих структур; III — ступень культивирования in vitro, характери-

зующаяся приготовлением пропагулы для успешного переноса в

почву; при этом происходит процесс укоренения и отвердения

растений, начинается переход от гетеротрофного к аутотрофному

состоянию; IV — ступень в культивировании in vitro, характеризу-

ющаяся посадкой в почву растительной тканевой культуры, или

после претрансплантной обработки материала (пропагул) в стадии

III,

либо (для некоторых видов) после прямого переноса растений

из стадии II в почву.

Субкультивирование — перенос транспланта (инокулюма) на

свежую питательную среду.

Субкультура — см. термин "пассаж".

498

Субпротопласт — протопласт, потерявший часть цитоплазмы.

Субштамм — происходит из штамма при изоляции одиночной

клетки или группы клеток, обладающих свойствами или маркера-

ми,

которыми не обладают все клетки родительского штамма.

Суспензионная культура — тип культуры, в которой клетки

или их агрегаты размножаются, будучи суспендированными в

жидкой питательной среде.

Сферопласт — клетка с неполностью удаленной клеточной

стенкой.

Тотипотентность — клеточная характеристика способности к

формированию всех клеточных типов взрослого организма, или

это — свойство соматических клеток растений полностью реали-

зовать свой потенциал развития, то есть реализовать омнипотент-

ность ядра с образованием целого организма.

Трансгенез — перенос любым способом чужеродных генов в

клетки растений.

Трансформация—введение и устойчивая геномная интеграция

чужеродной ДНК в растительной клетке, сопровождающаяся ге-

номной модификацией.

Фенотип — определенная сумма признаков организма в конк-

ретных внешних условиях.

Цибрид — жизнеспособная клетка, возникшая в результате

слияния цитопласта с клеткой — протопластом или цитопластом;

при этом образуется цитоплазматический гибрид.

Цибридизация — введение цитоплазматических (внеядерных)

генов в изолированный протопласт.

Цитоплазматическая наследственность — наследственность,

обусловленная внеядерными генами или хлоропластными, плаз-

мидными и т. д.

Цитопласт — интактная цитоплазма, остающаяся после энук-

леации (удаление ядра) клетки.

Штамм — происходит из первичной культуры или клеточной

линии при селекции или клонировании клеток, имеющих специ-

фические свойства или маркеры.

Эксплант — ткань, взятая из своего оригинального места и

перенесенная в искусственную среду для роста и поддержания.

Эмбриоид — зародышеподобная структура, возникшая путем

соматического эмбриогенеза.

Эмбриокультура — in vitro развитие и поддержание изолиро-

ванных зрелых или незрелых зародышей.

Эпигенетические вариации — фенотипическое выражение

499

дифференциальной активности генов, определяющих независи-

мость клетки от экзогенных влияний.

отличие от сомаклональных

вариаций и мутаций не сохраняются в цикле "клетка -» растение

-> клетка".

Эуплоид — ядро, клетка, организм с числом хромосом, крат-

ным х.

Ювенильный (-ая, -ое) — фаза в половом цикле растения,

характеризующаяся различиями (в проявлении) от взрослого ор-

ганизма, и которая теряет способность отвечать на индуцирующие

цветение стимулы. Это фаза роста после образования проростков.

10.2 Вегетативное размножение растений методом культур

тканей. Метод культур тканей, или микроразмножение in vitro

исключительно удобен для быстрого размножения и сохранения

здоровых растений. Для этого производят отбор соответствующих

эксплантов, подвергают стерилизации с последующим переносом

на подходящую питательную среду. Качество эксплантов зависит

от вида и фазы развития растения; органа, из которого взят

эксплант; сезона года. Установлено, что меристемные ткани, сер-

дцевина луковиц, клубнелуковиц и корневищ, надежно защищен-

ные листьями и чешуйками, являются стерильными. Перед удале-

нием покрывающих структур их каждый раз протирают 70%

этанолом. Открытые органы — источники эксплантов подвергают

стерилизации ртуть- или хлорсодержащими агентами (таблица 50).

Таблица50. Стерилизация растительных биообъектов

Объект

Верхушки

стеблей (апексы)

Листья

Семена

набухшие

Семена сухие

Ткани клубней

Ткани корневищ

Ткани стебля

Время стерилизации, мин.

гапохлоритами

Na, Ca, 5-10%

3—15

3—6

10—15

15—20

20—25 '

диацидом

0,1%

•

1—10

1—3

6—10

15—20

20—30

20—40

пероксидом

водорода

3-12%

2—7

3—5

6—8

12—15

—

сулемой

0,1 %

0,5—7

0,5—3

2—8

10—15

15—25

20—25

500

Как видно из таблицы, самая длительная стерилизация по

времени не превышает 40 минут, в других случаях время заметно

меньше. В усредненном варианте и применительно к различным

культурам растительных тканей, наряду с этанолом (70-^-95%),

рекомендуют еще серебра нитрат

(1%),

бензалконий хлорид

(0,01—'

0,1%) с длительностью экспозиции 0,1—5;

5—30

5—20

минут

соответственно.

Экспланты (за исключением материала из надземных частей

растений) целесообразно промывать в растворах неионогенных

ПАВ перед обработкой дезинфектантом. После этого ткань тща-

тельно промывают водопроводной водой в течение 10—30 минут,

а затем погружают в раствор дезинфектанта и нерезко взбалты-

вают в течение отведенного времени. После стерилизации расти-

тельный биообъект трижды промывают свежими порциями сте-

рильной дистиллированной воды.

Стерилизующий эффект можно повысить следующими проце-

дурами: проведением стерилизации под вакуумом для удаления

пузырьков воздуха; помещением материала в 70% этанол до того,

как обработать раствором другого дезинфектанта; использованием

таких увлажняющих агентов как твин

или твин

в виде добавок

к растворам дезинфектантов для снижения поверхностного натя-

жения и обеспечения более полного контакта дезинфектанта с

материалом.

В последние годы все чаще применяют специальные емкости

(сосуды) для изоляции в асептических условиях органов из

молодых растений. Фирма Sigma (США) к 1990 г. ввела новые

мембранные наборы для культур растительных тканей. Их изго-

тавливают из микропористой полипропиленовой мембраны, обра-

ботанной специальным ПАВ для улучшения прохождения пита-

тельных веществ. Мембранные наборы могут быть использованы

при культивировании протопластов, в соматическом эмбриогенезе,

при получении культур цветов и в других направлениях.

С применением мембран существенно ускоряется рост в срав-

нении с агаризованной средой, лучше удается освобождать куль-

туры от ингибирующего влияния фенольных веществ, выделяю-

щихся в среду, а также предохранять клеточную линию от суще-

ственных повреждений при изучении метаболитов, продуцируе-

мых культурами, и др. Таким путем удается уменьшить расход

материалов и, как следствие, снизить цены, поскольку культуры

-могут поддерживаться стечение длительного времени без замены

культуральных контейнеров. Ингредиенты (продукты) для культи-

501

вирования растительных тканей должны производиться в соответ-

ствии с требованиями GMP. Этим гарантируется их высокое

качество. Пригодность ингредиентов сред, обеспечивающих рост

тканевых культур, оценивают, как минимум, на трех клеточных

линиях в 1—3-х пассажах. Избранные основные среды дополняют

углеводами, витаминами, регуляторами роста (в зависимости от

используемой клеточной линии).

Применяют следующие критерии оценки роста на рекоменду-

емой питательной среде (таблица 51).

Таблица51.

Критерии оценки роста клеточных культур

на питательных средах

Культуры тканей

Каллусная

Возрастание веса

каллуса

Отсутствие

некротической ткани

Внешне —

активный рост

Почечная

пролиферирующая

Активное образование

почек или растеньиц

Образование сильных

здоровых почек.без

морфологических

аберраций

—

Другие клеточные линии

Активно растущий

каллус

Увеличение плотности

клеток

Выраженный рост

почек и корней

Питательные среды стерилизуют обычно в автоклавах (таблица

52).

В принципе желательна стерилизация автоклавированием

(12 ГС) небольших объемов питательных сред, поскольку многие

ингредиенты разрушаются при более продолжительном нагрева-

нии и давлении. Установлено, что температура выше 12 ГС может

быть причиной нарушения качества сред, и, как следствие, плохого

роста культур.

Т а б л и ц а 52. Стерилизация сред, рекомендуемых для выращивания

растительных культур тканей (t=121

Объем среды, мл

100

250

Минимальное время стерилизации, мин

502

Продолжение табл. 52

Объем среды, мл

500

1000

2000

4000

Минимальное время стерилизации, мин

Некоторые ингредиенты в растворенном виде стерилизуют

фильтрованием (через фильтры с порами 0,22 мкм в диаметре) и

в виде стерильных растворов вносят в приготовленные среды перед

их использованием. Питательные среды по своему составу доста-

точно разнообразны, однако в какой-то мере они и однообразны.

В частности, их компоненты можно подразделить на 3 группы:

источники органического углерода (чаще — сахароза), неоргани-

ческие соли (включая источники азота) и стимуляторы роста. К

числу последних относятся некоторые витамины комплекса В и

растительные гормоны — цитокинины и ауксины. Почти универ-

сальной средой для клеток различных видов является среда MS

Т. Мурасиге и Ф. Скуга (см. главу 4). Тем не менее, при работе с

разными растительными объектами необходим специальный под-

бор ингредиентов сред для достижения поставленных целей. Пи-

тательные среды могут быть плотными за счет внесения

0,7—1%

агар-агара

жидкими. Показано, например, что

для

микрокультуры

ананасов предпочтительнее жидкие среды.

Микроразмножение in vitro можно осуществлять из существу-

ющих в растении тканей меристемного типа (зародыш, верхушка

основного побега) или позже образующиеся пазушные побеги,

равно как и из дополнительных меристематических тканей (точки

роста, эмбриоиды) изолированных органов растений, где они

формируются непосредственно в родительской ткани; из проме-

жуточного каллуса или клеток суспензионных культур (см. рис.

140).

Если в качестве источника углерода используют в питательных

средах сахарозу, то фотосинтез не нужен культуре, однако для

морфогенеза и биосинтеза хлорофилла применяют люминесцент-

ные лампы с интенсивностью освещения 1000—5000 люкс.

Важную роль играют регуляторы роста растений — аукси-

ны и цитокинины (растительные гормоны, или

фитогормоны). Первые усиливают или поддерживают рост каллу -

503

сов и/или корнеобразование in vitro; вторые стимулируют образо-

вание почек. Их используют в малых концентрациях, добавляя в

стерильном виде к готовым питательным средам.

Ауксинами являются: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, р-

хлорфеноксиуксусная кислота, индол-3-уксусная кислота, индол-

З-ацетил-Ь-аланин, индол-3-ацетил-аспарагиновая кислота, индол-

З-ацетил-Ь-фенилаланин, индол-3-ацетилглицин, индол-3-масляная

кислота и ее калиевая соль, а-нафталинуксусная кислота. Среди

цитокининов известны: еденин, 6-бензиламинопурин, N-бензил-Э-

(2-тетрагидропиранил)-аденин, 6-у-у-диметилаллиламинопурин,

1,3-дифенилмочевина, кинетин, зеатин и некоторые другие. Сме-

шанными функциями обладают абсцизовая, коричная и гибберел-

ловая кислоты, флороглюцинол; 2,2-диметилгидразид янтарной

кислотыТ

В целях предотвращения возможного бактериального и гриб-

ного загрязнения к ним добавляют такие антибиотики, как полиены

(амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его

производные, левомицетин, аминоглйкозиды (гентамицин сульфат,

канамицин моносульфат), рифампицин и

др.

Большинство антиби-

отиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стери-

лизуют фильтрацией через мембраны. .

Для растений характерно так называемое апикальное домини-

рование, при котором за счет регулирующего действия фитогор-

монов верхушечная почка развивается быстрее, чем пазушные

почки. Если культивировать кончик побега без фитогормонов, то

развивается одиночный проросток со строго апикальным домини- -

рованием. Если же в среду внести цитокинин и засеять пазушные

побеги, то они вырастают недоразвитыми, но с появлением пучка

ростков, состоящего из второго, третьего и более порядков, кото-

рые можно разделить на составляющие и вновь выращивать на

свежей среде до получения пучков таких побегов. Этот процесс

можно вести до бесконечности, получая быстро или относительно

быстро размножающиеся побеги желаемых растений.

В большинстве случаев верхушечные (длиной 1—5 мм) и па-

зушные побеги заражены растительными вирусами, поэтому при-

бегают к использованию так называемой культуры верхушечных

меристематических тканей, когда отрезают лишь

0,3—0,5

мм

верхушки, содержащей меристему и 1—2 листовых примордия с

последующей выдержкой при 30—40°С в течение

1,5—:3

меся-

цев.

Этот метод удачно использован и используется для оздоров-

ления хозяйственно ценных растений.

504