Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия

Подождите немного. Документ загружается.

довательности мРНК (кодону), кодирующей включение в белковую моле-

кулу определенной аминокислоты.

Независимо от типа РНК синтезированный в клетке продукт транскрип-

ции (см. главу 13) всегда представлен единственной цепью, упакованной во

вторичную структуру не случайно, а в соответствии с программой ДНК.

Поскольку в составе РНК имеются свободные 2'-оксигруппы рибозы, не

связанные со стандартным крик-уотсоновским спариванием азотистых

оснований, появляются дополнительные возможности образования вто-

ричной и третичной структур, содержащих выпуклости, шпильки, или

крестообразные структуры. Особенности структуры тРНК имеют прямое

отношение к процессу трансляции, поэтому более подробно они рассмот-

рены в разделе биосинтеза белка (глава 14).

Третичная структура нуклеиновых кислот

Выделить нативную молекулу ДНК (рис. 3.2) из большинства источников,

в частности хромосом, чрезвычайно трудно из-за высокой чувствительности

молекулы ДНК к нуклеазам тканей и гидродинамической деструкции *.

Удалось выделить в интактном (неповрежденном) виде только неко-

торые ДНК вирусов, митохондрий и хлоропластов. Исследования этих

молекул при помощи физических (в частности, кристаллографических)

и физико-химических методов показали, что двойная спираль ДНК на

некоторых участках может подвергаться дальнейшей спирализации с об-

разованием суперспирали или открытой кольцевой формы. Оказалось

также, что линейная ДНК может образоваться из кольцевой формы или

существовать как таковая в природе. В некоторых вирусах обнаружены,

кроме того, одноцепочечные ДНК линейной и кольцевой форм (рис. 3.3).

Образование кольцевой формы молекулы ДНК у бактерий или в ми-

тохондриях клеток животных часто вызвано ковалентным соединением их

открытых концов. Известно, что суперспиральная (суперскрученная) струк-

тура обеспечивает экономную упаковку огромной молекулы ДНК в хро-

мосоме: вместо 8 см длины, которую она могла бы иметь в вытянутой

форме, в хромосоме человека молекула ДНК настолько плотно упакована,

что ее длина составляет 5 нм. Обычно в ДНК встречаются положительные

и отрицательные супервитки, образованные за счет скручивания по часовой

(правосторонней) или против часовой стрелки двойной спирали. Образо-

вание подобных супервитков катализируется специфическими ферментами,

получившими название топоизомераз. Подобные суперспирали соединяют-

ся с белками (гистонами), упакованными в бороздках, обеспечивая тем

самым стабильность третичной структуры ДНК. Степень суперспираль-

ности (наличие супервитков) молекулы ДНК обычно устанавливают по

изменению константы седиментации в определенных условиях. Суперспи-

рализация ДНК может быть нарушена разрывом в одной из цепей или

в обеих цепях двойной спирали под действием ДНКазы или при обработке

интеркалирующими соединениями. Под интеркаляцией подразумевают

встраивание плоских ароматических колец между стопками пар азотистых

оснований ДНК. Интеркаляция может быть вызвана антибиотиками и кра-

* Разработан щадящий метод выделения нативной молекулы ДНК с использованием

протеиназы К и ДСН. Выделенный из клеток почек обезьяны препарат ДНК имел необычно

высокую мол. массу – 2•10

, однако даже в этом случае молекулярная масса на несколько

порядков меньше, чем мол. масса ДНК in vivo, исчисляемая 10

–10

111

Рис. 3.2. Модель молекулы ДНК.

Рис. 3.3. Третичная структура ДНК

(схема).

1 - линейная одноцепочечная ДНК - бак-

териофаг φХ174 и другие вирусы; 2 - коль-

цевая одноцепочечная ДНК вирусов и

митохондрий; 3 - кольцевая двойная спи-

раль ДНК.

Рис. 3.4. Третичная структура РНК в

растворе в зависимости от ионной

силы, температуры и рН среды (схе-

ма) (по А.С. Спирину и Л.П. Гаври-

ловой).

а - компактная палочка, б - компактный

клубок; в - развернутая цепь.

сителями; в интактных клетках она может быть обусловлена аромати-

ческими кольцами амнокислот, что имеет, очевидно, определенный биоло-

гический смысл в проблеме белково-нуклеинового узнавания.

Данные о структуре тРНК свидетельствуют о том, что нативные

молекулы тРНК имеют примерно одинаковую третичную структуру, ко-

торая отличается от плоской структуры «клеверного листа» большой

компактностью за счет складывания различных частей молекулы. Следует

указать на существование у ряда вирусов (реовирус, вирус раневых опу-

холей растений и др.) природных двухцепочечных РНК, обладающих

однотипной с ДНК структурой. При физиологических значениях рН среды,

ионной силы и температуры создаются условия для образования в одно-

цепочечных матричных и рибосомных РНК множества участков с двойной

спиралью («шпильки») и дальнейшего формирования комплементарных

участков, определяющих в известной степени жесткость их третичной

структуры (рис. 3.4). В настоящее время получены доказательства зна-

чимости ван-дер-ваальсовых (диполь-дипольных и лондоновских) связей

между азотистыми основаниями в стабилизации общей пространственной

конфигурации нуклеиновых кислот.

Глава 4

ФЕРМЕНТЫ

Современная биология говорит

на языке энзимологии.

А.Е. Браунштейн

ПОНЯТИЕ О ФЕРМЕНТАХ

Ферменты, или энзимы, представляют собой высокоспециализированный

класс веществ белковой природы, используемый живыми организмами для

осуществления с высокой скоростью многих тысяч взаимосвязанных хи-

мических реакций, включая синтез, распад и взаимопревращение огромного

множества разнообразных химических соединений. Жизнь и многообразие

ее проявлений – сложная совокупность химических реакций, катализируе-

мых специфическими ферментами. И.П. Павлов считал ферменты «возбу-

дителями всех химических превращений» у живых существ. Как известно,

важнейшим свойством живого организма является обмен веществ, уско-

ряющим аппаратом, основой молекулярных механизмов интенсивности

которого являются ферменты. «Вся тайна животной жизни,– писал

Д.И. Менделеев,– заключается в непрерывных химических превращениях

веществ, входящих в состав животных тканей».

В настоящее время теоретические и практические достижения энзимо-

логии используются в решении многих проблем биохимии и молекулярной

биологии, включая их сравнительное и эволюционное рассмотрение. «Под

знаком молекулярной энзимологии,– говорил на III Всесоюзном биохими-

ческом съезде (1974) А.Е. Браунштейн,– развивается и встречное течение –

реконструкция или интеграция, восходящая от молекулярного яруса к выс-

шим уровням структурно-функциональной организации живого и про-

низывающая весь комплекс актуальных проблем биологии и медицины».

Ферменты обеспечивают осуществление таких важнейших процессов

жизнедеятельности, как экспрессия (реализация) наследственной информа-

ции, биоэнергетика, синтез и распад биомолекул (обмен веществ). Изучение

их способствует проникновению в суть и сокровенные тайны того зага-

дочного явления, которое мы называем жизнью. Этими обстоятельствами

может быть объяснено пристальное внимание исследователей к проблемам

структуры, функций и молекулярных механизмов действия ферментов.

От неорганических катализаторов ферменты отличаются рядом харак-

терных особенностей. Прежде всего ферменты чрезвычайно эффективны

и проявляют в миллионы и миллиарды раз более высокую каталитическую

активность в условиях умеренной температуры (температура тела), нор-

мального давления и в области близких к нейтральным значениям рН

среды.

Ферменты отличаются высокой специфичностью действия в отношении

как химической природы субстрата, так и типа реакции, т.е. каждый

фермент катализирует в основном только определенную химическую реак-

цию. Для каждого фермента характерны специфическая последователь-

ность расположения аминокислотных остатков и пространственная кон-

формация. Существенной особенностью ферментов является также то, что

их активность в клетках строго контролируется как на генетическом уровне,

114

Рис. 4.1. Области применения ферментов в биологии и медицине (по Грину).

так и посредством определенных низкомолекулярных соединений, в част-

ности субстратов и продуктов реакций, катализируемых этими же фермен-

тами, ингибиторов и др. Таким образом, молекула фермента характе-

ризуется уникальностью структуры, которая и определяет уникальность ее

функции.

Учение о ферментах выделено в самостоятельную науку – энзимологию.

Термин «энзим» (от греч. en zyme – в дрожжах), так же как и «фермент» (от

лат. fermentatio – брожение), означает процесс, связанный с выделением

газов, брожением.

В настоящее время учреждены научно-исследовательские институты по

изучению ферментов, издаются специальные журналы, созываются на-

циональные и международные симпозиумы и конференции, посвященные

проблемам энзимологии. Наука о ферментах интенсивно развивается в тес-

ной связи со многими науками, в частности с органической, неорганической

и физической химией, физиологией, токсикологией, микробиологией, гене-

тикой, фармакологией и др. Таким образом, эта область знаний находится

на стыке химических, биологических и медицинских наук.

Энзимология в ее современном физико-химическом и молекулярном

понимании решает две главные, неразрывно связанные между собой проб-

лемы: определение структурной макромолекулярной организации фермен-

тов и изучение природы химических взаимодействий, лежащих в основе

ферментативного катализа. Накопление экспериментальных данных и раз-

витие теоретических представлений происходят настолько быстро, что

любой учебник к моменту выхода в свет уже не отражает достаточно полно

современное состояние вопроса о структуре и функциях ферментов.

Важно подчеркнуть, что изучение ферментов имеет огромное значение

для любой фундаментальной и прикладной области биологии, а также для

многих практических отраслей химической, пищевой и фармацевтической

индустрии, занятых приготовлением катализаторов, антибиотиков, вита-

минов и многих других биологически активных веществ, используемых

в народном хозяйстве и медицине (рис. 4.1). В фармакологии действие

многих лекарственных препаратов основано на определенном, хотя часто

115

Ферменты

Бактериальное

брожение

Физиологическая

регуляция

Катализ

Клеточный

метаболизм

Макромо-

лекулы

Питание

Генетический

аппарат

Ультраструктура

мембран

Коферменты

Фармакология

Биосинтез

Кинетика

реакций

Превращение

энергии

Биохимическая

эволюция

Врожденные

нарушения обмена

еще не выявленном, механизме взаимодействия их с ферментами. Успехи

общей и молекулярной энзимологии способствуют развитию новой ее

ветви – медицинской энзимологии, цели и задачи, методологические под-

ходы которой связаны с решением проблем энзимопатологии, энзимо-

диагностики и энзимотерапии (см. далее). Наука о питании базируется на

точных знаниях поэтапного расщепления питательных веществ под влия-

нием ферментов пищеварительного аппарата, на количественный и качест-

венный состав которых существенное влияние оказывает характер посту-

пающих с пищей веществ. Многие проблемы наследственной патологии

человека, развитие врожденных пороков обмена тесно связаны с дефектами

или полным отсутствием синтеза специфических ферментов. Проблемы

клеточного роста и развития, дифференцировки клеток высших организмов,

физиологических функций (движение, перемещение в пространстве, транс-

порт веществ и ионов, процессы возбуждения и торможения и др.) опре-

деляются в большой степени работой биокатализаторов, включая их

биосинтез и инактивацию. Таким образом, есть все основания для под-

тверждения положения, что не только современная биология, как отмечает

акад. А.Е. Браунштейн, но и медицина «говорит на языке энзимологии».

КРАТКАЯ ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ УЧЕНИЯ

О ФЕРМЕНТАХ

Явления брожения и переваривания известны с незапамятных времен,

однако зарождение учения о ферментах (энзимология) относится к первой

половине XIX в. Первое научное представление о ферментах было дано еще

в 1814 г. петербургским ученым К.С. Кирхгофом, который показал, что не

только проросшие зерна ячменя, но и экстракты из солода способны

осахаривать крахмал с превращением его в мальтозу. Вещество, извлекае-

мое из проросшего ячменя и обладающее способностью превращать крах-

мал в мальтозу, получило название амилазы. Ю. Либих и Ф. Велер от-

крыли агент, расщепляющий амигдалин, содержащийся в эфирном масле

горького миндаля. Этот агент был назван эмульсином. В последующие

годы были описаны другие ферменты, в частности пепсин и трипсин,

вызывающие распад (гидролиз) белков в пищеварительном тракте.

Наибольшее внимание исследователей привлекали процессы окисления

в организме. Уже был известен феномен химического катализа, означаю-

щий, что многие реакции in vitro протекают быстро и энергично в при-

сутствии ничтожных количеств примесей, как будто не участвующих в реак-

ции. Так, была установлена большая каталитическая роль ряда неорга-

нических веществ. Горение глюкозы на воздухе, например, протекает очень

медленно, а если добавить немного солей лития (или золы, также содержа-

щей ничтожные количества лития), то горение идет весьма интенсивно:

+ 6O

–> 6СO

+ 6Н

Известно, что в живых организмах «горение» (а точнее, окисление)

углеводов также протекает быстро и до тех же конечных продуктов обмена,

т.е. СО

и Н

О, с выделением (и накоплением) энергии. Однако это

«горение» происходит при относительно низкой температуре, без пламени

и, что особенно интересно, в присутствии воды. Разумеется, в этих необыч-

ных условиях без действия ферментов, получивших наименование биоло-

гических катализаторов, не было бы окисления углеводов. Забегая

116

несколько вперед, укажем, что в процессе превращения (окисления) глю-

козы в организме до СО

и Н

О участвует последовательно около 15

различных ферментов (см. главу 10).

Биологические катализаторы, т.е. ферменты, как оказалось, не вызы-

вают в отличие от неорганических катализаторов каких-либо побочных

реакций и не участвуют в реакциях, невозможных по термодинамическим

условиям; и те, и другие катализаторы только ускоряют химические

реакции, обычно протекающие очень медленно. Примером может служить

реакция расщепления перекиси водорода на кислород и воду, медленно

протекающая в отсутствие катализатора. При добавлении мелкораздроб-

ленной платины скорость этой реакции резко возрастает:

Эта же реакция будет протекать намного быстрее в присутствии фермен-

та каталазы, содержащейся, в частности, в эритроцитах, причем образуются

те же конечные продукты распада перекиси водорода.

Таким образом, можно считать установленным, что ферменты ката-

лизируют ряд химических реакций, аналогичных химическим реакциям,

катализируемым неорганическими веществами. Более того, считается ус-

тановленным, что любую из протекающих в живых организмах (или

клетках) химическую реакцию можно в принципе осуществить вне орга-

низма (или вне клетки), если экспериментатору удается выделить соот-

ветствующий фермент (или систему ферментов), катализирующий данную

реакцию, и создать оптимальные условия для его действия.

Горизонты энзимологии. В литературе появляются работы, в которых

делаются попытки прогнозирования дальнейшего развития энзимологии на

ближайшее десятилетие. Перечислим основные направления исследований

энзимологии будущего. Во-первых, это исследования более тонких деталей

молекулярного механизма и принципов действия ферментов в соответствии

с законами классической органической химии и квантовой механики,

а также разработка на этой основе теории ферментативного катализа.

Во-вторых, это изучение ферментов на более высоких уровнях (надмоле-

кулярном и клеточном) структурной организации живых систем, причем не

столько отдельных ферментов, сколько ферментных комплексов в сложных

системах. В-третьих, исследование механизмов регуляции активности и

синтеза ферментов и вклада химической модификации в действие фермен-

тов. В-четвертых, будут развиваться исследования в области создания

искусственных низкомолекулярных ферментов – синзимов (синтетические

аналоги ферментов), наделенных аналогично нативным ферментам высокой

специфичностью действия и каталитической активностью, но лишенных

побочных антигенных свойств. В-пятых, исследования в области инже-

нерной энзимологии (белковая инженерия), создание «гибридных» ката-

лизаторов, сочетающих свойства ферментов, антител и рецепторов, а также

создание биотехнологических реакторов с участием индивидуальных фер-

ментов или полиферментных комплексов, обеспечивающих получение и

производство наиболее ценных материалов и средств для народного хо-

зяйства и медицины. Наконец, исследования в области медицинской эн-

зимологии, основной целью которых является выяснение молекулярных

основ наследственных и соматических болезней человека, в основе развития

которых лежат дефекты синтеза ферментов или нарушения регуляции

активности ферментов.

117

2Н

Платина

(или каталаза)

2Н

O + O

ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ФЕРМЕНТОВ

В настоящее время получены неопровержимые экспериментальные дока-

зательства белковой природы ферментов *.

Трудно сейчас представить, что не только Р. Вильштеттер еще в 1926 г.

отрицал принадлежность ферментов к белкам или к какому-либо извест-

ному классу органических веществ, но и совсем недавно высказывались

сомнения на этот счет. Поводом для сомнений являлись опыты, в которых

хотя и были получены ферментативно активные растворы, но белок не мог

быть обнаружен при помощи качественных цветных реакций. Объясняется

это тем, что концентрация фермента даже при высокой удельной актив-

ности оказывалась ниже пороговой чувствительности химического теста на

белок.

О белковой природе ферментов свидетельствует факт инактивирования

(потеря активности) ферментов брожения при кипячении, установленный

еще Л. Пастером. При кипячении наступает необратимая денатурация

белка-фермента. Фермент при этом теряет присущее ему свойство ка-

тализировать химическую реакцию. Точно так же белки при кипячении

денатурируются и теряют свои биологические свойства (антигенные, гор-

мональные, каталитические). Под влиянием различных физических и хи-

мических факторов (воздействие УФ- и рентгеновского излучения, ультра-

звука, осаждение минеральными кислотами, щелочами, алкалоидными

реактивами, солями тяжелых металлов и др.) происходит денатурация

ферментов, так же как и белков.

Ферменты при гидролизе, как и белки, распадаются на аминокислоты,

что, бесспорно, служит веским доказательством белковой природы фер-

ментов **.

Интересные данные, указывающие на белковую природу ферментов,

были получены в лаборатории И.П. Павлова. При определении пере-

варивающей способности желудочного сока была обнаружена прямая

зависимость между этой способностью и количеством белка в соке. В связи

с этим было сделано заключение, что пепсин желудочного сока является

белком.

Вескими доказательствами белковой природы фермента являются его

получение в чистом виде и выделение в форме кристаллов белка. К настоя-

щему времени получено более 1000 кристаллических ферментов. Структура

многих из них изучена детально при помощи современных методов химии

белков и молекулярной физики [методами рентгеноструктурного анализа,

ядерного магнитного резонанса (ЯМР), электронного парамагнитного ре-

зонанса (ЭПР) и др.].

Ферменты, как и все белки, обладают рядом свойств, характерных для

высокомолекулярных соединений: амфотерностью (могут существовать

в растворе в виде анионов, катионов и амфионов); электрофоретической

подвижностью благодаря наличию в них положительных и отрицательных

зарядов, а в изоэлектрической точке не обнаруживают подвижности в

электрическом поле. Ферменты неспособны к диализу через полупрони-

* Единственным исключением из этого положения является обнаружение у молекулы ряда

предшественников РНК ферментативной активности, получившей название рибозима и ка-

тализирующей самосплайсинг, т.е. отщепление интронных нетранслируемых последователь-

ностей от предшественника РНК (см. главу 13).

** Некоторые ферменты, помимо белковой части, содержат небелковый компонент,

образуя молекулу сложного белка (см. далее).

118

цаемые мембраны. При помощи диализа их растворы можно освободить от

низкомолекулярных примесей. Как и белки, они легко осаждаются из

водных растворов при низких температурах методами высаливания или

осторожным добавлением ацетона, этанола и других веществ и при этом не

теряют своих каталитических свойств.

Подобно белкам, ферменты имеют большую молекулярную массу – от

десятков тысяч до нескольких миллионов (табл. 4.1).

Таблица 4.1. Молекулярная масса ферментов

Фермент

Рибонуклеаза

Цитохром с

Трипсин

Пепсин

Гексокиназа

Щелочная фосфатаза

Молекулярная

масса

13700

15000

23800

32100

45000

80000

Фермент

Лактатдегидрогеназа

Альдолаза

Каталаза

Глутаматдегидрогеназа

Уреаза

Пируватдегидрогеназа

(комплекс)

Молекулярная

масса

140000

142000

248000

336000

480000

4500000

Ферменты оказывают высокоспецифическое действие, что также дока-

зывает их белковую природу, поскольку белки в иммунологическом отно-

шении отличаются крайне высокой специфичностью. Наконец, прямым

доказательством белковой природы ферментов является лабораторный

синтез первого фермента – рибонуклеазы, осуществленный в 1969 г. в ла-

боратории Б. Меррифилда в Нью-Йорке *.

Этот автоматический синтез на твердой фазе состоял в последова-

тельном включении всех 124 аминокислотных остатков в строгом соот-

ветствии с последовательностью аминокислот (с первичной структурой)

естественного фермента – рибонуклеазы поджелудочной железы **.

Искусственно синтезированный фермент не отличался от природной

рибонуклеазы по химическим, каталитическим и иммунологическим тес-

там.

Принимая во внимание перечисленные обстоятельства, при получении

ферментов в чистом виде и при их хранении следует учитывать одно важное

свойство белков, а именно стабильность, которая определяется рядом

факторов. Одним из общих правил при работе с ферментами является

оптимальная температура, обычно соответствующая температуре тела,

а для препаративных целей – использование температуры около 0°С.

Следует, однако, иметь в виду, что несколько ферментов, весьма

чувствительных к пониженной температуре, в частности митохондриальный

фермент (АТФаза), катализирующий распад АТФ, при 0°С подвергается

инактивации, в то время как при комнатной температуре остается стабиль-

ным. Большинство ферментов сохраняет стабильность при рН 6,0–8,0, хотя

имеются исключения. Для препаративных целей часто прибегают к обезво-

* Полную первичную структуру панкреатической рибонуклеазы расшифровали в 1955 г.

С. Мур и У. Стейн.

** Осуществлен также искусственный синтез второго фермента – лизоцима, состоящего из

118 аминокислотных остатков.

119

живанию фермента (удаление воды) в вакууме из замороженного раствора

(метод получил название «лиофилизация»). Осаждение из раствора фер-

ментов спиртом или ацетоном также проводят при низкой температуре,

поскольку при комнатной температуре эти процедуры приводят к почти

полной потере ферментативной активности. Для стабилизации фермента

часто пользуются хелатообразующими агентами: например, к ферменту

добавляют этилендиаминтетраацетат (ЭДТА):

ЭДТА может связывать нежелательные примеси (следы ионов тяжелых

металлов: меди, свинца, ртути и др. – в реактивах), тормозящие активность

фермента. Одно из непременных условий сохранения стабильности фер-

ментов – хранение их в высушенном или замороженном состоянии (в усло-

виях холода). Многие ферменты стабильны в виде суспензии в концентри-

рованных растворах сульфата аммония.

СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

В природе существуют как простые, так и сложные ферменты. Первые

целиком представлены полипептидными цепями и при гидролизе распа-

даются исключительно на аминокислоты. Такими ферментами (простые

белки) являются гидролитические ферменты, в частности пепсин, трипсин,

папаин, уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и др. Большинство

природных ферментов относится к классу сложных белков, содержащих,

помимо полипептидных цепей, какой-либо небелковый компонент (кофак-

тор), присутствие которого является абсолютно необходимым для ката-

литической активности. Кофакторы могут иметь различную химическую

природу и различаться по прочности связи с полипептидной цепью. Если

константа диссоциации сложного фермента настолько мала, что в растворе

все полипептидные цепи оказываются связанными со своими кофакторами

и не разделяются при выделении и очистке, то такой фермент получает

название холофермента (холоэнзим), а кофактор – простетической

группы, рассматривающейся как интегральная часть молекулы фермента.

Полипептидную часть фермента принято называть апоферментом.

В литературе до сих пор употребляются и другие наименования компо-

нентов сложных ферментов, в частности «фермент-протеид», «белковый

компонент» (апофермент), «кофермент» (коэнзим) и «простетическая груп-

па». Под коферментом часто подразумевают дополнительную группу,

легко отделяемую от апофермента при диссоциации. Предполагают, что

простетическая группа может быть связана с белком ковалентными и неко-

валентными связями. Так, в молекуле ацетилкоэнзим-А-карбоксилазы ко-

фактор биотин ковалентно связан с апоферментом посредством амидной

связи (см. главу 7). С другой стороны, химические связи между кофакто-

рами и пептидными цепями могут быть относительно слабыми (например,

водородные связи, электростатические взаимодействия и др.). В таких

случаях при выделении ферментов наблюдается полная диссоциация обеих

частей, и изолированый белковый компонент оказывается лишенным фер-

120