Журнал - Проблемы криобиологии 2010 №3

Подождите немного. Документ загружается.

303

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38

057) 373-31-26, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

3126, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 615.361.018.5.013.8.014.41

А.Н. ГОЛЬЦЕВ*, В.В. ВОЛИНА, Л.В. СОКОЛ,

М.В. ОСТАНКОВ, К.А. ГОЛЬЦЕВ, С.С. ЧЕРНОУСОВА, О.Ю. КОЖИНА

Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования

на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека

UDC 615.361.018.5.013.8.014.41

A.N. GOLTSEV* , V. V. V OLINA, L.V. SOKOL,

M.V. OSTANKOV, K.A. GOLTSEV, S.S. CHERNOUSOVA, O.YU. KOZHINA

Effect of Hypothermic Storage and Cryopreservation

on Human Cord Blood Leucoconcentrate Cells

Изучали влияние гипотермического хранения до криоконсервирования и самого процесса криоконсервирования на

сохранность, жизнеспособность и свойства мембран стволовых кроветворных клеток с высоким потенциалом пролиферативной

активности и самоподдержки, а также некроветворных клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека (ЛККЧ). Полученные

результаты позволили экспериментально обосновать максимально допустимый срок (24 ч) гипотермического хранения кордовой

крови до изготовления из нее ЛККЧ. Показано повышение проницаемости плазматических мембран стволовых кроветворных

клеток с высоким потенциалом пролиферативной активности после их криоконсервирования, которая растет со сроком

предварительного гипотермического хранения и под влиянием процесса криоконсервирования.

Ключевые слова: кордовая кровь человека, стволовые кроветворные и некроветворные клетки, гипотермическое хранение,

криоконсервирование.

Вивчали вплив гіпотермічного зберігання до кріоконсервування та самого процесу кріоконсервування на збереженість,

життєздатність та властивості мембран стовбурових кровотворних клітин з високим потенціалом проліферативної активності

та самопідтримки, а також некровотворних клітин лейкоконцентрату кордової крові людини (ЛККЛ). Отримані результати

дозволили експериментально обґрунтувати максимально допустимий строк (24 години) гіпотермічного зберігання кордової

крові до виготовлення з неї ЛККЛ. Показано підвищення проникності плазматичних мембран стовбурових кровотворних

клітин з високим потенціалом проліферативної активності після їх кріоконсервування, яке зростає зі строком попереднього

гіпотермічного зберігання та під впливом процесу кріоконсервування.

Ключові слова: кордова кров людини, стовбурові кровотворні та некровотворні клітини, гіпотермічне зберігання,

кріоконсервування.

Pre-cryopreservation hypothermic storage and cryopreservation process itself effects on integrity, viability and membrane properties

of hemopoietic stem cells with high proliferative activity and self-support potentials as well as of non-hemopoietic human cord blood

leucoconcentrate (HCBL) cells were investigated, as well as correlation between phenotypic marker expression and functional condition

of these cells was assessed. The data obtained allowed experimental substantiating the maximally acceptable term of hypothermic

storage (24 hrs) of cord blood prior to production of HCBL. A rise in plasmatic membrane permeability of stem hemopoietic cells with

a high proliferative activity potential after their cryopreservation was shown. The permeability also increased, as the term of

preliminary hypothermic storage was prolonged.

Key words: human cord blood, stem hemopoietic and non-hemopoietic cells, hypothermic storage, cryopreservation.

Определение температурных условий и дли-

тельности хранения образцов кордовой крови чело-

века (ККЧ) до замораживания остается сущест-

венной проблемой, так как кровь необходимо

транспортировать в специализированные лабора-

тории для работы, связанной с выделением ядро-

содержащих клеток ККЧ, их тестированием и

криоконсервированием. Также не решена пробле-

ма длительности хранения образцов препаратов,

The selection of temperature conditions and stor-

age duration of human cord blood (HCB) samples be-

fore freezing has presented a great challenge, since

the blood is supposed to be transported to specialized

laboratories for isolation of HCB nuclear cells, their

testing and cryopreservation. The problem of storage

duration for samples of HCB preparations in case of

impossibility of cryopreservation right after their ob-

tainment, was not solved either.

криоконсервирование

биологических объектов

cryopreservation

of biological systems

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

304

A lot of scientific works gave coverage to issues of

storage duration of cord blood samples prior to pro-

duction of preparations from it and to hemopoietic cell

cryopreservation [6, 7, 13]. The results of researches

confirm that storage conditions of HCB before freez-

ing are important for providing quality maintenance of

cell material. Nevertheless the data on storage dura-

tion before freezing HCB preparations are insufficient,

consequently this matter requires further investigations.

The aim of the work is to study the effect of pre-

cryopreservation hypothermic storage and cryopreser-

vation process itself on integrity and viability of

hemopoietic stem cells with high proliferative activity

and self-maintainance potentials as well as of non-

hemopoietic HCB cells.

Materials and methods

The subject of inquiry was HCB samples, which

were obtained from maternal end of umbilical cord af-

ter separating neonates, who were born in time by

healthy obstetric patients, as well as HCB leukocon-

centrate (HCBL) suspended in autologous plasma and

obtained by sedimentation [2].

Blood was collected in sterile flasks with CPD

(citrate-phosphate-dextrose solution) anticoagulant.

Cord blood was stored prior to HCBL production in a

domestic fridge at 4°C.

HCB and HCBL were frozen in disposable plastic

containers according to the two-stage program with-

out traditional cryoprotectants [3]. Cryopreserved sam-

ples were stored in liquid nitrogen at –196°C.

Containers were immerged in a water bath at the

temperature 40–41°C for thawing suspensions.

Depending on hypothermic storage conditions HCB

samples were divided into the groups:

HCB

was stored at 4°C for 24 hrs after delivering

from a maternity hospital prior to cryopreservation (con-

trol for the groups HCB

and HCB

);

HCB

was stored at 4°C for 48 hrs prior to cryopre-

servation (control for the group HCB

);

HCB

was cryopreserved after 24 hour preliminary

hypothermic storage (control for the group HCB

);

HCB

was cryopreserved after preliminary 48-hour

hypothermic storage.

HCBL was divided into the groups:

HCBL

was native leukoconcentrate obtained from

HCB

(control for HCBL

);

HCBL

was frozen-thawed HCBL

right after

thawing.

Numbers of nucleated cells in the control and ex-

perimental samples were counted in Goryaev’s cham-

ber by the standard method, and integrity of nuclear

cell was assessed by supravital staining with trypan

blue [10].

Quantity of colony forming units in culture (CFUc)

was determined by numbers of clusters and colonies,

formed in semiliquid agar, by the method [8, 12] with

изготовленных из ККЧ, при невозможности их

криоконсервирования сразу после получения.

Вопросы длительности хранения образцов кор-

довой крови до изготовления из нее препаратов и

криоконсервирования гемопоэтических клеток ос-

вещены во многих научных работах [6, 7, 13].

Результаты исследований подтверждают, что ус-

ловия хранения ККЧ перед замораживанием важны

для обеспечения сохранности качества клеточного

материала. Однако данных о длительности хране-

ния перед низкотемпературным замораживанием

препаратов, изготовленных из ККЧ, недостаточно,

следовательно, эта проблема требует детального

изучения.

Цель работы – изучение влияния гипотерми-

ческого хранения до криоконсервирования и самого

процесса криоконсервирования на сохранность и

жизнеспособность стволовых кроветворных кле-

ток с высоким потенциалом пролиферативной ак-

тивности и самоподдержки, а также некроветвор-

ных клеток ККЧ.

Материалы и методы

Объектом исследования служили образцы

ККЧ, которые получали из материнского конца

пуповины после отделения новорожденных, родив-

шихся в срок у здоровых рожениц, а также лейко-

концентрат ККЧ (ЛККЧ), взвешенный в аутологич-

ной плазме и полученный из ККЧ седиментацион-

ным методом [2].

Кровь отбирали в стерильные флаконы с добав-

лением антикоагулянта CPD (цитратно-фосфатно-

декстрозный раствор). Перед получением ЛККЧ

кордовую кровь хранили в бытовом холодильнике

при 4°С.

Замораживали ККЧ и ЛККЧ в одноразовых

пластиковых контейнерах по двухэтапной програм-

ме без использования традиционных криопротек-

торов [3]. Криоконсервированные образцы хранили

в жидком азоте при температуре –196°С.

Для отогрева суспензий контейнеры погружали

в водяную баню при температуре 40–41°С.

В зависимости от условий гипотермического

хранения образцы ККЧ были разделены на группы:

ККЧ

, хранившаяся при 4°С в течение 24 ч

после получения из родильного дома до криокон-

сервирования (контроль для групп ККЧ

и ККЧ

);

ККЧ

, хранившаяся при 4°С в течение 48 ч до

криоконсервирования (контроль для группы ККЧ

);

ККЧ

, криоконсервированная после 24 ч пред-

варительного гипотермического хранения (конт-

роль для группы ККЧ

);

ККЧ

, криоконсервированная после 48 ч предва-

рительного гипотермического хранения.

ЛККЧ также был разделен на группы:

ЛККЧ

– нативный лейкоконцентрат, получен-

ный из ККЧ

(контроль для группы ЛККЧ

);

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

305

ЛККЧ

– криоконсервированный ЛККЧ

сразу

после отогрева.

В опытных и контрольных образцах препарата

по общепринятой методике определяли количество

ядросодержащих клеток в камере Горяева и коли-

чество сохранных клеток методом суправиталь-

ного окрашивания трипановым синим [10].

Количество КОЕк (колониеобразующие едини-

цы в культуре) определяли по числу кластеров и

колоний, сформировавшихся в полужидком агаре,

по методу [8, 12] в нашей модификации. Типы

колоний оценивали на 8-е сутки культивирования с

помощью инвертированного микроскопа на гисто-

логических препаратах, изготовленных из агаровых

блоков и окрашенных гематоксилином и эозином

[5]. Сохранность ядерных гемопоэтических клеток

ККЧ определяли с помощью окрашивания пропи-

диум йодидом, проточного цитофлуориметра FACS

Calibur (BD, США) и программного обеспечения

Win MDI [9].

Полученные результаты обрабатывали по ме-

тоду Стьюдента с учетом коэффициента Фишера.

Достоверность отличий оценивали с помощью t-

критерия с уровнем значимости 5% [1].

Результаты и обсуждение

Установлено, что количество сохранных ядро-

содержащих клеток (по окрашиванию трипановым

синим) во всех образцах оставалось на достаточно

our modification. Colony types were assessed to the

day of culture on an inverted microscope in histo-

logical preparations obtained from agar blocks and

stained with hematoxylin and eosin [5]. HCB nuclear

hemopoietic cell integrity was determined using propi-

dium iodide staining and FACS Calibur flow cytofluori-

meter (BD Biosciences, USA), the data were proces-

sed with Win MDI software [9].

The data obtained were processed by Student’s test

with Fisher’s correction. The difference significance

was assessed by the t-test with the significance level

of 5% [1].

Results and discussion

The integrity of nuclear cell in all the samples (asses-

sed by trypan blue staining) was established to remain

considerably high (Table). This can be attributed to the

fact that hypothermic storage and cryopreservation

caused no injuries of HCB nucleated cell membranes.

The number of hemopoietic stem cells correlating

with CFUc did not change during hypothermic storage

and after cryopreservation, either (Table).

During culturing of cord blood nucleated cells stored

for 24 and 48 hrs at 4°C prior to cryopreservation as

well as in thawed HCB

samples the number and types

of the formed colonies did not change significantly (Ta-

ble). The relative quantity of viable cells and the quan-

tity of formed colonies tended to decline in the thawed

HCB

samples after 48 hrs.

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

Количество ядросодержащих клеток, относительное количество

сохранных клеток и КОЕк ЛККЧ в зависимости от сроков

гипотермического хранения и последующего

криоконсервирования (n = 6)

Quantity of nucleated cells, relative quantities ofviable cells and

CFUc in HCBL depending on hypothermic storage terms and

following cryopreservation (n = 6).

ыцзарбО

selpmaS

овтсечилоK

хищажредосордя

,котелк × 01

лм/

forebmuN

,sllecraelcun

× 01

lm/

еоньлетисонтО

овтсечилок

хыннархос

%,котелк

ytitnauqevitaleR

%,sllecefasfo

овтсечилоK

%,кЕОK

%,ytitnauqcUFC

ЧKK

BCH

13,0±51,11±7959,0±05,2

ЧKK

BCH

78,0±01,11±697,0±0,3

ЧKK

BCH

33,0±51,11±386,0±2,3

ЧKK

BCH

66,0±86,0

2,1

4,1±0,73

2,1

7,0±0,2

ЧKKЛ

LBCH

83,0±05,11±7968,0±07,2

ЧKKЛ

LBCH

23,0±53,16,1±0,6834,0±05,2

Примечание:

– отличия достоверны (p < 0,05) в сравнении с ККЧ

;

– отличия достоверны (p < 0,05) в сравнении с ККЧ

Note: * – significant differences (p < 0.05) as compared to data of HCB

;

– significant differences (p < 0.05) as compared to data of HCB

высоком уровне (таблица). Этот факт мо-

жет быть объяснен тем, что гипотерми-

ческое хранение и криоконсервирование не

приводили к повреждению мембран ядросо-

держащих клеток ККЧ.

Количество стволовых кроветворных

клеток, коррелирующее с количеством

КОЕк, также не изменялось на этапах гипо-

термического хранения и после криокон-

сервирования (таблица).

В процессе культивирования ядросодер-

жащих клеток кордовой крови, хранившейся

24 и 48 ч при температуре 4°С до криокон-

сервирования, а также в отогретых образ-

цах ККЧ

количество и типы образованных

колоний достоверно не изменялись (табли-

ца). После 48 ч в отогретых образцах ККЧ

относительное количество сохранных кле-

ток и количество образованных колоний

имели тенденцию к снижению.

Приведенные результаты свидетельст-

вуют о том, что на этапах гипотермичес-

кого хранения через 48 ч возникают неле-

тальные повреждения ядросодержащих

клеток, проявляющиеся в снижении их

криоустойчивости. В связи с этим для по-

следующего криоконсервирования ЛККЧ

306

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

влияют на функциональную активность клеток,

образующих в агаровых культурах кластеры и

микроколонии. Клетки ЛККЧ

образовывали те же

самые колонии, что и клетки ЛККЧ

, находящиеся

на разных стадиях дифференцирования (миело-

бласты, миелоциты, палочко- и сегментоядерные

клетки). Однако чаще всего отмечали макроко-

лонии миелоидно-моноцитарного типа (рис. 1).

Кроме того, встречались колонии, которые были

сформированы фибробластоподобными клетками.

Они имели волокнистые структуры, образующие

соединительно-тканный каркас вокруг клеточных

элементов колоний (рис. 2).

Количество, пролиферативная активность и

направленность дифференцирования стволовых

кроветворных клеток лейкоконцентрата после

криоконсервирования не изменялись (таблица). На

8-е сутки культивирования деконсервированные

кроветворные клетки формировали такое же коли-

чество и тот же тип колоний, как и клетки суспензии

до замораживания-отогрева (эритроидные, моно-

цитарно-макрофагальные, миелоидные колонии, а

также колонии, сформированные фибробласто-

подобными и недифференцированными клетками).

Результаты экспериментов свидетельствуют,

что гипотермическое хранение при 4°С в течение

These results show the appearance of non-lethal

injuries in nuclear cells after 48-hour hypothermic stor-

age leading to a decrease in their cryoresistance. Due

to this fact HCBL for further cryopreservation was

isolated from human cord blood stored under hypo-

thermic conditions not longer than 24 hrs.

Post-thaw number of nucleated cells and the rela-

tive integrity of HCBL

cells were not changed signifi-

cantly as compared to the data of HCBL

(Table).

Population of HCB hemopoietic cells is heteroge-

neous: along with HC of different differentiation stages

HCB contains mature cells. Stem cells and early pre-

cursor cells of mature cell types are known to have ra-

ther high tolerance to hypothermic conditions in com-

parison with other cells [4]. Hypothermic storage and

following low temperature preservation were not shown

to affect the functional activity of cells forming clus-

ters and microcolonies in agar cultures. HCBL

cells

formed the same colonies as cells of the HCBL

, rep-

resented by cells of different differentiation stages

(myeloblasts, myelocytes, rod nucleated and segmen-

tated cells) did. However macrocolonies of myeloid-

monocytic type were the most frequent (Fig. 1).

Additionally the colonies formed by fibroblast-like

cells were noted. They had fibroid structures forming

connective-tissue network around colony cells (Fig. 2).

получали из кордовой крови

человека, хранившейся в

условиях гипотермии не

более 24 ч.

После отогрева криокон-

сервированного ЛККЧ

ко-

личество ядросодержащих и

относительное количество

сохранных клеток досто-

верно не изменялись по

сравнению с их содержани-

ем в образцах ЛККЧ

(таб-

лица).

Популяция гемопоэти-

ческих клеток ККЧ являет-

ся гетерогенной, в ней наря-

ду с ГК разной степени

дифференциации присут-

ствуют и зрелые клеточные

элементы. Известно, что

стволовые и ранние клетки-

предшественники зрелых

клеточных типов имеют

достаточно высокую устой-

чивость к условиям гипо-

термии по сравнению с дру-

гими клетками [4]. Показа-

но, что процессы гипотер-

мического хранения и по-

следующего низкотемпера-

турного консервирования не

а aб b

Рис. 1. Колонии миелоидно-моноцитарного типа на 8-е сутки культивирования

клеток ЛККЧ: а – свежевыделенный образец; б – образец, хранившийся в условиях

гипотермии в течение 24 ч; в – образец, криоконсервированный непосредственно

после получения; г – образец, криоконсервированный после 24 ч предвари-

тельного гипотермического хранения. Окраска гематоксилином и эозином, ×900.

Fig. 1. Myeloid-monocyte colonies to the 8th day of culture of the HCBL cells: a –

freshly isolated; b – stored under hypothermic conditions for 24 hrs; c – frozen-

thawed immediately after isolation; d – frozen-thawed after the preliminary 24-hour

hypothermic storage. Hematoxylin and eosin staining. ×900.

в cг d

307

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

крови по оптимальной программе, что свидетельст-

вует о развитии нелетальных повреждений ядросо-

держащих клеток в условиях гипотермии, которые

на этапах криоконсервирования переходят в ле-

тальные и являются причиной снижения их

криоустойчивости. Как было показано на других

биообъектах, причинами развития нелетальных

повреждений являются длительная гипоксия,

изменения физико-химических свойств клеточных

мембран и их проницаемости, а также нарушение

последовательности течения метаболических про-

цессов в клетках, в результате чего происходит

накопление промежуточных продуктов метаболиз-

ма [11].

Таким образом, установлено, что оптимальный

срок гипотермического хранения ККЧ до начала

получения из нее ЛККЧ равен 24 ч.

Использование специфического для ДНК

флуоресцентного красителя пропидия йодида (РІ)

позволило визуализировать потерю целостности

плазматических мембран клеток ЛККЧ после за-

мораживания-отогрева. В образцах ЛККЧ

коли-

чество PI

–

-клеток (с неповрежденной мембраной)

и PI

-клеток составило соответственно 50,0 ± 10,8

и 49,9 ± 10,8.

Большой разброс показателей сохранности

клеток ЛККЧ в образцах можно объяснить неодно-

родностью исходного материала (ККЧ) и чувстви-

тельностью криоконсервированного материала к

физико-химическим факторам и условиям получе-

ния данных на цитофлуориметре.

Выводы

Полученные результаты позволили экспери-

ментально обосновать максимально допустимый

срок (24 ч) гипотермического хранения кордовой

крови до получения из нее ЛККЧ.

Было показано уменьшение сохранности плаз-

матических мембран стволовых кроветворных

The number, proliferative activity as well as direc-

tion of differentiation in leukoconcentrate hemopoietic

stem cells was not changed after freeze-thawing (Ta-

ble). On the 8th day of culture the post-thaw hemo-

poietic cells formed the same quantity and the same

types of colonies as cells not subjected to freeze-thaw-

ing (erythroid, monocytic-macrophage, myeloid colo-

nies as well as colonies formed by fibroblast-like and

non-differentiated cells).

The results testify the fact that 24-hour hypother-

mic storage at 4°C did not influence the safety, func-

tional activity and cryotolerance of hemopoietic and

non-hemopoietic stem cells in HCB. After 48-hour hy-

pothermic storage the number of nucleated cells and

cell integrity tended to decline in HCB. A significant

decrease in the quantity of nucleated cells and their

integrity was observed after cryopreservation accord-

ing to the optimal program of these cord blood sam-

ples, that attests to non-lethal injuries development in

nuclear cells under hypothermic conditions, turning into

lethal ones during freeze-thawing and are responsible

for a decline in the cell cryoresistance. As it was shown

in other bioobjects, prolonged hypoxia, physico-chemi-

cal changes in cell membrane properties and their per-

meability as well as distortions of metabolic processes

succession in cells accounted for development of non-

lethal injuries in cells, which led to accumulation of in-

termediate metabolic products [11].

Thus it was found that the optimal term of HCB

hypothermic storage prior to HCBL isolation is 24 hrs.

The usage of the DNA-specific fluorescent dye

propidium iodide (PI) allowed to reveal the loss of plas-

matic membrane integrity in HCBL cells after freeze-

thawing. In HCBL

samples the number of PI

–

cells

(with non-affected membrane) and PI

cells made

50.0 ± 10.8 and 49.9 ± 10.8, correspondingly.

A great variability of HCBL cell safety indices in

the samples can be attributed to heterogeneity of the

original material (HCB) and to sensitivity of the cryo-

24 ч не влияло на сохран-

ность, функциональную ак-

тивность и криоустойчи-

вость стволовых крове-

творных и некроветворных

клеток в составе ККЧ. Пос-

ле 48 ч гипотермического

хранения в ККЧ количество

ядросодержащих клеток и

их сохранность имели тен-

денцию к снижению. Досто-

верное снижение количества

ядросодержащих и сохран-

ных клеток выявляется пос-

ле криоконсервирования

данных образцов кордовой

а aб b

Рис. 2. Колонии фибробластоподобных клеток на 8-е сутки культивирования клеток

ЛККЧ: а – ЛККЧ

; б – ЛККЧ

. Окраска гематоксилином и эозином, ×400.

Fig. 2. Colonies of fibroblast-like cells to the 8th culture day in HCBL: a – HCBL

; b –

HCBL

. Hematoxylin and eosin staining, ×400.

308

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

preserved material to physico-chemical factors and

conditions of the data collection with cytofluorimeter.

Conclusions

The data obtained allowed experimental substanti-

ating the maximally acceptable term (24 hrs) of hypo-

termic storage of cord blood prior to production of

HCBL.

A decrease in plasmatic membrane integrity of

hemopoietic stem cells with high proliferative activity

potential was noted after their cryopreservation. This

index was affected by the term of preliminary hypo-

thermic storage.

клеток с высоким потенциалом пролиферативной

активности после их криоконсервирования. Этот

показатель зависел также от сроков предваритель-

ного гипотермического хранения.

Литература

Лакин Г.Ф. Биометрия.– М.: Высш. школа, 1980.– 293 с.

Цуцаєва А.О., Грищенко В.І., Кудокоцева О.В., Проко-

пюк О.С. Заготівля, кріоконсервування та клінічне засто-

сування гемопоетичних клітин кордової крові людини:

Метод. рекомендації.– Харків, 2000.– 16 с.

Патент №31847А, МПК А01N1/02. Україна. Спосіб

кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові /

А.О. Цуцаєва, В.І. Грищенко, О.В. Кудокоцева та інш. Заяв-

лено 05.11.1998; Опубл. 15.12.2000. Бюл. №7.– С. 1–10.

Berz D., McCormack E.M., Winer E.S. et al. Cryopreservation

of hemapoietic stem cells // J. Hematol.– 2007.– Vol. 82, N6.–

P. 463–472.

Bol S., Engh G., Visser J. A technique for staining haemo-

poietic colonies in agar cultures // Exp. Hemat.– 1977.–

Vol. 97, N5.– P. 551–553.

Campos L., Roubi N., Gyotat D. Definition of optimal conditions

for collection and cryopreservation of umbilical cord hemato-

poietic cells // Cryobiology.– 1995.– Vol. 32, N6.– P. 511–515.

Donaldson C., Armitage W.J., Denning-Kendall P.A. et al.

Optimal cryopreservation of human umbilical cord blood //

Bone Marrow Transplantation.– 1996.– Vol. 42, N18.– P. 725–

731.

Knudtzon S. In vitro growth of granulocytic colonies from

circulating cells in human cord blood // Blood.– 1974.– Vol. 43,

N3.– P. 357–361.

Lecoeur H. Nuclear apoptosis detection by flow cytometry:

influence of endogenous endonucleases // Exp. Cell Res.–

2002.– Vol. 277, N1.– P. 1–14.

Malinin T.I., Perry V.P. A review of tissue and organ viability

assay // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N3.– Р. 104.

Meyer T.P., Hofmann B., Zaisserer J. et al. Analysis and

cryopreservation of hemapoietic stem and progenitor cells

from umbilical cord blood // Cytotherapy.– 2006.– Vol. 8, N3.–

P. 265–276.

Nakanata T. Hemopoetic colony-forming cells umbilican cord

blood with extensive capability to generate mono- and

multipotential hemopoetic progenitors // J. Clin. Invest.– 1982.–

Vol. 7, N6.– P. 1324–1328.

Rubinstein P., Roserfiels R.E., Adamson J.W., Stevens C.E.

Stored placental blood for unrelated bone marrow recon-

stitution // Blood.– 1993.– Vol. 81, N7.– P. 1679–1690.

Поступила 16.02.2010

Рецензент Н.Г. Землянских

10.

11.

12.

13.

References

Lakin G.F. Biometry.– Moscow: Vysshaya shkola, 1980.–

293 p.

Tsutsayeva A.O., Grischenko V.I., Kudokotseva O.V., Proko-

pyuk O.C. Procurement, cryopreservation and clinical applica-

tion of human cord blood hemopoietic cells: Methodical

recommendations.– Kharkiv, 2000.– 16 p.

Patent of Ukraine N31847A, IPC A01N1/02. Method for

cryopreservation of cord blood hemopoietic cells / A.O. Tsu-

tsayeva, V.I. Grischenko, O.V. Kudokotseva, A.V. et al.– Filed

in: 11.05.98. Published in: 12.15.2000. Bul. N7.– P.1–10.

Berz D., McCormack E.M., Winer E.S. et al. Cryopreservation

of hemapoietic stem cells // J. Hematol.– 2007.– Vol. 82, N6.–

P. 463–472.

Bol S., Engh G., Visser J. A technique for staining haemo-

poietic colonies in agar cultures // Exp. Hemat.– 1977.–

Vol. 97, N5.– P. 551–553.

Campos L., Roubi N., Gyotat D. Definition of optimal conditions

for collection and cryopreservation of umbilical cord hemato-

poietic cells // Cryobiology.– 1995.– Vol. 32, N6.– P. 511–515.

Donaldson C., Armitage W.J., Denning-Kendall P.A. et al.

Optimal cryopreservation of human umbilical cord blood //

Bone Marrow Transplantation.– 1996.– Vol. 42, N18.– P. 725–

731.

Knudtzon S. In vitro growth of granulocytic colonies from

circulating cells in human cord blood // Blood.– 1974.– Vol. 43,

N3.– P. 357–361.

Lecoeur H. Nuclear apoptosis detection by flow cytometry:

influence of endogenous endonucleases // Exp. Cell Res.–

2002.– Vol. 277, N1.– P. 1–14.

Malinin T.I., Perry V.P. A review of tissue and organ viability

assay // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N3.– Р. 104.

Meyer T.P., Hofmann B., Zaisserer J. et al. Analysis and

cryopreservation of hemapoietic stem and progenitor cells

from umbilical cord blood // Cytotherapy.– 2006.– Vol. 8, N3.–

P. 265–276.

Nakanata T. Hemopoetic colony-forming cells umbilican cord

blood with extensive capability to generate mono- and

multipotential hemopoetic progenitors // J. Clin. Invest.– 1982.–

Vol. 7, N6.– P. 1324–1328.

Rubinstein P., Roserfiels R.E., Adamson J.W., Stevens C.E.

Stored placental blood for unrelated bone marrow recon-

stitution // Blood.– 1993.– Vol. 81, N7.– P. 1679–1690.

Accepted in 16.02.2010

10.

11.

12.

13.

309

* Автор, якому необхідно надсилати кореспонденцію:

вул. Переяславська, 23, м. Харків, Україна 61015; тел.: (+38

057) 373-30-34, факс: (+38 057) 373-30-84, електронна пошта:

goncharuk23@gmail.com

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

3034, fax: +380 57 373 3084, e-mail: goncharuk23@gmail.com

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

НАН України, м. Харків

УДК 611.013.84.085.23:615.014.41

О.І. ГОНЧАРУК*, Н.О. ВОЛКОВА, В.І. ГРИЩЕНКО

Вплив кріоконсервування на проліферативні характеристики

і потенціал диференціювання культивованих клітин хоріона

UDC 611.013.84.085.23:615.014.41

E.I. GONCHARUK*, N.A. VOLKOVA, V.I. GRISCHENKO

Сryopreservation Effect on Proliferation Characteristics and

Differentiation Potential of Cultured Chorion Cells

В роботі були досліджені 5 програм кріоконсервування культури клітин хоріона (ККХ), які відрізнялися швидкістю та

часом охолодження. Визначали такі показники, як життєздатність, здатність до адгезії, проліферації та спрямованого

диференціювання за допомогою культуральних методів, світлової та люмінесцентної мікроскопії. Програма, яка характе-

ризується охолодженням до – 6°С зі швидкістю 1°С/хв, сидінгом з наступним охолодженням до –80°С зі швидкістю 10°С/хв

є такою, що забезпечує як добру збереженість популяції ККХ в цілому, так і виживання фракції мультипотентних клітин.

Ключові слова: кріоконсервування, культура клітин хоріона, життєздатність, проліферація, диференціювання.

В работе были исследованы 5 программ криоконсервирования культуры клеток хориона (ККХ), отличающиеся скоростью

и временем охлаждения. Определяли такие показатели, как жизнеспособность, способность к адгезии, пролиферации и направ-

ленному дифференцированию при помощи культуральных методов, световой и люминесцентной микроскопии. Программа,

характеризующаяся охлаждением до –6°С со скоростью 1°С/мин, сидингом с последующим охлаждением до –80°С со скоростью

10°С/мин обеспечивает как хорошую сохранность популяции ККХ в целом, так и выживание фракции мультипотентных клеток.

Ключевые слова: криоконсервирование, культура клеток хориона, жизнеспособность, пролиферация, дифференцирование.

Five programs of chorion cell culture (ChCC) cryopreservation which differ by the cooling rate and duration have been studied in

the work. The properties such as viability, adhesion, proliferation and directed differentiation were studied using culturing, light and

fluorescence microscopy. The program comprising the cooling down to –6°C with the rate of 1°C/min, seeding with following cooling

down to –80°C with the rate of 10°C/min provides both high integrity of ChCC population and survival of the fraction of multipotent

cells.

Key words: cryopreservation, chorion cell culture, viability, proliferation, differentiation.

На сьогодні вивчення стовбурових клітин – ос-

новний напрямок сучасних фундаментальних до-

сліджень у галузі біомедичних клітинних техноло-

гій. Культивування і спрямоване диференціювання

стовбурових клітин, отриманих з різних джерел,

використовують у регенераторній медицині для

відновлення функцій органів і тканин, які були втра-

чені внаслідок спадковості або набутої патології [10,

19]. Одним з джерел отримання стовбурових клітин

є тканини фетоплацентарного комплексу, до яких

відноситься і тканина раннього хоріона, що скла-

дається з клітин з різними морфологічними і функ-

ціональними характеристиками. Це гетерогенна

популяція, до складу якої входять стромальні, епіте-

ліальні і судинні елементи. У роботі використо-

вували ворсинчасту частину тканини хоріона, із якої

отримували суспензію клітин, що далі культивували.

Моношарова культура клітин хоріона (ККХ) має

фібробластоподібну морфологію, стабільний кое-

фіцієнт проліферації та здатність до диференцію-

Nowadays a study of stem cells is main direction

of current fundamental investigations in biomedical cell

technologies. Culturing and directed differentiation of

stem cells, derived from different sources are used in

regenerative medicine for recovery of organ and tis-

sue functions, lost due to inherited or acquired patho-

logies [10, 19]. Tissues of fetoplacental complex, in-

cluding the one of early chorion, comprising the cells

with various morphological and functional characteris-

tics are one of the sources of stem cells. It is the hete-

rogenic population, including stromal, epithelial and

vesicular elements. The villous part of chorion tissue

was used to obtain cell suspension, which was then

cultured. Monolayer culture of chorion cells has fibro-

blast-like morphology, stable proliferation coefficient

and ability to differentiate into adipogenic, chondrogenic

and osteogenic lineages, testifying to the presence of

cell population with stem characteristics. According to

the data [15], chorion cells of 2–4

passages comprise

more than 95% of cells with CD90

, CD73

, CD105

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

310

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

вання у адипогенному, хондрогенному та остео-

генному напрямках, що свідчить про наявність

популяції клітин зі стовбуровими властивостями.

За даними [15], до складу клітин хоріона 2–4 паса-

жів входять більш ніж 95% клітин з імунофеноти-

пом CD90

, CD73

, CD105

та майже не вміщують

клітин з епітопами CD14, CD34, CD45. Це характе-

ризує ККХ як цінний біотехнологічний об'єкт, який

в перспективі може бути використаний для терапії

при різних патологіях [13, 16]. Однак питання кріо-

консервування культивованих клітин хоріона вивчені

недостатньо.

Слід зазначити, що однією з важливих задач

кріобіології є оптимізація протоколів кріоконсерву-

вання культур клітин. Швидкості охолодження, які

забезпечують збереження культивованих клітин, за

різними даними [4, 9, 18] варіюють від дуже повіль-

них (0,5°С/хв) до більш швидких (10°С/хв). Як роз-

чин для кріоконсервування свіжоізольованих і куль-

тивованих клітин використовують суміші, які

складаються з кріопротектора, живильного сере-

довища та додаткових компонентів. Склад і відсо-

ток кожної складової частини кріококтейлю є інди-

відуальним для кожної культури клітин. У зв'язку з

цим пошук оптимальних умов кріоконсервування

клітинних ліній, до складу яких входять стовбурові

клітини, викликає особливий інтерес як до розробки

ефективних способів кріоконсервування, так і

дослідження кріочутливості клітин.

Мета роботи – дослідити вплив низькотемпера-

турного консервування на морфофункціональні

властивості ККХ.

Матеріали і методи

Тканини для дослідження отримували з після-

абортивного матеріалу 6–12 тижнів гестації у

випадках, коли вагітність переривали при відсутнос-

ті патології розвитку чи інфікованості ембріона

(згідно з договором про наукову співпрацю між ДП

„Міжвідомчий науковий центр НАН, АМН і МОЗ

України" і Інститутом проблем кріобіології і кріо-

медицини НАН України). Тканини використовували

з експериментальною метою відповідно до діючого

законодавства України та інформованої згоди

донора.

Суспензію клітин ворсинчастої частини тканини

хоріона людини одержували за допомогою фермен-

тативної дезагрегації [1]. Отриману суспензію клі-

тин висівали в культуральні флакони площею 25 см

(“РА А ”, Австрія). Щільність посіву клітин станови-

ла 1×10

клітин на см

. Культивування клітин прово-

дили за методом, який забезпечує адгезію стромаль-

ної фракції до культурального пластику з наступним

видаленням фракції неадгезивних клітин. Як жи-

immune phenotype and almost do not contain the cells

with CD14, CD34 and CD45 epitopes. It character-

izes ChCC as the valuable biotechnological object,

which may be used in perspective therapies of differ-

ent pathologies [13, 16]. However, the task about cryo-

preservation of cultured chorion cells has been studied

insufficiently.

It should be noted that one of the important tasks of

cryobiology is optimization of cell culture cryopreser-

vation protocols. The cooling rates providing the integ-

rity of cultured cells, according to the reported data

[4, 9, 18] vary from very slow (0.5°C/min) to faster

(10°C/min) ones. The mixtures, comprising cryopro-

tectant, nutrient medium and additional components

were used as the solutions for cryopreservation of

freshly-isolated and cultured cells. The composition as

well as the percentage of each component of cryomix-

ture is specific for each cell culture. Herewith the

search of optimal conditions of cell lines' cryopreserva-

tion, including stem cells, generates a specific interest

not only for development of effective methods of

cryopreservation, but also study of cell cryosensitivity.

The research aim is to study the effect of low tem-

perature preservation on morpho-functional properties

of ChCC.

Materials and methods

Tissues for the research were derived from post-

abortive material of 6–12 weeks of gestation in the

cases when pregnancy was terminated at the absence

of either growth pathology or embryonal contamina-

tion (according to the agreement of scientific colabo-

ration between State Enterprise "Interdepartmental

Scientific Center of Cryobiology and Cryomedicine of

the National Academy of Sciences, Academy of Medi-

cal Sciences and Ministry of Health Care of Ukraine"

and Institute for Problems of Cryobiology and Cryome-

dicine of the National Academy of Sciences of

Ukraine). Tissues were used in experiments accord-

ing to the current legislation of Ukraine and donor's in-

formed consent.

Cell suspension of villous part of human chorion

tissue was derived with enzymatic disaggregation [1].

The derived cell suspension was seeded into cultural

flasks of 25 cm2 (PAA, Austria). Density of cell plat-

ing made 1×10

cells/cm

. Cell culturing was carried-

out by the method, providing adhesion of stromal frac-

tion to cultural plastic with further removal of fraction

of non-adhesive cells. The IMDM medium (Sigma,

USA) supplemented with antibiotic (50 U/ml of kan-

amycin) and 10% fetal calf serum was used as nutri-

ent medium. The nutrient medium was changed each

3 days. In the work the standard conditions of cultur-

ing at 37°C in 5% CO

atmosphere with Sanyo incu-

311

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

вильне середовище використовували середовище

ІMDM (“Sigma”, США) з додаванням розчину

антибіотиків (канаміцин 50 од/мл) і 10% ембріональ-

ної сироватки великої рогатої худоби. Живильне

середовище змінювали кожні 3 доби. У роботі були

використані стандартні умови культивування при

37°С в атмосфері 5% СО

з використанням інкуба-

тора Sanyo (Японія). У роботі досліджували ККХ

2-го пасажу. Оцінку їх морфологічних характерис-

тик проводили за допомогою світлової мікроскопії.

При досягненні 75% конфлюєнта в первинних куль-

турах проводили їх пасивування з наступним кріо-

консервуванням. Розчином кріоконсервування було

ростове середовище IMDM з додаванням 25%

ембріональної сироватки (ЕС; “НуСlone”, США)

та 10% ДМСО [3, 12]. Як контейнери для заморо-

жування використовували кріопробірки (“Nunc”,

США) об'ємом 1мл. Кріоконсервування здійснюва-

ли на програмному заморожувачі ЗПМ-1 (СКТБ з

ДВ ІПКіК НАНУ). Проведено порівняння 5 варіан-

тів заморожування ККХ, які за даними літератури

успішно застосовують для кріоконсервування клі-

тин культур різних типів [4, 13, 17]:

програма 1 – охолодження від 25 до –30°С зі

швидкістю 0,5°С/хв;

програма 2 – охолодження від 25 до –30°С зі

швидкістю 1°С/хв;

програма 3 – охолодження від 25 до –10°С зі

швидкістю 1°С/хв, з подальшим охолодженням до

–80°С зі швидкістю 10°С/хв;

програма 4 – охолодження від 25 до –5°С зі

швидкістю 1°С/хв, з наступним охолодженням до

–80°С зі швидкістю 10°С/хв;

програма 5 – охолодження від 25 до –6°С зі

швидкістю 1°С/хв, з наступним сидінгом, який

здійснювали шляхом додавання надмірної кількості

азоту до камери та охолодженням до –80°С зі

швидкістю 10°С/хв.

Останній етап усіх програм – занурення у рідкий

азот.

Усі кріоконсервовані зразки зберігалися в умо-

вах низькотемпературного банку на протязі 2-х тиж-

нів, відігрівали їх на водяній бані при 40°С до рідкої

фази. Досліджували деконсервовані клітини у вигля-

ді суспензії. Видалення кріопротектора проводили

за допомогою додавання розчину Хенкса, який де-

сятикратно перевищував об'єм суспензії з подаль-

шим центрифугуванням. Далі осад переводили до

середовища Хенкса об'ємом 1 мл при температурі

25°С на 30 хв. Контролем була не кріоконсервована

суспензія ККХ. В експериментальних зразках

визначали відсоток життєздатних клітин за допо-

могою тесту на виключення трипанового синього.

Для оцінки функціонального стану ККХ після кріо-

bator (Japan) were used. ChCC of the 2

passage

were studied in the work. Estimation of their morpho-

logical characteristics was carried-out with light mi-

croscopy. When reaching of 75% confluent in primary

cultures their passaging and further cryopreservation

were carried-out. Cryopreservation solution was the

growth medium IMDM with adding 25% fetal serum

(FS, HyClone, USA) and 10% DMSO [3, 12]. The

1 ml cryotubes (Nunc, USA) were the containers for

freezing. Cryopreservation was carried-out with pro-

grammable freezing device ZPM-1 (Special Design-

ing and Technical Bureau of IPC&C of NAS of

Ukraine). The following 5 variants of freezing ChCC

were compared, which according to literature data [4,

13, 17] were successfully used in cryopreservation of

variety of cultured cells:

program 1: cooling from 25 down to –30°C with

rate of 0.5°C/min;

program 2: cooling from 25 down to –30°C with

rate of 1°C/min;

program 3: cooling from 25 down to –10°C with

rate of 1°C/min with further cooling down to –80°C

with rate of 10°C/min;

program 4: cooling from 25 down to –5°C with rate

of 1°C/min with further cooling down to –80°C with

rate of 10°C/min;

program 5: cooling from 25 down to –6°C with rate

of 1°C/min with further crystal seeding by means of

adding the surplus nitrogen into the chamber, and cool-

ing down to –80°C with rate of 10°C/min.

The last stage of all the programs was plunging into

liquid nitrogen.

All the cryopreserved samples were stored under

low temperature bank conditions during 2 weeks, tha-

wed on water bath at 40°C to a liquid phase. Investi-

gations were carried-out in thawed cell suspensions.

Cryoprotectant was removed by adding ten-fold vol-

ume of Hanks’ solution and following centrifugation.

Then the sediment was tranfered into 1 ml Hanks’ so-

lution at 25°C for 30 min. The control was non-frozen-

thawed ChCC suspension. In the experimental sam-

ples the percentage of viable cells was assessed with

the trypan blue exclusion test. For estimation of func-

tional state of ChCC after cryopreservation the activ-

ity of mitochondria was investigated with staining by

potential-dependent fluorescent probe JC-1 (Molecu-

lar Probes, USA) [6, 12]. JC-1 staining of the control

and frozen-thawed cells was assessed by means of

inverted fluorescent microscope Olympus IX71 (Ja-

pan). The percentage of cells with green and orange

fluorescence was counted. Cell adhesion efficiency

was found during 24 hrs after starting the culture [2,

4]. Proliferation coefficient was estimated by counting

the cell number and further determination of its incre-

312

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

консервування вивчали активність мітохондрій з

використанням потенціал-залежного люмінесцент-

ного зонда JC-1 (“Molecular Probes”, США) [6, 12].

Забарвлення контрольних і кріоконсервованих

клітин люмінесцентним зондом JC-1 оцінювали за

допомогою флуоресцентного інвертованого мікро-

скопа Olympus IX71 (Японія). Підраховували відсо-

ток клітин, що люмінесціювали зеленим або пома-

ранчовим кольором. Ефективність адгезії клітин

визначали в динаміці на протязі 24 год після початку

культивування [2, 4]. Коефіцієнт проліферації визна-

чали шляхом підрахунку клітин для визначення при-

росту їх кількості у випадково обраних полях зору

в динаміці [1]. Для визначення здатності до дифе-

ренціювання кріоконсервованих клітин культури

хоріона змінювали живильне середовище (на 15-у

добу культивування) на середовище диференціюван-

ня в адипогенному напрямку, до складу якого

входили IMDM, 1% ЕС, 10

–7

M дексаметазону

(“Sigma”, США), 10

–9

M інсуліну (“Фармак”, Україна).

Подальше культивування проводили на протязі 3-х

тижнів зі зміною середовища 2 рази на тиждень.

Для підтвердження адипогенного диференціювання

in vitro клітини фарбували Sudan IV (“Fluka”,

Німеччина). Контролем спонтанного диференцію-

вання були клітини, культивовані у відсутності

спеціальних індукторів. За допомогою світлової мі-

кроскопії визначали позитивно профарбовані адипо-

генні клітини.

При статистичній обробці результатів викори-

стовували однофакторний дисперсійний аналіз і

t-критерій Стьюдента за допомогою програми MS

Exсel.

Результати та обговорення

Перший етап роботи – дослідження температу-

ри кристалізації розчину кріоконсервування для

попередження ймовірного переохолодження зразка

для даного типу контейнера і об'єму клітинної сус-

пензії. За отриманими термограмами була встанов-

лена температура кристалізації експериментальних

зразків (Т

кр

= –6,5 ± 0,2°С). Оскільки для кріокон-

сервування клітинних культур використовують го-

ловним чином 2- або 3-етапне заморожування, нами

були обрані дві програми 2-етапного та три –

3-етапного заморожування.

Показник життєздатності контрольної ККХ ста-

новив 92,3 ± 4,2%. Результати визначення життє-

здатності клітин після кріоконсервування за вище-

зазначеними програмами наведені на рис. 1.

Кількість життєздатних клітин при застосуванні

програми 1 знижувалася у 1,8, програми 2 – у 1,25,

програми 3 – у 1,5, програми 4 – у 1,3, програми

5 – у 1,2 рази відносно контрольних зразків. Таким

100

Контроль

Control

12345

Програми кріоконсервування

Cryopreservation programs

Життєздатність, %

Viability, %

Рис. 1. Життєздатність кріоконсервованих ККХ (n = 6, M ±

m); * – вірогідно відносно контролю (p < 0,05).

Fig. 1. Viability of cryopreserved ChCC (n = 6, M ± m); ∗ –

statistically significant differences comparing to the control

(p < 0.05).

ment in randomly selected fields in dynamics [1]. For

examining the ability of cryopreserved ChCC to dif-

ferentiate the nutrient medium was changed (by 15th

day of culture) for medium of differentiation into adi-

pogenic lineage, comprised IMDM, 1% FS, 10

–7

dexamethasone (Sigma, USA) and 10

–9

M insulin (Far-

mak, Ukraine). Further culturing was carried-out dur-

ing 3 weeks with changing the medium twice a week.

To confirm the in vitro adipogenic differentiation the

cells were stained with Sudan IV (Fluka, Germany).

As the control for spontaneous differentiation served

the cells cultured in the absence of special inducers.

The staining of the cells was assessed with light mi-

croscope.

The results were processed with one-way ANOVA

test and Student's t-criterion using MS Excel.

Results and discussion

The first stage of the work is the study of crystalli-

zation temperature of cryopreservation solution for

prevention of probable overcooling of the sample for

each type of container and volume of cell suspension.

Cryopreservation solution consisted of 10% DMSO,

25% FS in IMDM. According to the thermograms there

were established the crystallization temperature of

experimental samples (T

= –6.5 ± 0.2°C). We se-

lected two programs of two-step and three programs

of three-step freezing, whereas two-step or three-step

freezings are usually used for cryopreservation of cell

cultures.