Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия

Подождите немного. Документ загружается.

сродство к гликопротеину CD

Т-лимфоцита. В этом взаимодействии,

узнавании, являющемся высокоспецифичным, гликозилированные фрагмен-

ты, вероятнее всего, играют важную патогенетическую роль. Известно

также, что при ревматоидных артритах часто синтезируются аномальные

антитела (аномальные иммуноглобулины – все гликопротеины) с необы-

чайно короткими сахарными цепями, что вызывает стимуляцию иммунной

системы против самого организма. Из этих примеров видно, что, помимо

гликобиологии, наступило время признания и таких наук, как гликопа-

тология и гликотерапия.

Помимо гликопротеинов, различают также протеогликаны, состоя-

щие из белка и гликозаминогликанов (прежнее название мукополиса-

хариды); последние состоят из цепей сложных углеводов: аминосахаров,

уроновых кислот, серной кислоты и отдельных моносахаридов. Типичными

гликозаминогликанами являются гиалуроновая кислота, хондроитинсерная

кислота и гепарин, химический состав, структура и функция которых

подробно рассматриваются в главе 21.

К типичным гликопротеинам относят большинство белковых гормонов,

секретируемые в жидкие среды организма вещества, мембранные сложные

белки, все антитела (иммуноглобулины), белки плазмы крови, молока,

овальбумин, интерфероны, факторы комплемента, группы крови, рецеп-

торные белки и др. Из этого далеко не полного перечня гликопротеинов

видно, что все они выполняют специфические функции: обеспечивают

клеточную адгезию, молекулярное и клеточное узнавание, антигенную

активность опухолевых клеток, оказывают защитное и гормональное,

а также антивирусное действие.

Химический состав гликопротеинов более или менее установлен, струк-

тура определена только у ряда из них. К полипептиду присоединяются

гетероолигосахаридные цепи, содержащие от 2 до 10, реже 15 мономерных

остатков гексоз (галактоза и манноза, реже глюкоза), пентоз (ксилоза,

арабиноза) и конечный углевод, чаще всего представленный N-ацетилга-

лактозамином, L-фукозой или сиаловой кислотой; в отличие от про-

теогликанов гликопротеины не содержат уроновых кислот и серной

кислоты.

Типы связей между углеводными компонентами и белками определены

только у ряда гликопротеинов, аминокислотный состав и структура кото-

рых известны (иммуноглобулины, гормоны); они включают О-гликозидные

N-ацетилгалактозамин

L-фукоза

(6-дезоксигалактоза)

Сиаловая кислота

(N-ацетилнейраминовая

кислота)

связи (с ОН-группами серина, треонина и оксилизина), N-гликозидные связи

(с амидными группами аспарагина, реже глутамина или ω-NH

-группами

лизина и аргинина) и эфирные гликозидные связи со свободными

СООН-группами глутаминовой и аспарагиновой кислот.

Синтез гликопротеинов осуществляется в рибосомах эндоплазматиче-

ского ретикулума (в цистронах), затем присоединяются сахарные цепи

(постсинтетическое гликозилирование), и далее белок транспортируется до

биомембран клетки и включается в состав мембранных белков или секре-

тируется.

Углеводные компоненты соединены ковалентно с азотом аспарагина

молекулы белка. Однако предварительно олигосахаридная часть соединяет-

ся с липидным переносчиком – долихолфосфатом (липид, содержащий

от 15 до 20 изопреновых остатков) и переносится на полипептидную цепь

в эндоплазматическом ретикулуме, при этом транспортер освобождается:

Долихолфосфат (n = 15–30)

Синтезированные гликопротеины далее переносятся в аппарат Гольджи,

где осуществляются окончательное гликозилирование и сортировка по

назначению.

Структура одного из нескольких гетероолигосахаридных остатков в

молекуле гликопротеинов, в частности иммуноглобулинов, может быть

представлена в виде следующей схемы (использованы сокращения: Глю –

глюкоза, NАцГлюА – N-ацетилглюкозамин; Гал – галактоза; Ман – манно-

за; NАцНейр – N-ацетилнейраминовая кислота):

Рассмотрим известные к настоящему времени данные о синтезе, строе-

нии (структуре) и свойствах ряда гликопротеинов.

Интерфероны. Интерфероны – это ингибиторы размножения многих ти-

пов вирусов. Открыто несколько типов интерферонов (α, β и γ), некоторые

из них получены методами генетической инженерии. Это сравнительно

небольшие сложные белки с мол. массой у разных видов животных

и человека от 25000 до 38000–40000). Они образуются в клетке в ответ на

внедрение вирусной нуклеиновой кислоты, ограничивая вирусную агрессию

(инфекцию). Известно также, что группа видоспецифических α-интерфе-

ронов синтезируется макрофагами, в то время как γ-интерферон про-

дуцируется Т-клетками и стимулируется интерлейкином-2 (см. «Лимфо-

кины»). Показано также, что γ-интерферон в свою очередь повышает

цитотоксическую активность макрофагов, Т-клеток и естественных кле-

ток-киллеров. Интерфероны наделены антипролиферативной активностью

и считаются основными защитными белками не только против вирусной

инфекции, но и при опухолевых поражениях.

Следует отметить, однако, что до сих пор не раскрыты молекулярные

механизмы, при помощи которых интерфероны тормозят размножение

вирусов. Известно только, что интерфероны ингибируют биосинтез всех

белков (и хозяйских, и вирусных), вероятнее всего, на уровне процесса

трансляции. Возможно, что интерферон индуцирует синтез особого бел-

ка-ингибитора, который затем связывается с рибосомами и блокирует

трансляцию, или интерферон переводит один из активных эукариотических

белковых факторов инициации в неактивный фактор путем фосфорилиро-

вания.

Иммуноглобулины. Иммуноглобулины, или антитела, также относятся

к классу гликопротеинов, выполняют защитную функцию, обезвреживая

поступающие в организм чужеродные вещества – антигены любой хими-

ческой природы. Синтезируются иммуноглобулины плазматическими клет-

ками, образовавшимися из лимфоцитов. Учение об иммунитете оформи-

лось в самостоятельную науку – иммунологию, изучающую структуру

и функции антител вообще и иммуноглобулинов в частности. Мы пред-

ставим современные сведения о некоторых физико-химических свойствах

и структуре иммуноглобулинов человека (табл. 2.4). Различают 5 классов

иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Детально изучены структура

и функция IgG.

Таблица 2.4. Свойства иммуноглобулинов человека

Свойство

Коэффициент седимента-

ции,

Молекулярная масса

Углеводный состав, %

Концентрация в крови,

мг%

Период полужизни, дни

IgG

6,5–7

150000

2–3

1300

8–21

IgM

950000

10–12

140

5,1

IgA

180000

8–10

210

5,8

IgD

175000

12,7

2,8

IgE

8,2

200000

10–12

0,1

2–3

Разные классы иммуноглобулинов сильно различаются не только по

молекулярной массе, но и по концентрации в крови; имеются данные, что

различаются они и по биологическим свойствам.

Подробно изучена структура IgG. Он имеет Y-образную форму и тет-

рамерное строение; состоит из двух идентичных легких L-цепей (от англ.

light) и двух идентичных тяжелых Н-цепей (от англ. heavy) с мол. массой

23000–24000 и 50000–70000 соответственно. Известно также, что каждая

из этих цепей имеет 2 типа доменов – вариабельные (V) участки, состоящие

из 108 аминокислотных остатков, и константные (С) участки, состоящие из

110 и 350 аминокислотных остатков соответственно в L- и Н-цепях (рис.

2.5).

Из других гликопротеинов, выполняющих ряд важнейших биологи-

ческих функций, следует отметить все белки плазмы крови (за исключением

альбуминов), трансферрин, церулоплазмин, гонадотропный и фолликуло-

стимулирующие гормоны, некоторые ферменты, а также гликопротеины

в составе слюны (муцин), хрящевой и костной тканей и яичного белка

(овомукоид). Углеводные компоненты, помимо информативной функции,

Рис. 2.5. Структура IgG человека. Показаны легкие (L) и тяжелые (Н) цепи,

дисульфидные связи и вариабельные V (красные) и константные С (светлые) участки.

значительно повышают стабильность молекул, в состав которых они

входят, к различного рода химическим, физическим воздействиям и пре-

дохраняют их от действия протеиназ, определяя тем самым биологическую

роль гликопротеинов. Являясь составной частью клеточной мембраны,

гликопротеины участвуют, кроме того, в иммунологических реакциях,

ионном обмене, процессах межклеточной адгезии и т.д.

МЕТАЛЛОПРОТЕИНЫ

К металлопротеинам относятся биополимеры, содержащие, помимо белка,

ионы какого-либо одного металла или нескольких металлов (табл. 2.5).

К таким белкам принадлежат, например, белки, содержащие негемовое

железо, а также белки, координационно связанные с атомами металлов

в составе сложных белков-ферментов.

Типичными представителями первых являются железосодержащие бел-

ки ферритин, трансферрин и гемосидерин. Ферритин – высокомолекуляр-

ный водорастворимый белок с мол. массой 400000, в котором содержа-

ние железа составляет от 17 до 23% (в среднем 20%). Он сосредо-

точен главным образом в селезенке, печени, костном мозге, выполняя

роль депо железа в организме. Железо в ферритине находится в окис-

ленной форме, в составе неорганического железосодержащего соедине-

ния (FeO•OH)

•(FeO•O•PO

), причем цепи неорганического полимера

O=Fe—OH...O=Fe—ОН..., иногда содержащие фосфаты, находятся меж-

ду пептидными цепями белковой части (называемая апоферритином), а

атомы железа координационно связываются с атомами азота пептидных

групп.

Трансферрин – растворимый в воде железопротеин (мол. масса

90000), гликопротеин, обнаруживаемый главным образом в сыворотке

Таблица 2.5. Металлопротеины

Металл

, Fe

, Cu

,Mg

Тип биомолекулы

Гемоглобин, миоглобин,

каталаза, пероксидаза,

металлофлавопротеины,

цитохромы, железосер-

ные белки, трансферрин,

ферритин, нитрогеназа

Цитохромоксидаза, це-

рулоплазмин и др.

Витамин В

и его ко-

ферментные формы

Аргиназа, декарбоксила-

зы аминокислот, фосфо-

трансферазы и др.

Нитрогеназа, нитрат-

редуктаза, ксантинокси-

даза

Карбоангидраза, пепти-

дазы, фосфатазы, НАД-

ферменты, инсулин

Фосфоенолпируваткар-

боксикиназы, АТФазы

Лиганд

Гемопорфирины,

сера, изоаллокса-

зин

Азотистые осно-

вания

Коррин, бензими-

дазол, СН

-группа

Фосфат, имидазол

Не идентифици-

рован

Имидазол, НАД

Биологическая

функция

Транспорт О

, СО

транспорт электронов

(окислительно-восстано-

вительные реакции),

транспорт и депониро-

вание железа, восстанов-

ление N

в NH

Окисление, депонирова-

ние и транспорт меди

Перенос СН

-группы,

синтез метионина

Декарбоксилирование,

перенос фосфатных

групп

Связывание и активиро-

вание N

—>NH

, окисле-

ние пуринов

Связывание субстратов,

разрыв пептидной связи

Транспорт и осво-

бождение фосфатных

групп

крови в составе β-глобулинов. Содержание железа в нем составляет 0,13%.

Предполагают, что атом железа соединяется с белком координационными

связями с участием гидроксильных групп тирозина. Молекула трансфер-

рина содержит 2 атома железа; трансферрин служит физиологическим

переносчиком железа в организме.

Гемосидерин в отличие от ферритина и трансферрина является

водонерастворимым железосодержащим белковым комплексом, состоя-

щим, кроме того, на 25% из нуклеотидов и углеводов. Он содержится

главным образом в ретикулоэндотелиоцитах печени и селезенки. Биоло-

гическая роль гемосидерина изучена недостаточно.

Ко второй группе металлопротеинов относится ряд ферментов: фер-

менты, содержащие связанные с молекулой белка ионы металлов, опре-

деляющих их функцию,– металлоферменты (в процессе очистки ме-

таллы остаются связанными с ферментами); ферменты, активируемые

ионами металлов, менее прочно связаны с металлами, но для проявления

своей активности нуждаются в добавлении в реакционную среду определен-

ного металла. Предполагают, что механизмы участия металла в акте

катализа в обоих случаях, вероятнее всего, сходны; ионы металла участ-

вуют в образовании тройного комплекса: активный центр фермента–ме-

талл–субстрат (Е—М—S), или М—Е—S, или Е—S—М. Есть доказа-

тельства, что в активном центре многих ферментов в связывании металла

участвует имидазольная группа гистидина.

Глава 3

ХИМИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

В наше время трудно назвать область естествознания, которую не ин-

тересовала бы проблема структуры и функций нуклеиновых кислот. Не-

смотря на огромный прогресс, достигнутый в последние десятилетия при

изучении химического состава и строения нуклеиновых кислот, много

проблем предстоит еще решить для выяснения зависимости между струк-

турой и биологической ролью нуклеиновых кислот. Нет сомнения, что

именно на этом пути научного поиска исследования нуклеиновых кислот

будут сделаны открытия, имеющие огромное значение для биологии,

медицины и всей науки о живом. Эпохальное открытие принципа комп-

лементарности нуклеиновых кислот позволило проникнуть в тайны не

только тонкой структуры этих биополимеров, но и механизмов синтеза

и воспроизведения биологических макромолекул. Нуклеиновые кислоты

выполняют ряд важных биологических функций, не свойственных другим

полимерным веществам. В частности, они обеспечивают хранение и пере-

дачу наследственной информации и принимают непосредственное участие

в механизмах реализации этой информации путем программирования

синтеза всех клеточных белков. Структурные компоненты нуклеиновых

кислот выполняют, кроме того, функции кофакторов (коэнзим А, уридин-

дифосфатглюкоза и др.), аллостерических эффекторов, входят в состав

коферментов (никотинамидадениндинуклеотид, флавинадениндинуклеотид

и др.), принимая тем самым непосредственное участие в обмене веществ,

а также в аккумулировании (накоплении), переносе и трасформации энер-

гии. Они являются предшественниками вторичных посредников (мессенд-

жеров) – циклических мононуклеотидов (цАМФ и цГМФ), выполняющих

важную функцию в передаче внутриклеточных сигналов. Подробно ос-

новные функции нуклеиновых кислот рассмотрены в главе 14.

Методы выделения нуклеиновых кислот. При изучении химического

состава и строения нуклеиновых кислот перед исследователем всегда стоит

задача выделения их из биологических объектов. В главе 2 было указано,

что нуклеиновые кислоты являются составной частью сложных белков –

нуклеопротеинов, содержащихся во всех клетках животных, бактерий,

вирусов, растений. Нуклеиновые кислоты обладают сильно выраженными

кислыми свойствами (обусловлены остатками ортофосфорной кислоты в их

составе) и при физиологических значениях рН несут отрицательный заряд.

Этим объясняется одно из важных свойств нуклеиновых кислот – способ-

ность к взаимодействию по типу ионной связи с основными белками

(гистонами), ионами металлов (преимущественно с Mg

), а также с по-

лиаминами (спермин, спермидин) и путресцином. Поэтому для выделения

нуклеиновых кислот из комплексов с белками необходимо прежде всего

разрушить эти сильные и многочисленные электростатические связи между

положительно заряженными молекулами белков и отрицательно заряжен-

ными молекулами нуклеиновых кислот. Для этого измельченный путем

гомогенизации биоматериал обрабатывают крепкими солевыми раство-

рами (10% раствор хлорида натрия) с последующим осаждением нуклеино-

вых кислот этанолом. В настоящее время для выделения нуклеиновых

кислот в нативном состоянии пользуются более «мягким» фенольным

методом, основанным на обработке нейтрального забуференного раствора

нуклеопротеинов фенолом. Обычно эту процедуру проводят в присутствии

веществ, вызывающих денатурацию белкового компонента, например до-

децилсульфата (ДСН) или салицилата натрия, затем смесь подвергают

центрифугированию. При этом денатурированный белок попадает в фе-

нольную фазу, а нуклеиновые кислоты остаются в водной среде, из которой

их осаждают на холоде добавлением 2–3 объемов этанола. Этим методом

удается получить достаточно очищенные препараты нуклеиновых кислот.

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов

разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата,

полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле

фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов

используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭАЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифуги-

рование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на

белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-

электрофорез и др.

После получения нуклеиновых кислот в чистом виде их подвергают

гидролизу для изучения химического состава. Для этих целей используют

ферментативные методы (экзо- и эндонуклеазы), а также чисто химические

методы гидролиза, в частности нагревание нуклеиновых кислот с хлорной

кислотой.

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) относятся к сложным высокомолеку-

лярным соединениям, состоят из небольшого числа индивидуальных хи-

мических компонентов более простого строения. Так, при полном гидро-

лизе нуклеиновых кислот (нагревание в присутствии хлорной кислоты)

в гидролизате обнаруживают пуриновые и пиримидиновые основания,

углеводы (рибоза и дезоксирибоза) и фосфорную кислоту *:

В молекуле ДНК углевод представлен дезоксирибозой, а в молекуле

РНК – рибозой, отсюда их названия: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и ри-

бонуклеиновая (РНК) кислоты. Кроме того, они содержат фосфорную

кислоту, по два пуриновых и по два пиримидиновых основания; различия

только в пиримидиновых основаниях: в ДНК содержится тимин, а в РНК –

урацил. В составе ДНК и РНК открыты так называемые минорные

* В составе ДНК открыт также кремний в количестве 0,26–0,31%, поэтому предполагают,

что он в нуклеиновых кислотах изоформен фосфору и способен включаться в полинуклсотид-

ную последовательность.

ДНК

РO

Дезоксирибоза

Аденин

Гуанин

Цитозин

Тимин

РНК

РO

Рибоза

Аденин

Гуанин

Цитозин

Урацил

(экзотические) азотистые основания (строение некоторых из них приводится

далее).

Углеводы (рибоза и дезоксирибоза) в молекулах ДНК и РНК находятся

в β-D-рибофуранозной форме:

В составе некоторых фаговых ДНК обнаружена молекула глюкозы,

которая соединяется гликозидной связью с 5-оксиметилцитозином.

Основу структуры пуриновых и пиримидиновых оснований составляют

два ароматических гетероциклических соединения – пиримидин и пурин *:

Молекула пурина состоит из двух конденсированных колец: пиримидина

и имидазола.

В составе нуклеиновых кислот встречаются три главных пиримидиновых

основания: цитозин, урацил и тимин.

Помимо главных пиримидиновых оснований, в составе нуклеиновых

кислот открыты минорные пиримидиновые основания, 5-метил- и 5-окси-

метилцитозин, дигидроурацил, псевдоурацил, 1-метилурацил, оротовая

кислота, 5-карбоксиурацил, 4-тиоурацил и др. Забегая несколько вперед,

укажем, что только для тРНК список минорных оснований приближается

к 50. На долю минорных оснований приходится до 10% всех нуклеотидов

тРНК, что имеет, очевидно, важный физиологический смысл (защита

* Для удобства представления структурных формул азотистых оснований и углеводов

в дальнейшем в структуре колец опущены атомы С и Н.

D-рибоза

β-D-рибофураноза

D-2-дезоксири-

боза

β-D-2-дезокси-

рибофураноза

Пиримидин

Пурин

Цитозин

Урацил

Тимин

молекулы РНК от действия гидролитических ферментов). Структурные

формулы ряда минорных пиримидиновых оснований представлены в форме

нуклеозидов – соединений с углеводным компонентом:

Два пуриновых основания, постоянно встречающихся в гидролизатах

нуклеиновых кислот, имеют следующее строение:

К минорным нуклеозидам пуринового ряда, обнаруживаемым в составе

ДНК и РНК, относятся инозин, N

-метиладенозин, N

-метилгуанозин,

ксантин, гипоксантин, 7-метилгуанозин и др.

Одним из важных свойств свободных азотистых оснований (содержащих

оксигруппы) является возможность их существования в двух таутомерных

формах, в частности лактим- и лактамной формах, в зависимости от

значения рН среды: при рН 7,0 они представлены в лактамной форме, при

снижении величины рН – в лактимной форме. Таутомерные превращения

можно представить на примере урацила.

Рибоза

Дигидроуридин

Рибоза

Риботимидин

Псевдоуридин

Рибоза

Тиоуридин

(тиопиримидин)

Аденин

Гуанин

Рибоза

Инозин

Рибоза

-метиладенозин

Рибоза

-метилгуанозин

Лактим

Лактам

Оказалось, что в составе природных нуклеиновых кислот все оксипроиз-

водные пуринов и пиримидинов находятся в лактамной форме.

О локализации и количественном содержании нуклеиновых кислот

в клетках получены определенные данные. Доказано, что количественное

содержание ДНК в клетках одного и того же организма отличается

удивительным постоянством и исчисляется несколькими пикограммами,

однако в клетках разных видов живых организмов имеются существенные

количественные различия в содержании ДНК. Хорошо известно также, что

ДНК преимущественно сосредоточена в ядре, а в митохондриях и хлоро-

пластах содержится только небольшой процент клеточной ДНК. О коли-

честве РНК нет точных данных, поскольку содержание ее в разных клетках

в значительной степени определяется интенсивностью синтеза белка. На

долю РНК приходится около 5–10% от общей массы клетки. Современная

классификация различных типов клеточной РНК основывается на данных

топографии, функции и молекулярной массы. Выделяют три главных вида

РНК: матричную (информационную) – мРНК, которая составляет 2–3% от

всей клеточной РНК; рибосомную – рРНК, составляющую 80–85% и транс-

портную – тРНК, которой около 16%. Эти 3 вида различаются нуклеотид-

ным составом и функциями (табл. 3.1).

Таблица3.1. Свойства РНК у Е.coli (по А. Ленинджеру)

Тип

РНК

мРНК

тРНК

рРНК

Скорость

седиментации,

ед. Сведберга (S)

6–25

Молекулярная

масса

250000–1000000

23000–30000

~ 35000

~ 550000

~ 1100000

Число нуклеотид-

ных остатков

75–3000

75–90

% от общей

РНК

Матричная РНК (мРНК) синтезируется в ядре на матрице ДНК, затем

поступает в рибосому, выполняя матричную функцию при синтезе белка

(см. главу 14). По предположению акад. А.С. Спирина, часто мРНК при

поступлении из ядра в цитоплазму образует со специфическими РНК-свя-

зывающими белками комплексы – так называемые информосомы, способ-

ные к обратимой диссоциации. Информосомы рассматриваются как транс-

портная форма мРНК, способствующая образованию полирибосом в цито-

плазме. Транспортные РНК (тРНК) имеют небольшую молекулярную

массу и содержатся в растворимой фракции цитоплазмы, выполняя функ-

цию переноса аминокислот к месту белкового синтеза – рибосоме. Рибосом-

ные РНК (рРНК), как видно из данных табл. 3.1, имеют разную и значи-

тельно большую молекулярную массу. Они локализуются в двух суб-

частицах рибосом 50S и 30S у Е.coli и 60S и 40S в клетках животных

(табл. 3.2).

Субчастица 60S содержит три разных рРНК (5S, 5,8S и 28S рРНК), в то

время как субчастица 40S – одну молекулу 18S рPHK. Детально роль рРНК

в белковом синтезе пока не выяснена (см. главы 13, 14).

100