Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

биоцин,

ко

вторым

—

клиндамицин

линкомицин,

третьим

—

некоторые нуклеозидные антибиотики.

Антибиотики

—

О-гликозиды. Аминогликозиды

— содержат аминосахара

своей структуре. Большинство

из них

(канамицины, гентамициныи др.) продуцируется актиномицетами;

тобрамщин

—

аналог канамицина

(З'-дезоксиканамицин

В);

нетштицим является полусинтетическим производным сизомици-

на (N-этилсизомицин).

Все антибиотики-аминогликозиды обладают широким спект-

ром действия

на

различные патогенные бактерии.

»tc

—»

^^•^^

(продуцент

Strptarnyces karwnycetieus)

гшамиминм

мшшт

IN—-о

он

-*^сн*ын

он

Hi ^1

CHj

ННСИ

н нн

СН

«И2

NMj

гснтамицины

'сн

ын

он

но

но.

£^°

"Л

НО

«Ни

он

О^ч ^7NHCOCH(CH

)

но

сн

он

(полусжплмасай амиатшояц -

производим

шшмцин*)

Его продуцентом является мутант

Micromonospora sagamiensis

KYI

1535.

Антибиотики

—

макроли-

ы —

имеют

О-гликозидные

связи;

они

продуцируются стрептомицетами

прояв-

ляют активность против большинства грам-

13.)

Продуцентом

ген-

тамицинов является

Micromonospora

purpurea,

сагамици-

на

—

M.sagamiesis.

Сизомицин

по

строе-

нию близок гентами-

цинам

отличается

от

них лишь одним цик-

лом

положительных и некоторых грамотрицательных бактерий

(Neisseria spp., Haemophilus influenzae и Legionella pneumophila).

На практике чаще применяют эритромицин, олеандомицин, три-

ацетилолеандомицин и спирамицин. Они содержат в своей струк-

туре макроциклическое лактонное кольцо, связанное с углеводны-

ми остатками, из которых аминосахар (если имеется) всегда рас-

полагается ближе к макролактону, чем нейтральный углевод.

сн

ои

спирамицин I (продуцент - Streptomyces amboiadani)

Олеандомицин, его эфир

—

триацетилолеандомицин и спирамицин

сходны по спектру антибактериального действия с эритромицином,

но несколько слабее его по активности.

Новобиоцин продуцируется культурой Streptomyces spheroides

и другими видами. Антибиотик активен против возбудителей

пневмонии, некоторых кишечных и раневых инфекций, ангин и

флегмон. По химической структуре — это О-гликозид (амидогли-

козид), агликон которого существенно массивнее углеводной час-

ти.

Оливомицин — О-ГЛИКОЗИДНЫЙ антибиотик, в котором сахари-

стая часть представлена триаозои и биозой, между которыми как

бы "вставлен" агликон-оливин (хромомицинон).

Оливомицин является представителем большой группы анти-

биотиков — аналогов ауреоловой кислоты (митрамицина), актив-

ных против грамположительных бактерий и отдельных опухолей.

Оливомицин продуцируется Streptomyces olivoreticuli.

Дауномццин (рубомицин) — О-ГЛИКОЗИДНЫЙ антибиотик из

группы,

антрациклинов, образуемый Streptomyces species. Углевод-

ный компонент в нем — даунозамин, или 2, 3, 6-тридезокси-З-ами-

ноликсоза. Антибиотик обладает противомикробным и противо-

опухолевым действием.

436

дауномицинон-агликон

красного цвета

дауномицин

Иммуносупрессивным и противоопухолевым действием обла-

дает О-гликозидный антибиотик блеомицин, содержащий также и

пептидные связи. Он образуется стрептомицетом; углеводный

компонент в нем представлен амидобиозой.

Ристомицин А (ристоцетин) — О-гликозидный антибиотик, в

составе которого имеется циклизованная агликоновая часть (цик-

лопентит) и углеводный компонент, включающий ристозамин,

маннозу, арабинозу, глюкозу и рамнозу. Ристомицин активен

против грамположительных бактерий.

Антибиотики —

S-гликозиды

Из этой группы антибиотиков наиболее известны линкомицин

и клиндамицин, агликоном которых является метил. Другими сло-

вами — это метил-5-гликозиды. Из них клиндамицин является

производным линкомицина, у которого гидроксил в позиции 7

заменен на хлор.

сн

^Э

7 /

М/с

сн

но-4—

СО—NH

А-К

>э—

сн.

сн

•?Ч.

сн

i/co—ym—рн

линкомицин

(продуцент - Sfevptomyces Ikttokienss)

клиндамицин

4S-CH

Углеводная часть обоих антибиотиков представлена 6, 8-дидё-

зокси- 1-тио-0-эритро

В-галакто-октапиранозой, в которой С6 име-

ет радикал — 1-метил-4-н-пропил-2-пирролидин-карбоксамид.

437

Клиндамицин лучше всасывается в кровь из кишечника. Оба

антибиотика активны преимущественно против грамположитель-

ных кокков.

Антибиотики — N-r ликозиды

Гужеротин — антибиотик широкого спектра антимикробного

действия. Он продуцируется культурой Streptomyces gougerotii. По

химическому строению представляет собой

— (цитозинил)-4-сар-

козил-О-сериламино-1,4-дидезокси-Р-В-галактопиран-уронамид

СН

—NH—СН

—СО—СН—СО — НИ

сн

он

>й

омн,

гужеротин

MHj

Пуромицин — N-гликозидный антибиотик, имеющий важ-

ное значение в расшифровке синтеза белка на рибосомах. Он

подобен

З'-концу

аминоацил-тРНК, связывающемуся с опреде-

ленным участком рибосомы, и действует как аналог аминоацил-

тРНК, прерывая удлинение полипептидной цепи.

Продуцентом пуромицина является Streptomyces alboniger. Хо-

тя антибиотик ингибирует

сн*>. _СН

многие микроорганизмы,

>»

включая трипаносомы, те-

рапевтическое значение

его невелико.

Антибиотики-

НОН2С о/

" • депсипептиды

об

>f/

Все

они

продуцируют-

ся,

как правило, бациллами

и проявляют активность

со

против грамположитель-

ных

и/или

грамотрицатель-

I /

\ ных

и/или

грамотрицатель-

щ|,

сн с

ц —/ JS—OCH3 ных патогенных бактерий

* ^-ff К числу циклопептидныэ

числу циклопептидных

антибиотиков относят ба-

цитрацины, грамицидины,

полимиксины и др.:

438

продуцент

Вас.

lichenitormis

антибиотик

бацитрацины

(10 форм)

активен против

грамположи-

телъных

бактерий

и грам-

отрицательных

кокков

Вас.

brevis var.G.-B.

грамицидины

(5 форм)

Вас.

polymixa полимиксины,

Вас.

circulans колистины, грамотри-

циркулины цательных

(22 формы) бактерий

Полимиксин В

(

, циркулин А и колистин различаются по еди-

ничным аминокислотам в циклах.

К циклопептидным антибиотикам относится также циклоспо-

рин А, продуцируемый мицелиальными грибами Cylindrocarpum

lucidum и Tolypocladium inflatum-Bauveria nives (рис. 134). Приме-

чательным качеством антибиотика является иммуносупрессивное

действие, в связи с чем его преимущественно используют в

трансплантологии, хотя он также проявляет антифунгальную ак-

тивность.

Антибиотики-акти-

номицины составляют

большую группу сходных ве-

ществ, образуемых стрептоми-

цетами. Некоторые из них обла-

дают противоопухолевым и им-

муносупрессивным действием.

По химическому строению их

относят к хромопептидам, со-

держащим феноксазиновую

хромофорную группу и два пен-

тапептида в форме циклических

лактонов. На практике хорошо

известен актиномицин (дакти-

номицин),

ингибирующий ДНК-зависимый синтез РНК.

Антибиотики-полиены

Продуцентами антибиотиков-полиенов являются стрептомице-

ты и некоторые мицелиальные грибы, образующие структуры с

439

Рис.

134. Продуцент циклоспорина

А — Tolypocladium inflatum (сканирую-

щий электронномикроскопический сни-

мок, х20000).

четырьмя-семью сопряженными двойными связями (тетра-, пента-,

гекса- и гептаены). Из группы полиеновых антибиотиков в меди-

цинской практике известны нистатин, фумагиллин (тетраены),

амфотерицин В (гептаен) и полусивтетический амфоглюкамин,

обладающие противогрибковым действием (преимущественно —

в отношении патогенных дрожжевых организмов и некоторых

других диморфных грибов); фумагиллин ингибирует стафилокок-

ки,

дизентерийную амебу, бактериофаги. Нистатин (продуцент

Streptomyces noursei) — аналог амфотерицина

В,

но в его цепочке

(позиции 20—27) содержится

конъюгированных двойных связей.

Антибиотики -а нзамицины (от лат. ansa — ручка).

В их молекулах к ароматическому ядру присоединяется алифати-

ческая анза-цепь. Анзамицины образуются актиномицетами и

некоторыми растениями. Из природных и полусинтетических ри-

фамицинов наиболее известными являются: рифоцин (рифампи-

цин SV), рифампицин и рифамид. Анзамицины — щирокоспект-

ральные антибиотики, ингибирующие бактерии, отдельные вирусы

и некоторые эукариотические клетки.

• Рифампицин (продуцент

—

Streptomyces mediterranei) расцени-

вают одним из лучших химиотерапевтических средств при тубер-

кулезе, проявляющим бактерицидное действие против

Mycobacterium tuberculosis. Он проникает в спинномозговую жид-

кость и поэтому эффективен при туберкулезном менингите.

Антибиотики-стероиды — к ним относят фузидиевую

кислоту, изготавливаемую в виде натриевой соли. Она образуется

мицелиальным грибом Fusarium coccineum. Антибиотик активен

против многих типов грамположительных бактерий, особенно —

стафилококков.

Пр очие антибиотики

Гризеофульвин — продуцируется нитчатым грибом Penicillium

griseofulvum и другими, активен против болезнетворных грибов-

дерматофитов. Он состоит из конденсированных колец А, В, С.

CI Трихотецин

—

образуется нитча-

тым грибом Trichothecium roseum и

некоторыми другими несовершен-

ными грибами. Это — антифунгаль-

ный антибиотик, полезный, прежде

ОСНз ОСНз всего, для ветеринарии и растение-

водства. В своем составе содержит

гриэеофулмин гетероциклы.

440

осо—

сн=сн—сн

трихотацин

Ферментационные процессы получения антибиотиков еще не

достигли того совершенства, которое могло бы быть обеспечено

благодаря компьютерной технике и пониманию физиологии про-

дуцентов. Своеобразным тормозом совершенствования техноло-

гии выступают сами клеточные популяции микроорганизмов, ко-

торые изменяются качественно и количественно в'течение всего

продуктивного цикла. Поэтому не удается получать полностью

идентичных результатов даже в двух смежных ферментациях,

равно как и весь технологический процесс удается сравнительно

хорошо проводить лишь в периодическом режиме.

В главе 7 приведены технологические схемы производства

пенициллина и канамицина, поскольку предферментационные и

ферментационные стадии во многом подобны, то нет необходимо-

сти рассматривать технологию производства каждого антибиотика

в отдельности.

Так как антибиотические вещества являются вторичными ме-

тоболитами, то биосинтез их сопряжен с переходом культуры

продуцента в идиофазу. Следовательно, здесь целесообразно ли-

митирование роста продуцента. Таким лимитирующим ингредиен-

том (фактором) при биосинтезе пенициллина выступает глюкоза,

тогда как при биосинтезе антибиотиков стрептомицетами — фос-

фаты. Все это важно при "компановке" питательных сред, подкор-

мке штамма

продуцента в процессе биосинтеза антибиотика. Так,

среда для продукции пенициллина (она же пригодна для накопле-

ния инокулюма) включает глюкозу — 1,5%, лактозу —

(лактоза

снимает катаболитную репрессию глюкозы), аммония сульфат и

фосфаты —

0,5—1%,

кукурузный экстракт —

2—3%,

предшествен-

ники антибиотика — фенокси- или фенилуксусная кислота —

0,3—0,6%, мел —

0,5-1%,

пеногаситель —

0,5—1%;

температуру

ферментации поддерживают на уровне 22—26°С при рН от 5,0 до

7,5 и аэрации 1 м

воздуха на 1 м

среды в 1 минуту; продолжи-

тельность ферментации — 4 суток.

441

i«?>

Так называемая "всеядность" актиномицетов обеспечивает им

способность расти и продуцировать антибиотики на средах, содер-

жащих белки (соевая мука, рыбная мука, белок клейковины пше-

ницы и пр.), крахмал. Тем не менее, применительно к каждому

продуценту имеются свои особенности, обычно отмечаемые в

регламентной документации. Например, посевной материал

Streptomyces kanamyceticus получают на соево-крахмальной среде

и на ней же проводят основную ферментацию при 27—28°С в

течение 4—5 суток при поддержании рН на уровне 7,1-7,6.

При ферментации Str. floridae (продуцент виомицина, или

флоримицина) рекомендуют среду, содержащую глюкозу или гид-

рол, соевую

муку,

кукурузный экстракт, нитраты,

мел;

температуру

поддерживают в пределах 27—29°С, рН на уровне 7,0—7,3.

В случае ферментации Str. erythreus в питательную среду

добавляют пропиловыи спирт, как предшественник антибиотика

эритромицина.

Продуцент нистатина

Str.

noursei интенсивно потребляет аммо-

нийный азот (не нитратный), и т. д.

Перед выделением антибиотика из культуральной жидкости

необходимо отделить твердую, или плотную фазу от жидкой. В

этих случаях, как правило, используют фильтрацию. Качество

твердой фазы заметно сказывается на эффективности фильтрации.

Здесь можно отметить следующую закономерность — нативная

бактериальная масса фильтруется хуже мицелиальной. С учетом

того факта, что высшие актиномицеты способны формировать

нитчатые структуры, то их отделение при фильтрации происходит

несколько легче, чем других бактерий.

Пути улучшения фильтрации: обработка культуральных жид-

костей электролитами, тепловая коагуляция, добавление фильтру-

ющих наполнителей, кислотная коагуляция и некоторые другие.

Трудности выделения антибиотиков обусловлены многокомпо-

нентностью культуральных жидкостей и малой концентрацией в

них целевых продуктов. Так, пенициллин может накапливаться

примерно до 30 г/л при 8%-м выходе от субстрата. При этом сухие

выщества после отделения мицелия обычно составляют порядка

3—6%, из которых лишь 15—30% приходятся на антибиотик. Поэ-

тому любую культуральную среду необходимо обрабатывать так,

чтобы антибиотическое вещество переходило в ту фазу, из которой

затем он будет наиболее полно выделен. В ряде случаев этого можно

добиться подкислением (тетрациклины) или, напротив, подщела-

чиванием культуральной жидкости (новобиоцин), добавлением

442

солей, щавелевой кислоты (эритромицин) и т. д., до или после

коагуляции и осаждения белков из нативных растворов.

Если для выделения антибиотика применяют ионный обмен, то

нативный раствор стремятся освободить от ионов-конкурентов

(растворимые оксалаты — для удаления ионов кальция; натрия

триполифосфат

—

для связывания ионов магния; желтая кровяная

соль — для комплексования ионов железа).

Антибиотические вещества, накапливающиеся в клеточной

биомассе в процессе ферментации микробов-продуцентов, выде-

ляют другими методами, нежели антибиотики, содержащиеся в

культуральной жидкости. В первом случае, как правило, необхо-

дима экстракция каким-либо растворителем из нативных или

дезинтегрированных клеток (система "твердое тело-жидкость").

Примерная схема выделения целевого продукта (антибиотика)

из культуральной жидкости может быть представлена в следующем

виде (рис. 135). В приведенную схему должны быть внесены

соответствующие коррективы в зависимости от физико-химиче-

ских характеристик целевого продукта и возможностей аппара-

турного оформления процесса. В настоящее время все большее

распространение приобретают мембранные методы концентриро-

вания и выделения различных веществ, хотя до сих пор в ряде

производств БАВ (включая антибиотики, например, пенициллин)

не удалось отказаться от традиционных способов выделения и

очистки целевых продуктов (экстракция в системе "жидкость-жид-

кость", адсорбция на активированных углях, диализ).

Рис.

135.

Примерная тех-

нологическая схема выделе-

ния антибиотика X из культу-

ральной жидкости (КЖ):

—

предварительная обработка

КЖ, 2 — подготовка раство-

ра, 3 — первый фильтр, 4 —

рнпомтю

сборник первого фильтра, 5

— подготовка раствора для

фильтрации, 6 — дополни-

тельная фильтрация, 7 — сте-

рилизующая фильтрация, 8 —

коагуляция растворителем, 9

— предварительное осажде-

ние,

10—промывание осадка,

И — вторичное осаждение,

12 — высушивание.

443

сравнительном плане следует иметь в виду, что механическое

обезвоживание заметно дешевле термического и это сказывается

на себестоимости производимого продукта.

Широко используют методы хроматографии, например, при

выделении новобиоцина, стрептомицина и других антибиотиков.

В подобных случаях технологическая схема аппаратурного офор-

мления процессов заметно упрощается.

9.3.4.

Получение аминокислот. Аминокислоты играют большую

роль в здравоохранении, животноводстве и легкой промышленно-

сти.

По значению для макроорганизма аминокислоты подразделя-

ют на заменимые и незаменимые. К незаменимым относят те

аминокислоты, которые не синтезируются в человеческом

и/или

животном организме, они должны быть привнесены с пищей или

кормом для животных (таблица 46).

Т а б л и ц а 46. Незаменимые в заменимые аминокислоты

Незаменимые

Аргинин (только для молодых

растущих животных)

В алии

Гистидин

Изолейцин

Лейцин

Лизин

Метионин

Треонин

Триптофан

Фенилаланин

Заменимые

Алании

Аспарагин

Аспарагиновая кислота

Глицин

Глутамин

Глутаминовая кислота

Пролин

Серии

Тирозин

Цистеин

Заменимые синтезируются in vivo из аммиака и различных

источников углерода. Микроорганизмы сами синтезируют все

необходимые им аминокислоты из аммиака и нитратов, а углерод-

ные "скелеты" — из соответствующих интермедиатов.

Исходя из такой оценки аминокислот, ученые давно стремятся

использовать способности микроорганизмов продуцировать заме-

нимые и незаменимые аминокислоты в ощутимых количествах.

444