Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование

клеток, экстрагирование водой при рН 4,5—5,0 и температуре

85—90°С, в присутствии стабилизатора

(0,25%

раствор натрия

нитрита). Экстракция протекает в течение часа, после чего водный

раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натра, добав-

ляют коагулянты белка — хлорид железа трехвалентного и алю-

миния сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упари-

вают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена

и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина

при

3—4°С

из водно-ацетонового раствора.

Кристаллический цианкобаламин можно получать с помощью

резорцина или фенола, образующих с ним аддукты! которые

сравнительно легко разлагаются на составляющие компоненты.

При реализации данного биотехнологического процесса не

забывать о высокой светочувствительности витамина Bi

, поэтому

все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или

при красном свете).

На ацетонобутиловой и спиртовой бардах с добавлением солей

кобальта и метанола в нашей стране получают кормовой препарат

КМБ

— концентрат, содержащий витамин

и другие ростовые

вещества. Биообъектом здесь является смешанная культура мета-

ногенных бактерий.

9.3.6. Получение микробных препаратов — удобрителей почв,

стимуляторов и регуляторов роста растений. На основании более

чем векового изучения азотфиксирующих микроорганизмов ут-

вердилось представление о целесообразности производства в про-

мышленных масштабах лишь клубеньковых бактерий, поскольку

эффективность от внесения в почву препаратов из свободноживу-

щих азотфиксаторов по разным причинам является незначитель-

ной. Однако ясно, что в условиях интенсивного земледелия и

бурного роста населения земли плодородие почвы — одна из

главнейших проблем, на решение которой должны быть направ-

лены усилия различных специалистов, включая биотехнологов. И

нельзя считать, что свободноживущие азотфиксаторы не будут

вновь объектами биотехнологии. Очевидно не все изучено приме-

нительно к их ассоциативным взаимоотношениям в среде обитания

и значение самой среды, заметно изменяющейся при энергичном

воздействии на нее человека.

Микроорганизмы, фиксирующие азот из воздуха, подразделя-

ют на свободноживущие в природных условиях и на симбйотиче-

ские с растениями или другими микробами. К свободноживущим

455

относят азотобактеры, актиномицеты, определенные цианобакте-

рии и др., к микробам-симбионтам: азотоспириллы — симбионты

папоротника азолла, ризобии — симбионты бобовых растений,

отдельные виды цианобактерий в составе лишайников (лишайники

представляют собой пример устойчивого симбиоза некоторых

грибов с цианобактериями или водорослями), и др.

Микробы-азотофиксаторы ежегодно фиксируют примерно

17,5« 10

т молекулярного азота из воздуха, из которых 10—15%

приходится на цианобактерий. Очевидно, что до тех пор, пока не

будут созданы "молекулярные гибриды" микробов — азотофикса-

торов с широким набором полезных растений методами генной

инженерии, использование соответствующих "препаратов-удобри-

телей" будет целесообразным и экономически оправданным.

В таком же ряду находятся микробные стимуляторы и регуля-

торы роста растений — гиббереллины, фузикокцин и др.

Ризотрофин — своеобразный "потомок" коммерческого пре-

парата "нитрагин", впервые созданного в 1896 г. в Германии. Он

представляет собой торфяную основу, смешанную с ризобактери-

ями (5—8*10

клеток в 1 г торфа). Производство ризотрофина

разработано во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г.

Санкт-Петербург).

Технологический процесс производства ризотрофина включает

подготовку клубеньковых бактерий и получение инокулята, подго-

товку торфа, "обсеменение" торфа ризобактериями (отбор видов'

с учетом целесообразных рекомендаций по выращиванию соответ-

ствующих растений-"хозяев").

В производстве используют клубеньковые бактерии, быстро

или сравнительно медленно размножающиеся на простых средах,

содержащих растительные экстракты или отвары, сахарозу (рН

6,8—7,0)

— для первых, почти то же самое — для вторых, но

добавляют глюкозу, маннит, сахарозу.

Инокулюм готовят в условиях умеренной аэрации на подобных

средах, но дополнительно вводят неорганические соли: фосфаты,

сульфаты, карбонаты (температура 28—30°С); необходимо пенога-

шение. Накапливают примерно 5 млрд клеток в 1 мл. Такую

суспензию вносят в "кислый" торф (рН

3,0—6,0)

при 10-15°С.

Предпочтительнее использовать древесно-осоковые или осоковые

торфа с удельной площадью поверхности порядка 300 м

/г.

Торф до "обсеменения" бактериями должен быть специально

подготовленным —гомогенным, подсушенным, размолотым, ув-

лажненным, смешанным с мелом, расфасованным в полиэтилено-

> 456

вые пакеты по 150—160 г и простерилизованным методом радиа-

ционного облучения — 2,5 Мрад. В подготовленный торф "инъе-

цируют" 50-60 мл суспензии бактерий (в торфе должно содержать-

ся 0,5—1 млрд. клеток/г). После этого содержимое пакетов пере-

мешивают во вращающемся барабане и продукт сохраняют до

полугода при

5—10°С

— применительно к быстро растущим ризо-

бактериям и при 12—15°С

—

применительно к медленно растущим

ризобактериям. Расход ризотрофина — 200 г на гектарную норму

семян любых бобовых растений.

В странах Юго-Восточной Азии используют цианобактерии

Anaboena azollae, обитающие в полостях листьев папоротника

Azolla. Азоллу выращивают в специальных прудах, откуда ее

вывозят по назначению. Такая симбиотическая ассоциация —

хороший "удобритель" азотом рисовых полей.

В последние годы много внимания уделяют бактериям рода

Asospirillum — активному азотофиксатору, обитающему в почве

(реже — на надземной части растений) в ассоциации с кукурузой,

просом, сахарным тростником и др.

Гибберелловая кислота — синтезируется микромицетом

Gibberella fujikuroi (ее несовершенная форма Fusarium

moniliforme); она в качестве равноправного члена находится в ряду

гиббереллинов

Al...,

A —

группы растительных гормонов сложного

химического строения, ядром которых является тетракарбоциклич-

ный гиббан. Его образование представляет собой частный случай

биосинтеза терпенов, как и синтез каротинов и витамина D.

гиббан

гибберелловая кислота

Все известные гиббереллины во многом сходны с гибберелло-

вой кислотой и в зависимости от условий культивирования проду-

цента могут варьировать в той или иной степени.

Биосинтез гибберелловой кислоты происходит, начиная с аце-

тата и двух молекул АцКоА через ряд промежуточных продуктов,

в том числе — через мевалоновую кислоту, изопентенилпирофос-

фат и циклизованные структуры. Образование и накопление гиб-

береллинов

—

процесс длительный, он занимает до

суток и более

457

при поверхностном выращивании продуцента при 25°С, до 9—10

суток — при глубинных ферментациях. Питательные среды для

G.fujikuroi обычно содержат 4—6% источника углерода (глюкозу,

сахарозу или глицерин), 0,7% источника азота (соли аммония,

нитрат или пептон), 0,3% неорганического фосфата, 0,05% магния

сульфата, микроэлементы, особенно — железо, медь, марганец,

молибден, серу, цинк; рН среды устанавливают на уровне

3,0—4,0

соляной кислотой. Выход гиббереллинов при этом достигает 200

мг/л культуральной жидкости (поверхностный способ) или 1 г/л

(глубинное культивирование в ферментаторах).

С учетом близости структур гиббереллинов гибберелловую

кислоту получают в виде суммарного препарата из вакуум-упарен-

ной культуральной жидкости после отделения мицелия продуцента.

Гибберелловую кислоту применяют в сельском хозяйстве в

качестве стимулятора роста различных растений с максимальным

эффектом в дозе 1 мкг на растение.

Фузикокцин — относят к регуляторам роста растений гормо-

нального типа. Он индуцирует корнеобразование у многих древес-

ных и плодовоягодных культур, стимулирует прорастание семян

моркови, томатов, сахарной свеклы и других сельскохозяйствен-

ных растений (Г. С. Муромцев, 1986).

По химическому строению фузикокцин относят к карботри-

циклическим дитерпенам, в которых тройной цикл является агли-

коном в гликозидной структуре.

з .

сосон

j=CH—

С—О—С.Н. J

сн

сн,—сн

пнЛ.

Х*т-снгОсоснз

фузикокцин

сн

Фузикокцин образуется грибом Fusicoccus amygdali. Продукт

получают при глубинной ферментации в периодическом режиме

на средах с глюкозой или сахарозой и соевой мукой; фузикокцин

затем экстрагируют бутилацетатом или хлороформом из культу-

ральной жидкости, сорбируют активированным углем, повторно

очищают и кристаллизуют из этилацетата.

В настоящее время активно изучают грибы Botrytis cinerea и

Cercospora rosicola — продуценты фитогормона — абсцизовой

458

кислоты, а также некоторые виды рода Cladosporium — продуцен-

ты фитогормонаколшленина, которые, очевидно, в скором времени

будут производить в виде коммерческих препаратов.

абсцизовая кислота

котиленин

9.3.7. Получение микробных полимеров. Биотехнологические

процессы получения микробных полимеров освоены в различных

масштабах применительно к белкам, углеводам, липидам и неко-

торым полимерным конъюгатам.

Получение белков. Белки микробного происхождения находят

применение в здравоохранении, пищевой промышленности, жи-

вотноводстве, реже — в других отраслях производства. Разнонап-

равленность практического применения зависит от химической

структуры, молекулярной массы и физико-химических свойств

белков.

Ферментные белки. Ферменты, будучи биокатализа-

торами реакций в любом организме, давно приобрели важное

практическое значение. Первый патент на грибную амилазу (та-

кадиастазу) зарегистрировал И. Такамине в 1894 г. К настоящему

времени описано свыше 3000 ферментов, из которых лишь немно-

гие изготавливают в промышленности, то есть резерв здесь для

биотехнологии поистине огромен.

В качестве лекарственных средств применяют гидролазы: гиа-

луронидазу (она может быть микробного и животного происхож-

дения, например, лидаза), протеазы, липазы, амилазу, из других

классов — L-аспарагиназу, стрептазу в составе препарата стрепто-

деказы, стрептокиназу и др.

В хлебопекарной и текстильной промышленности применяют

амилазы, в мясо-молочной и кожевенной промышленности —•

пептидазы; в сельском хозяйстве используют такие полифермент-

459

ные препараты, как глюкаваморин, пектаваморин и др. Большое

количество ферментов приходится на моющие средства.

Рестрикционные эндонуклеазы — важнейший "инструмент"

для выполнения генно-инженерных работ. Часть производимых

рестриктаз приведена в таблице 20.

К началу 90-х годов текущего столетия объем продажи фермен-

тов на мировом рынке оценивали в сумме около 200 млн. долларов

в год с ежегодным возрастанием на 10—15%. Лишь зарубежные

фирмы производили свыше 200 наименований ферментных пре-

паратов, в странах СНГ — около 40; примерно 40—50% мировой

потребности в ферментах обеспечивается датской фирмой "Ново

индастра".

В клетках микроорганизмов найдено порядка 1500 различных

ферментов, причем в каждой клетке, по расчетам, содержится в

среднем 100 тыс. молекул ферментов; на единичный энзим прихо-

дится 0,1—5% от общего количества белка. ,

сравнительном плане получение экзоферментов осуществля-

ется с меньшими затратами усилий и средств, чем получение

эндоферментов. В то же время успехи в области генетической

инженерии явились мотивом к расширению ассортимента произ-

водимых ферментов, в том числе

:—

для научных целей (пример с

рестриктазами).

За последние 40 лет почти все новые ферментные препараты

получены с помощью микроорганизмов, что объясняется быстро-

той размножения большинства микробов на доступных и относи-

тельно дешевых питательных средах, а также возможностью их

изменения в желаемом направлении с помощью методов генети-

ческой инженерии — созданы предпосылки трансформировать

любой клеточный белок во внеклеточный.

Ферменты и ферментные системы могут функционировать in

vitro,

однако их источником являются живые организмы, содержа-

щие генетическую программу о синтезе первичных метаболитов,

или ферментов. Поэтому вид микроба накладывает отпечаток на

характеристику биокатализатора. Так, например, бактерии-термо-

филы синтезируют ферменты, которые будут эффективны при

повышенных температурах скорее, чем ферменты психрофилов.

любом случае для производства важны продуцент и образуемый

им фермент (целевой продукт), о которых следует иметь представ-

ление в возможно полном объеме.

Промышленный штамм должен быть апатогенным (кроме спе-

циальных случаев), образовывать в больших количествах преиму-

460

щественно один фермент и минимум

—

других,

если не преследуют

цель получать ферментный комплекс; желательно, чтобы такой

штамм не продуцировал аллергенные и токсические субстанции,

и, наконец, хорошо развивался в крупномасштабных ферментато-

рах.

На каждой стадии процесса ферментации необходимо контро-

лировать чистоту культуры — продуцента и скорость его размно-

жения, рН среды, отсутствие фаголизиса и выход фермента.

Установлено, что одна жизнеспособная спора микроба-крнтами-

нанта способна "заразить" объем среды, равный

10—50 м

Поэтому

I важно убедиться в "монолитности" инокулята и в полной стериль-

ности подготовленного к засеву ферментатора. К сожалению, в

промышленных биореакторах трудно добиться абсолютно полной

• стерильности, поэтому целесообразно засевать питательную среду

в них большим по объему и физиологически активным посевным

материалом. Таким приемом обеспечивают конкурентоспособ-

ность продуцента при возможном попадании в среду его обитания

любого постороннего микроба. Этому же способствует уменьше-

ние числа фаз размножения продуцента, если основной фермен-

> татор засевают культурой, находящейся в продуктивной фазе.

Так же как и в других биотехнологических процессах здесь

предусматривают выращивание продуцента по схеме: лиофилизи-

рованная стандартная культура -» рост в колбах на качалке до

I log-фазы -» перенос инокулята в ферментаторы малой емкости

| (300—500 л) — инокуляторы -» инокулят через 10—Ш часов (в

зависимости от процесса) в const-фазе подают в промежуточный

I ферментатор — посевной аппарат емкостью от 3 до 5 м

-»

| посевным материалом в стационарной фазе засевают головной

| (основной) ферментатор емкостью 50 м

. Среда в инокуляторе,

I посевном аппарате и головном ферментаторе, как правило, одно-

j типна. Если основной биореактор имеет объем 3—5 м

, то исклю-

чают промежуточную фазу подготовки инокулята (посевного ма-

! териала) в посевном аппарате, то есть в таком случае этот аппарат

является головным.

: Микроорганизм-загрязнитель обычно выявляют при микроско-

пии или культурально при высеве на агаризованные питательные

среды; бактериофаги обнаруживаются на основании замедленного

роста продуцента и, как следствие, по снижению его продуктив-

ности; рН среды контролируют с помощью рН-метров.

461

В производственных условиях ферменты обычно получают в

периодических режимах культивирования продуцентов. Основная

ферментация может продолжаться от одних до семи суток в

зависимости от микроба и фермента. Примерная биотехнологиче-

ская схема получения ферментов показана на рис. 137.

Перед завершением ферментации культуральную жидкость

быстро охлаждают до

+5°С,

при необходимости доводят рН до

требуемого показателя; предварительная обработка жидкости мо-

жет заключаться в добавлении флокулянтов при последующих

центрифугировании и вакуум-упаривании (при температуре ниже

35°С).

После этого к упаренному центрифугату добавляют раствор

электролита, чтобы освободиться от возможных загрязнителей

(часть клеток продуцента, крупные частицы из среды, не отделив-

шиеся при центрифугировании). Раствор затем фильтруют на

вакуум-барабанном фильтре с намывным слоем, фильтрат посту-

пает в рефрижератор, из которого в одном случае (для получения

жидкого концентрата фермента) его подвергают ультрафильтра-

ции, консервируют, пропускают через мембранный фильтр и

собирают в накопителе, откуда он поступает на фасовку (на схеме

— путь

А).

другом случае (на схеме — путь

Б)

из рефрижератора

(позиция 9) раствор фермента пропускают через мембранный

фильтр, добавляют к нему электролит, например, натрия сульфат,

для высаливания ферментного белка, пропускают через фильтро-

пресс. Фермент собирают и смешивают с встречным потоком

раствора концентрата того же фермента (путь А) с последующим

высушиванием в вакуум-распылительной сушилке. Сухой экстракт

собирают в накопителе, стандартизуют по активности и подают на

расфасовку и упаковку.

Жидкий ферментный концентрат, при необходимости, разбав-

ляют дистиллированной водой до требуемой активности, добавля-

ют к нему стабилизаторы (натрия хлорид, бензоаты, сорбинаты) и

передают на фасовку и упаковку. Из жидкого концентрата фермент

может быть осажден спиртом или ацетоном (равно как и высолен

электролитом), высушен, измельчен, смешан с наполнителем (на-

трия хлоридом, декстринами, крахмалом) до требуемой активности

и упакован.

Когда необходимо выделить фермент в более очищенном виде

и без большинства примесных (ферментных и неферментных)

полидисперсных белков, то в схему можно включить стадии диа-

лиза и гель-хроматографии.

462

Фактически целевое назначение фермента предопределяет сте-

пень его очистки — она должна быть более высокой в случае

получения фермента как медицинского препарата.

Микробные эндоферменты получают по следующей схеме:

Охлажденная до 5°С культуральная жидкость

Жидкость (отход)

•

центрифугирование и

промывание клеток

Клетки

| дезинтеграция клеток

Цитозоль

центрифугирование

"Обрывки" клеток «

(отход)

Ферментный* супернатант

различные методы очистки

Раствор фермента

Дезинтеграцию клеток можно проводить различными способа-

ми:

обработкой соответствующими ферментами-гидролазами, ме-

ханическим разрушением и пр.

Обработку супернатанта (надосадочной жидкости) проводят с

целью освобождения от нуклеиновых кислот (действие нуклеаза-

ми,

высокомолекулярными катионами-полиэтилениминами и др.),

от других белков (хроматография).

Получение очищенных эндоферментов — дело дорогостоящее

и поэтому стремятся их не выделять из клеток, а использовать в

иммобилизованном виде нативные клетки, способные осуществ-

лять желаемые каталитические функции.

В ближайшем будущем получение ряда ферментных белков

потенциально возможно

помощью рДНК-биотехнологии, которая

ныне затрагивает практически все сферы биотехнологии.

Важнейшим направлением в реализации каталитических фун-

кций биокатализаторов является их иммобилизация, что обеспечи-

вает многократное использование фермента, пролонгацию его

стабильности в активной форме, возможность применения в не-

463

прерывных биотехнологических процессах, исключение попада-

ния фермента в целевой продукт.

Иммобилизованные ферменты — это основа "инженерной

энзимологии" — самостоятельной ветви биотехнологии, впервые

оформившейся в 1971 г. Иммобилизация фермента — "это любое

ограничение свободы движения белковых молекул (или их фраг-

ментов!) в пространстве" (И. В. Березин, 1987).

В 3-й части книги частично представлен материал по иммоби-

лизации ферментов. Здесь лишь перечислим отдельные примеры

для промышленнозначимых биокатализаторов. Наипростейшим

методом закрепления бактериальной глюкозоизомеразы было вза-

имодействие фермента с ионообменным носителем, в частности,

с ДЭАЭ-целлюлозой — удерживание фермента за счет ионного

взаимодействия. Такой же способ иммобилизации был реализован

в отношении грибной аминоацилазы (Ф), использующейся в про-

мышленности для получения L-аминокислот из синтетических

рацемических ацил — DL-аминокислот:

Ацил - DL

—

аминокислота

—

аминокислота + ацил

—

амино

—

кислота

Глюкозоизомеразу с определенным успехом иммобилизуют на

окиси алюминия — адсорбционное взаимодействие. При этом

могут быть иммобилизованы ощутимые количества ферментов.

Ковалентноевзаимодействие ферментного белка возможно на

алкиламинированном стекле, на керамике и пр. Однако такая

иммобилизация характеризуется снижением активности фермен-

тов и их эффективности в работе.

Наипростейшим способом иммобилизации оказалось сохране-

ние фермента внутри клеток продуцента. Так, прогревание стреп-

томицета, образующего глюкозоизомеразу, при 60—80°С сопро-

вождается отмиранием культуры наряду с избирательным разру-

шением автолизинов. Глюкозоизомераза остается активной, а ста-

билизированные таким образом клетки становятся проницаемыми

для малых молекул.

Внутриклеточный фермент может быть ковалентно сшит и,

следовательно, фиксирован с помощью ковалентного связывания

глутаровым альдегидом.

Микробные клетки

—

продуценты ферментов и сами ферменты

могут быть заключены в различные гелевые и волокнистые струк-

туры, в микрокапсулы, липосомы.

464