Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

40 г/л); во втором случае образуется натрия глюконат, который

хорошо растворим в воде (до 400 г/л при 30°С и 569 г/л

•—

при

80°С) и поэтому концентрацию глюкозы в исходной среде можно

повысить до 35%.

При использовании мела ориентировочный состава питатель-

ной среды может быть следующим (%): 10—15 глюкозы; 0,016 —

магния сульфата; 0,02 — калия дигидрофосфата; 0,04 — аммония

гидрофосфата и 2,6 — кальция карбоната. Вместо глюкозы можно

применять гидролизаты крахмала.

Если культуральную среду подтитровать раствором едкого на-

тра (вместо нейтрализации мелом), то содержание глюкозы в среде

доводят до 350 г/л; выход натрия глюконата тогда составит

95%

от

внесенного углевода.

Технологический процесс реализуют либо в периодическом,

либо в непрерывном режиме. Второй из них более эффективен по

скорости и по выходу целевого продукта (свыше 95% от использо-

ванной глюкозы).

Механизм образования глюконовой кислоты связан с окисле-

нием глюкозы кислородом при участии фермента глюкозооксида-

зы (Е):

Н0Н

С-СН-(СН0Н)з-€Н0Н^1».

Н0Н

С—СН—<CH0H)v^rC=O

^+-

р-Вююио-мюм

Н0Н

С-(СНОН)

-СООН

глюкономя кислота

При этом вначале образуется P-D-глюконо-б-лактон, который

затем гидролизуется до глюконовой кислоты.

Учитывая тот факт, что селекционированный штамм A.niger

продуцирует почти одну глюконовую кислоту, то для ее выделения

в виде натриевой соли культуральную жидкость просто отфильт-

ровывают от мицелия, упаривают и высушивают. В случае необ-

ходимости получения кислоты, технический натрия глюконат пе-

рекристаллизовывают и химически переводят в свободную кисло-

ту.

Аппаратурное оформление технологического процесса получе-

ния глюконовой кислоты во многом напоминает производство

лимонной кислоты глубинным методом.

Отделенный мицелий гриба используют для выделения фер-

мента глюкозооксидазы, полезной в пищевой и фармацевтической

промышленности. Глюконовую кислоту и ее соли широко приме-

425

няют на практике. Так, кальция глюконат является лекарственным

препаратом, ускоряющим свертывание крови (его назначают при

острых и хронических кровотечениях); натрия глюконат исполь-

зуют для изготовления моющих средств, глюконовую кислоту

применяют в фотографии, литографии, в изготовлении красок, для

очистки металлов и т. д.

Получение итаконовойкислоты. Итаконовая, или метиленян-

U«u

синтезируется плесне-

таоная кислота иин _

итаконом» кнспота

ЫМИ ГрибаМИ ИЗ рода

Aspergillus и, в частности, A.itaconicus и Aterreus. Промышленное

производство базируется на использовании A.terreus. Образование

итаконовой кислоты из углеводных источников сопряжено с ЦТК

и непосредственным ее предшественником является цис-аконито-

вая кислота:

НООС—0¾ —С-СН

—С00Н

-^U Н00С—СН

—С=СН—С0ОН

—^

соон соон

лимонная кислота цис-аконитовая кислота

••

Н00С—СН

—С^ЯЦ

соон

итаконовая кислота

Реакцию дегидратации лимонной кислоты катализирует фер-

мент аконитат-гидратаза, а декарбоксилирование происходит при

участии аконитатдекарбоксилазы, обнаруженной у A.terreus.

Технологический процесс получения итаконовой кислоты схо-

ден с процессом получения лимонной кислоты, то есть фермента-

цию продуцента осуществляют либо поверхностным, либо глубин-

ным методом, используя в качестве посевного материала конидии

гриба — отселекционированного высокопродуктивного штамма

A.terreus (например, ЭУУ-417).

Поверхностное выращивание продуцента проводят в кюветах,

глубинное — в ферментаторах, оборудованных мешалками и бар-

ботерами.

Итаконовая кислота в концентрации 7% йнгибирует рост про-

дуцента, поэтому в процессе ее биосинтеза необходима нейтрали-

426

зация кислоты каким-либо основанием. Для этой цели чаще ис-

пользуют аммония гидроксид, с помощью которого поддерживают

рН среды равным 3,8 и добиваются образования 150—200 г/л

целевого продукта. Активаторами биосинтеза итаконовой кислоты

выступают катионы магния, меди и цинка. Источником углерода,

как правило, служит меласса, разбавляемая водой до 8%-го содер-

жания углеводов. Туда же добавляют (г/л) магния сульфат — 4,5,

аммония нитрат — 2,5, цинка сульфат — 0,0044, кукурузный

экстракт —4 мл, желтую кровяную соль — 0,25. Эта среда или

близкие к ней другие варианты сред применяют для поверхност-

ного и глубинного (при уменьшении сахара на 1—2%) культивиро-

вания продуцента. Уровень рН среды, равный

1,8—2,3,

является

оптимальным для биосинтеза итаконовой кислоты. Длительность

культивирования в кюветах обычно составляет 10—12 дней при

35°С;

в случае глубинного культивирования длительность процесса

сокращается до 2—3 суток при аэрировании со скоростью 1/8

объема воздуха в минуту на один объем среды. i

Выход итаконовой кислоты в первом случае достигает 36—38%

в расчете на

100

г потребленной глюкозы, во втором

—

65%

и выше.

После окончания ферментации мицелий сепарируют, промы^.

вают, отжимают и передают в сборники отходов; культуральн'у

жидкость осветляют активированным углем, упаривают менее.

чем

до 1/10 первоначального объема и передают на кристалли'зацик

итаконовой кислоты. После этого ее центрифугируют, высуши

ют и фасуют. Дополнительную очистку кислоты можно пров'

перекристаллизацией ее из

25%

водных растворов.

Итаконовую кислоту применяют в химическом

СИР

кокачественных смол, волокон типа "нитрон", детерг'

ственных веществ, красителей и других органическ~

Из других органических кислот, синтезируг

целиальными грибами (например, Rhizopus г*

время привлекала внимание ученых ф у

т а, являющаяся транс-изомером цис-ма

•

Н—С—СООН

СООН—С—Н

фумарома кислота

Фумаровая кислота способна трансформироваться в малеино-

вую,

широко используемую для химического синтеза некоторых

лекарственных веществ, смол, лаков и красок. Однако конкурен-

тоспособность синтетического малеинового ангидрида (из бензиг

на) для тех же целей служит веским ограничителем развития

производства фумаровой кислоты путем микробного синтеза. И,

очевидно, это будет продолжаться до тех пор, пока нефтяные

запасы в мире значительно не оскудеют.

9.3.3.

Получение антимикробных веществ. К антимикробным

средствам относят антисептики, дезинфектанты и химиотерапев-

тические вещества. Антисептики — это химические вещества,

неизбирательно и губительно действующие на микроорганизмы (в

том числе — патогенные), находящиеся на поверхности тела и

слизистых оболочек открытых полостей. Дезинфектанты — это,

в основном, антисептики, действие которых направлено на пато-

генные микроорганизмы, находящиеся на (в) объектах внешней

среды. Химиотерапевтические средства — это вещества синтети-

ческого и природного происхождения, избирательно и губительно

действующие на патогенные микробы, клетки злокачественных

опухолей и гельминты.

Антисептики, дезинфектанты, неорганические и синтетиче-

ские химиотерапевтические средства не имеют непосредственного

отношения к биотехнологии. В то же время подавляющее боль-

шинство антибиотиков получают при ферментации микробов-про-

дуцентов, или, в других случаях, применяют "антибиотическое

ядро"

для синтеза целевого продукта — полусинтетического анти-

биотика. Известны единичные антибиотики (ранее получаемые с

помощью биосинтеза или получаемые таким путем и ныне), кото-

рые в настоящее время производят на предприятиях органического

синтеза (левомицетин и некоторые другие).

Таким образом, определение понятия "антибиотики" теперь

относят к веществам природного, полусинтетического и, реже,

синтетического происхождения, которые в малых концентрациях

ингибируют рост (размножение) каких-либо микроорганизмов.

Продуцентами одних антибиотиков (например, бацитрацина, по-

лимиксина и др.), являются бациллы, других — актиномицеты

(например, актиномицинов, гентамицинов, канамицинов), третьих

— нитчатые грибы (например, гризеофульвина, пенициллинов,

цефалоспоринов), четвертых—неспорообразующие бактерии (на-

пример, монобактамов).

428

H^-CH-CH

С=(СНз)

^С—

—СН—

СОО

6-АПК

Антибиотики — р-лактамы

Пенициллины. Пенициллин впервые получен из

культуральной жидкости в аморфном, а затем—в кристаллическом

виде А. Флемингом, X. Флори и Е. Чейном в 1940 г. До сих пор

пенициллиновые антибиотики составляют наиважнейшую группу

химиотерапевтических средств. Ядром пенициллинов является 6-

аминопенициллановая кислота, или 6-АПК, которую используют

для получения полусинтетических пенициллинов.

Один водород в аминогруппе 6-АПК

может быть заменен на какой-либо ра-

дикал

(R),

усиливающий и/или расширя-

ющий (изменяющий) антимикробный

спектр полусинтетического производно-

го.

Обычно 6-АПК получают из бензил-

пенициллина (пенициллина G).

настоящее время в различных странах производят биосинте-

тические (с помощью Penicillium notatum или P.chrysogenum) ан-

тибиотики и на их основе — полусинтетические антибиотики

—

Р-лактамы, перечисленные в таблице 45.

Цефалоспорины — другая обширная группа

экстрацеллюлярных Р-лактамных антибиотиков, в которых шести-

членное дигидротиазиновое кольцо соединено с Р-лактамным коль-

цом. Благодаря этому ядром цефалоспоринов является 7-аминоце-

фалоспорановая кислота, или 7-АЦК (цефемовое ядро), впервые

выделенная в ходе очистки

-NH-CH-cA

2CH,

0=С—

-N5 3

-CH-R

СОО"

7-АКЦ

R, =~ООС—СН—(СН^—СО-

=— О—СО—СН

429

цефалоспорина С (проду-

цент Cephalosporium

acremonium), в котором

Известно около 20 це-

фалоспоринов, созданных

методом полусинтеза из

АЦК: цефалоридин (цепо-

рин),

цефуроксим, цефок-

ситин, цефалотин, цефа-

цетрил, цефалексин, цефа-

золин, цефаридин, цефо-

таксим, цефтриаксон, цеф-

тазидим и др.

Таблица

45.

Природные

полусинтетические пенициллины

Название

Бензилпенициллин

Феноксиметил-

пенициллин

Метициллин

Оксациллин

КлохсациЛлин

Флуклоксациллин

Ампициллин

Амоксициллин

Карбенициллин

Тикарциллин

Карфециллин'

Кариндациллин*

Пивампициллин*

Радикал, R

Бензил

Феноксибензил

2,6-

Диметоксифенил

5-Метил-З-фенил-

4-изоксазолил

З-о-Хлорфенил-

5-метил-

4-изооксазолил

2-Хлор-6-фтор-

фенил-5-метил-

4-изоксазолил

a-D- (-)

-аминобензил

P-OKCH-O>D-(-)-

аминобензил

Натриевая соль

cc-D-

(-)

-карбоксибензил

Натриевая соль

карбокси

(тиен-

3-ил)

ацетил

Фенил

(феноксикарбонил)

-ацетил

Инден-5-ил-

оксикарбонилфенил-

ацетил

Аминофенилацетил

Эффек-

тив-

ность

per os

—

Устойчивость

р-лактамазам

Staph,

aureus

—

грам-

отриц.

бакте-

рий

—

Гидро-

лизует-

ся

после

всасы-

вания

—

430

Продолжение табл. 45

Название

Таламцициллин*

Бакампициллин*

Пиперациллин**

Азлоциллин**

Мезлоциллин**

Мециллинам**

Пивмециллинам**

Радикал, R

См.

ампициллин""

См.

ампициллин*

Диоксопиперазин-1 -

ил-карбонил-амино

(фенил) ацетил

4-Оксопиразолидин-

1 -ил-карбонилами-

но-(фенил) ацетил

З-Метилсульфонил-

оксоимидазолидин-

1 -ил-карбонилами-

но-(фенил) ацетил

Пергидроазепин-

1-ил-метилен

См.

мециллинам"

Эффек-

тив-

ность

per os

—

— •

—

Устойчивость

к Р-лактамазам

Staph.

aureus

—

грам-

отриц.

бакте-

рий

—

Гидро-

лизует-

ся

после

всасы-

вания

—

Примечание: 'эфиры карбенициллина; *зфиры ампициллина; **замещенные ампицил-

лины; **6-р"-амидинозамещенные пенициллины; в позиции 3 тиазолидино-

вого цикла (в форме сложного эфира): "-пивалоилоксиметил, °°3-окСо- 1,

3-дигидроизобензофуран-1-ил,

2-этоксикарбонилоксиэтилили 4-эток-

сикарбонилоксибугил;

(

)

— ответ положительный; (—) — ответ отрица-

тельный; (о) — не действует на грамположителъные бактерии; (?) —

информация отсутствует.

Боковые цепочки, содержащие 2-аминотиазолил как

в цефо-

таксиме, цефтриаксоне, цефтазидиме и некоторых других, усили-

вают активность цефалоспоринов против стрептококков и грамот-

рицательных бактерий; иминометоксигруппа в той же позиции,

например, в цефуроксиме, обеспечивает стабильность антибиоти-

ка против плазмидо-опосредованных Р-лактамаз, и т. д.

1-Оксацефемы

— сходны с цефалоспоринами, у которых

атом серы в дигидротиазиновом {цефемовом) кольце замещен на

431

*Ч 2 антибиотик

л7

с—со—

N—ОСН

2-аминотиаэоп-4-ип-

(метоксиимино)ацетил

радикал тот же

N г-

с—COONa

СН

—

О СО—СН

Оацатил

_J*.Ao

6-гидровси-2-метип-

5-оксо-2,5-дегидро-

-1,2,4-триазин-З-ип

-TWO...натриевая

соль

пиридил

цвфотаимш

цвфтриагсон

цафтаэидим

2-аинио-0-{1н<арбо«*1

1,1-ДИМвтнл)-4-тиаэол-

карОогмдроиааюап...

натриевая соль

кислород.

Представителем такой группы антибиотиков является

широкоспектральный

латамоксеф(мексалактам),

котором

7-а-метоксигруппа

стабилизирует

молекулу,

как

таковую,

равно

как и придает

устойчивость

и к большинству

(3-лактамаз.

осн

он

у—

сн

—

СО—

NH-C—

СН

м-

^=^

COON.

o=i—м^^с—сн

—S-4^

COONa

432

Клавамы — р-лактамные антибиотики, отличающиеся от

пенициллинов тем, что в тиазолидиновом кольце последних сера

заменена на кислород {клавемовое оксазолидимовое кольцо) и в

позиции 6 нет боковой цепи. Та-

кой антибиотик — клавулановая А*\

кислота изолирована из

^| —CHS С«СН— CH2OH

Streptomyces clavuligerus. Она it. I J

слабо активна против бактерий, 1т \ч i'

но является потенциальным ин- •••••• __ .

'С ООН

гибитором стафилококковой В-

а с

кпшупановая шепота

лактамазы и р-лактамазы, обра-

зуемой грамотрицательными

бактериями. Сочетание широкоспектральной клавулановой кисло-

ты с 8-лактамазочувствитёльными ампициллином и амоксицилли-

ном является основой комбинированного препарата аугментин.

1 — Карбапенемы — это новое семейство В-лактамных

антибиотиков, представляющих собой аналоги пенициллинов или

клавамов, в которых сера у первых и кислород у вторых замещены

на углерод:

С Но

•¥Г"Л

0=С

—ЧСН

1-карбапенемовое кольцо

К этому семейству относятся оливановые кислоты и тиенами-

цин.

Их продуценты — стрептомицеты. Эти антибиотики обладают

широким

антимикробным спектром и являются выраженными

ингибиторами В-лактамаз.

сн

и | сн,

Hli,,

I '•/ \ .R

•с—с—с с^

°3

o=i—

J-J-соом.

общее строение оливановьи кислот (продуцент

•

Streptomyces olivaceus)

/*~\~

| f ^

»"*

I II

0=C N С—COON.

тиеншицин (продуцент

•

Streptomyces olivaceus)

433

Нокардицины — новая группа.р-лактамных антибиотиков,

продуцируемых бактериями из рода Nocardia. Выделены нокарди-

цины А, В, D, E, F, G. Наиболее активным из них против грамот-

рицательных бактерий (но не грамположительных) оказался но-

кардицин А.

CH-CH

-CH

NOH 5 0.

*="

o=C—N

НООС^

^fo

нокэрдицин А (продуцент - Nokardia sp.)

Монобактамы — это моноциклические монобактамные

антибиотики, продуцируемые штаммами бактерий, например

Pseudomonas acidophila и Gluconobacter species. Их ядром является

3-аминомонобактамовая кислота (3-АМК). Ее можно получить из

природных монобактамов или из

6-АПК.

Природным высокоактивным против грамотрицательных бак-

терий и устойчивым к действию р-лактамаз оказался азтреонам.

Однако он не активен против грамотрицательного анаэроба

Bacteroides fragilis, способного продуцировать Р-лактамазу, актив-

ную против данного антибиотика. Комбинация клавулановой кис-

лоты с монобактамами также неэффективна против этого микроба.

здмк

<и

азтреонам (продуцент - Pseudomonas acidophila)

Антибиотики-тетрациклины — это

широкоспектральные антибиотики, активные против бактерий;'их

продуцентами являются стрептомицеты. Некоторые тетрациклины

относятся к ряду полусинтетических препаратов.

Антибиотики-гликозиды. Среди них можно

выделить структуры, содержащие О-, S- и N-гликозидные связи.

К числу первых относят аминогликозидные антибиотики и ново-

434