Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

С помощью метода культур тканей удалось значительно повы-

сить коэффициент размножения многих садовых древесных (яб-

лони) и травянистых декоративных растений (ирис, нарцисс, пе-

туния, фиалка и др.), пользуясь придаточными побегами, а также

каллусами, индуцированными фитогормонами и дающими побеги

или эмбриоиды. Доступными для производства стали клетки бар-

бариса

—-

продуцента спазмолитика ятроризина, табака — проду-

цента убихинона-10.

Некоторые каллусы стабильно продуцируют растения — реге-

нераты в течение 10 лет (табак, хризантемы и др.), оставаясь при

этом смесью нерегулярно дифференцированных клеток, среди

которых постоянно содержатся диплоидные меристематические

клетки, дающие стеблевые апексы или зародыши.

Перед высадкой проростков в грунт прибегают к стимуляции

корнеобразования с помощью индолилмасляной кислоты (0,5—г 10

мг/л).

Фитобиотехнологи, занимающиеся микроклональным размно-

жением растений, должны быть хорошо подготовленными в обла-

сти биологии растений, с которыми приходится иметь

дело,

а также

в области микробиологической техники работы. Лишь благодаря

заинтересованности и профессиональному подходу к выполнению

задания обеспечивается высокое качество конечного продукта

(материала). Тем не менее необходимо помнить о трудностях,

возникающих при микрокультивировании. К ним относятся: ин-

фицирование растительных тканей вирусами и фитопатогеннымй

бактериями (например, Erwinia carotowora), бактериальные и гриб-

ковые контаминации, ингибирование тканей фенольными и дру-

гими, например, летучими, соединениями, возрастание числа му-

таций, и пр. И все же микрокультивирование исключительно

заманчиво не только на пути создания большого количества без-

вирусного материала, но и массовости получения образцов в

относительно короткие сроки (несколько тысяч в течение месяцев).

Микрокультивирование in vitro обеспечивает быстрое вегета-

тивное размножение не только травянистых, но и древесных

растений, также прибегая при этом к культуре побегов (например,

для декоративных, лесных, плодовых и других деревьев) или

каллусным культурам (гвинейская масличная пальма, цитрусовые

и др.). Здесь важное значение имеет состояние ювенильности (от

англ.

juvenile

—

юношеский, юный), которое обычно растягивается

на несколько лет и характеризуется сравнительной легкостью

вегетативного размножения. Для древесных растений известно

505

также явление реювенилыюсти, когда некоторые ткани взрослого

растения проявляют свойства проростков, например, формируют

придаточные корни. Реювенилизированные ткани все больше ис-

пользуются на практике для размножения отдельных покрытосе-

менных (например, эвкалиптов) и голосеменных деревьев (разные

виды сосны). Ускорение реювенилизации может происходить под

влиянием отдельных фенольных соединений (флороглюцин, квер-

цетин, рутин), памятуя о том, что изменение уровня эндогенных

фенольных соединений является составной частью регуляторных

процессов, индуцируемых цитокининами.

Каллусные культуры древесных растений также перспективны

как и каллусные культуры травянистых растений. Показателен

он он

•A. "w?-"

ОН О

флороглюцин кверцетин

остаток G-р- 1-рамнозидо-0-глюкозы

рутин

пример с гвинейской масличной пальмой (Elaeis guineensis) —

источником получения масла для населения Юго-Восточной Азии,

Америки, Африки. К тому же эта пальма не размножается вегета-

тивно. Генетико-селекционная работа по выведению более уро-

жайных сортов на основании полового размножения занимает

15—20 лет. Вот почему получение каллусов, а затем — эмбриоидов

и регенерантов масличной пальмы оказалось экономически выгод-

506

ным

делом.

Обычно за

месяца удается выращивать из эмбриоидов

побеги длиной 12 см (рис. 142).

Рис.

142. Процесс клонирования гвинейской масличной пальмы: 1 — верху-

шечные молодые листья (посевной материал), 2—5 — сменяемые питательные

среды, в которых развиваются каллусы, эволюционирующие в эмбриоиды (4) и

затем

— в

молодые растеньица

[5),6 —

образование корней при очередном переносе

растения на свежую питательную среду, из которой их пересаживают в грунт.

Учитывая тот факт, что в

см

каллусной культуры содержится

до

млн. клеток, каждая из которых способна трансформироваться

в новое растение, становятся понятными все преимущества метода

стерильного вегетативного размножения растений в лабораторных

условиях-на средах с фитогормонами при последующей пересадке

их в почву. Отбирая нужные клетки, можно вывести новые сорта

растений, удовлетворяющие запросы по одному или ряду показа-

телей (устойчивость к микробным заболеваниям, урожайность,

особая окраска цветов, повышенная продуктивность вторичных

метаболитов и т. д.).

Для развития и формирования каллусных культур значительна

роль не только фитогормонов, но и так называемых э л и с и т о-

р о в (от англ. elect — выбирать) — БАВ, дерепрессирующих гены,

и, как следствие, активирующих клеточные деления, сравнительно

быструю дедифференцировку специализированных клеток, сопро-

вождающуюся активацией белкового синтеза. Полагают, что эли-

ситорами являются углеводные молекулы, происходящие из гид-

ролизованньгх гликанов клеточных стенок. Не исключена возмож-

ность экзогенного происхождения элиситоров, например, от мик-

роорганизмов.

10.3.

Культивирование клеток растений в глубинных услови-

ях.

В случае выращивания клеток растений в глубинных (погру-

женных) условиях необходимо иметь такие их линии, которые

отвечали бы следующим требованиям: склонность

к размножению в дезагрегированном со-

стоянии, морфологическая "выравнен-

ное т ь", удовлетворительная скорость раз-

м н о ж е н и я, сохранность путей метаболиз-

му

м а. Такие клеточные линии уподобляются одноклеточным мик-

роорганизмам и могут называться "суспензионными культурами"

в случае их выращивания в жидких питательных средах. Состав и

реологические характеристики сред являются основными факто-

рами, определяющими нахождение одиночных или аггломериру-

ющихся (агрегирующихся) клеток во взвешенном состоянии. Если

число клеток в аггломератах превышает 50, то они могут выпасть

(или выпадают) в осадок. Желательно, чтобы в процессе размно-

жения клетки дольше оставались в разобщенном состоянии, тогда

поддержание суспензионной культуры в течение необходимого

времени оказывается вполне достижимым.

Что касается морфологической "выравненности" клеток, то при

этом имеют в виду их округлую (или сферическую) форму, уплот-

ненную цитоплазму, сравнительно небольшие размеры (в среднем,

от 10 до 50 мкм) и отсутствие трахеидоподобных элементов.

Одиночные растительные клетки в таких случаях напоминают

одноклеточные эукариотические микроорганизмы; их ростовые

характеристики (фазы размножения) в некотором приближении

также оказываются совпадающими (lag-фаза, log-фаза, const-фаза,

let-фаза), хотя временные интервалы между фазами более растя-

нуты для клеток растений.

Скорость размножения растительных клеток невелика—время

удвоения их числа равно 1—3 суткам и поэтому по данному

показателю они существенно уступают, например, бактериальным

и дрожжевым клеткам, время удвоения которых в глубинных

условиях^ укладывается для большинства видов в 20—30 минут.

Однако, переводя культуру растительных клеток на хемостатное

(непрерывное) выращивание, можно добиться их высокойпродук-

тивности по биомассе или по вторичным метаболитам (пример с

Nicotiana tabacum).

Исходные клеточные суспензии обычно получают из рыхлых,

оводненных каллусных тканей (2—3 г на 60—100 мл питательной

среды), подвергнутых обработке пектиназой и полигалактурона-

зой,

и помещаемых в жидкую питательную среду, лишенную ионов

кальция, но содержащую ауксин — 2,4-дихлорфеноксиуксусную

кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в периодиче-

ском, либо в непрерывном режиме, специально подобранном для

конкретного биообъекта.

других случаях источниками суспензи-

онных культур могут быть протопласты с реконструированными

клеточными стенками. Стимулировать деления отдельных клеток

изолированных протопластов можно с помощью обогащенных

508

питательных сред или использованием гомологичной ткани —

"няньки" ("кормящий слой"), находящейся в состоянии активного

роста (рис. 143). Колонии из отдельных клеток (клоны) могут быть

субкультивированы один или более раз (при необходимости), а

затем переведены в суспензионные культуры.

Рис.

143. Использование тка-

ни-"няньки" (суспензионная куль-

тура) при выращивании колоний

из одиночных клеток кукурузы или

протопластов (схема):

—качалоч-

ная колба, 2 — колония, возникшая

из отдельной клетки, 3 — фильтро-

вальная бумага, 4 — металлическая

сетка, 5 — суспензия клеток "кор-

мящего слоя", 6 — подложка (пе-

нополиуретан), 7 — питательная

среда.

Важно также сохранить

присущие клеткам метаболические пути при их выращивании в

суспензионных культурах. Более того, регулируя обмен, можно

добиваться заметного повышения выхода целевых продуктов. При

этом всегда необходимо учитывать тип дифференцировки, или

состояния специализации исходных клеток, так как от него зависит

видоспецифичность первичного и вторичного метаболизма.

Суспензионные культуры обычно выращивают в подходящих

емкостях роллерного типа после фильтрации первичной суспензии

через стерильные металлические, нейлоновые илитяарлевые сита

для освобождения от крупных аггломератов клеток.

К сожалению, выращивание растительных клеток в "погружен-

ных" условиях пока удается в редких случаях, что обусловлено

недостаточной глубиной познания всех особенностей обмена ве-

ществ у различных видов и их клеточных культур; определенные

помехи здесь связаны и с медленным ростом клеток в строго

асептических условиях, их чувствительностью к механическим

повреждениям и другими причинами. /

В начале 80-х годов в компании Mitsui-Petrochemical Industries

осуществлен первый крупномасштабный процесс по выращива-

нию воробейника (Lithospermum erythrorhizon) в погруженных

условиях в целях получения вторичного метаболита — шиконина,

509

являющегося ценным фармацевтическим препаратом и красите-

лем (рис. 144). За один периодический процесс удается получать

порядка

кг конечного продукта, накапливающегося в клетках. На

первой стадии клетки воробейника выращивают на среде (с пода-

чей стерильного воздуха) в 200-литровом биореакторе в течение 9

суток; затем культуру переносят в биореактор меньшего размера

со средой (М-9), стимулирующей продукцию шиконина, и, нако-

нец, в третьем реакторе на 750 л ферментацию ведут в течение 2

недель. Клетки на первой стадии белые, на последней — красные

(накоплен шиконин). Стоимость красителя в

1983

г.

составляла 4000

долларов за килограмм.

, Рис. 144. Схема культи-

вироваяия воробейника

це-

лях получения шиконина (1

— биореактор, 2 — подача

стерильного воздуха, 3

—

ме-

шалка, 4 — питательная сре-

да, 5 — выпуск отработанно-

го воздуха, б — перенос сре-

ды в малый реактор, 7 —

фильтрат, 8 — красные клет-

ки,

содержащие шиконин).

10.4.

Использование методов генетической инженерии, или

рДНК в фитобиотехнологии. Растения — как многоклеточные

организмы с огромной емкостью геномов, с половым путем раз-

множения и многоступенчатыми программами развития — явля-

ются более сложными объектами для генноинженерных экспери-

ментов, чем, например, вирусы, бактерии и дрожжи. Тем не менее,

уже теперь достигнуты определенные успехи с растительными

объектами и по прогнозам ученых США к 2000 году ожидается

прирост урожайности сельскохозяйственных культур примерно на

60%

по сравнению с началом 80-х годов текущего столетия в

основном на основе использования методов генетической инже-

нерии, когда стал возможным перенос отдельных генов от одного

растения другому (в противоположность естественному половому

процессу, при котором происходит замена целых блоков сцеплен-

ных генов).

10.4.1.

Генная инженерия. Плазмиды, органеллы, транспозоны

и вирусы как векторные системы. В генноинженерном экспери-

менте необходимо изолировать конкретный ген, включить его в

наследственный аппарат растительной клетки и регенерировать

фертильное растение (способное к размножению) с измененным

510

наследственным признаком.

народнохозяйственном аспекте важ-

ными признаками являются: высокая урожайность (или продук-

тивность), скороспелость, устойчивость к различного рода заболе-

ваниям, засухе, к гербицидам и пестицидам, неполегаемость и др.

К сожалению каждый из названных признаков контролируется,

как правило, группой генов, что заметно усложняет проблему

клонирования соответствующих генов. Однако, йрирода с давних

пор "доказывает" нам, что генетическая инженерия также подвла-

стна и ей. Примером тому служит инфекционная злокачественная

болезнь (корончатые галлы) многих двудольных растений, вызы-

ваемая почвенной агробактерией — Agrobacterium tumefaciens.Ta-

кие однодольные растения, как пшеница, кукуруза, овес, рис, рожь,

сахарный тростник, естественно устойчивы к заражению агробак-

териями.

В 1971 г. Р. Гамильтон и М. Фолл (США) пришли к выводу о

том, что опухоль у растений индуцируется нуклеиновой кислотой.

В 1974 г. Н. Ван Ларебеке, П. Энглер и др. (Бельгия) установили,

что способность Atumefaciens вызывать образование корончатого

галла с большими по размерам плазмидами (в длину 50—80 мкм в

разомкнутом состоянии и с ММ 112—156 МДа —- мегадальтон),

названными Ti- плазмидами (от англ. tumor inducing —

вызывающий опухоль). Обычно они в клетке содержатся в 1—2

копиях и составляют примерно

ДНК от бактериального генома.

Однажды наведенный Ti-плазмидой опухолевый рост у расте-

ния не нуждается в ее дальнейшем присутствии для поддержания

злокачественной пролиферации. Следовательно, выращивание и

поддержание опухолевых клеток возможно в стерильной культуре

(без агробактерий и без Ti-плазмиды), и, как установлено, без

ауксинов и цитокининов, то есть без фитогормонов. При этом они

образуют опины (см.), отсутствующие у растений в нормальных

условиях, и по которым можно определять опухолевую клетку. В

зависимости от клеток корончатого галла могут образовываться

атропин (см.), нопалин (см.) или октопин (см.). Поэтому и говорят

соответственно: клетки агропинового, нопалинового или октопи-

нового типа.

Фактическая ненужность Ti-плазмиды после индукции опухоли

у растения связана с тем, что стерильные опухолевые клетки в

своих хромосомах содержат ковалентно связанную часть этой

плазмиды (около 10%), получившей название Т-ДНК (от англ.

transferred — перенесенный), а применительно к клеткам

5И

A.tumefaciens с Ti-плазмидой — Т-участок бактерии. Т-ДНК содер-

жится исключительно в ядре клеток корончатого галла.

Таким образом, на примере Ti-плазмиды виден перенос генов

от прокариот к эукариотическим растениям в природных условиях

(рис.

145). Транскрипты интегрированной Т-ДНК в виде мРНК

поступают из ядра в цитоплазму

клетки,

где включаются в реакции

синтеза специфических белков на полирибосомах: ядерная ДНК-

Т-ДНК -» транскрипты -> мРНК

-»-

полирибосома (трансляция) -»

белки -» синтез опинов (гормон-независимый рост)

1 2

Agrobacterium

tumefaciens

Растительная клетка

с встроенной Т-ДНК

в ядерную ДНК

Б-Е

Т-ДНК

-тракскригтгы

Рис.

145.

А. Схема пере-

носа Т-ДНК из агробактерии

в растение с последующим

формированием корончатого

галла (1 — бактериальная

хромосома, 2 — Т-ДНК, 3 —

Ti-плазмида, 4 — ядро расти-

тельной клетки, 5—'встроен-

ная Т-ДНК, 6 — корончатый

галл);

Б. Т-ДНК в Ti-плазмиде

октопинового типа (продук-

ты генов 1 и 2 ингибируют

побеги, гена

3 —

ингибируют

корни).

Каждый транскрипт определяется специфическим промотор-

ным участком на Ti-плазмиде, узнаваемым полимеразой

растения

— хозяина. Из рисунка 145 Б следует, что функция генов 1—3

проявляется в неорганизованном росте клеток, поскольку тормо-

зится формирование побегов и корней.

Фитопатогенные агробактерии способны вызывать 3 вида ра-

ковых опухолей у растений: корончатый галл, бородатый корень

и стеблевой галл. Возбудителем каждого заболевания являются

A.tumefaciens, A.rhizogenes и A.rubi соответственно. Проникая в

поврежденное растение, патогенный микроорганизм с помощью

Ti-плазмиды создает свою экологическую нишу и реализует "гене-

тическую колонизацию" объекта — происходит гормон-независи-

мый рост опухолевых клеток.

Ti-плазмиды оказались хорошими векторными системами для

осуществления генноинженерных экспериментов с растениями,

поскольку Т-ДНК этих плазмид обладает достаточно высокой

эффективной емкостью (порядка

000 пн чужеродной ДНК могут

быть перенесены и встроены с ее помощью в хромосомную ДНК

512

растений), широким спектром хозяев, инфекционностью и ста-

бильностью.

Перенос гипотетического гена с помощью Ti-плазмиды пред-

ставлен на рис. 146.

б а б в в а в -двавд

1 2 3 4 5

Рис. 146. Перенос гена (а) из хромосомы (б) Escherichia coli в растение (5) с

помощью Т-ДНК (в) Ti-плазмиды (г) A.tumefaciens (2,3) в ядерную ДНК (д) расти-

тельной клетки (4).

Разработаны векторные системы на основе растительных хло-

ропластов и митохондрий, ДНК которых имеют гомологичные

области с ядерной ДНК, что облегчает обмен участками между

ними при выполнении генноинженерных экспериментов.

Заманчивы в качестве векторных систем и транспозоны (см).

Их множество сулит многообещающие результаты в опытах с

однодольными растениями, устойчивыми к заражению агробакте-

риями и, следовательно, к восприятию Т-ДНК Ti-плазмиды.

В качестве векторов могут также использоваться вирусы рас-

тений. Их нуклеиновые кислоты реплицируются и проявляют свои

функциональные свойства (экспрессируют) в клетках растений-

хозяев, где потенциал вирусов и воспринимающих клеток объеди-

няется и реализуется в приумножении организованных частиц

патогена (например, для вируса мозаики табака в среднем 10'

частиц на клетку, для вируса мозаики цветной капусты — порядка

частиц на клетку).

Однако вирусы как векторы обладают четырьмя существенны-

ми недостатками: они патогенны, их емкость небольшая, вирусы

не способны встраиваться в хромосомы растительных клеток, они,

в основном, видоспецифичны, то есть поражают определенный

круг растений — хозяев.

качестве векторов могут быть использованы также и вироиды

(см.),

представляющие собой однонитевые цепи ковалентно свя-

занных кольцевых РНК, включающих 270—300 нуклеотидов, ли-

шенных оболочки. Вироиды поражают виноград, картофель, коко-

совую пальму, томаты и другие растения как по вертикали (через

17 т. 8524 513

зародышевые клетки), так и по горизонтали (распространяются по

растительному организму через клеточный сок или переносятся

механически).

Чтобы использовать вирусную (вироидную) РНК в качестве

вектора, необходимо выполнить следующие последовательные опе-

рации (рис. 147).

РНК вируса (внронда)

кДМК одкпютгпая

кДНК двухнитеввя

Прокариогнческая плаамида

(может быть космида)

с «ДНК

Плаамида с включенным

чужеродным геном в кДНК

Рис. 147. Последователь-

ность событий при использо-

вании вирусной (вироидной)

РНК в качестве вектора:

—

обратная транскриптаза, 1

—

ДНК-полимераза, 3 — встра-

ивание в плазмиду (клониро-

вание),

4 —

включение чуже-

родного гена, 5

—

инфициро-

вание растений, б — транс-

крибирование с образовани-

ем инфекционной РНК и по-

следующее заражение расте-

ния-хозяина.

Клон кДНК с встроенным геном может обладать инфекцион-

ностью и, как следствие, им заражают хозяйское растение. Если

же кДНК с встроенным геном не обладает инфекционностью, то

вирусный вектор может быть транскрибирован с образованием

РНК, которая затем используется для заражения растения.

До сих пор признают, что векторная система на основе цитоп-

лазматического вируса мозаики цветной капусты (содержит двух-

цепочечную ДНК) оказывается наиболее приемлемой в генноин-

женерных экспериментах

растениями, хотя многое здесь остается

неизученным (например, молекулярные механизмы проявления

симптомов заболевания растения-хозяина от поражения вирусом,

неопределенность диапазона растений-хозяев' и возможность его

расширения, неспособность векторной системы встраиваться в

геном хозяина, и др.).

Если удается объединить возможности ДНК из вируса мозаики

цветной капусты с

Т-ДНК

Ti-плазмйды, то такую векторную сис-

тему можно будет использовать на более широком круге растений-

хозяев.