Журнал - Проблемы криобиологии 2010 №3

Подождите немного. Документ загружается.

283

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

кортикоцитами (АК) [1]. Данный эффект также

наблюдали при инкубации суспензии АК в

гипертонических растворах NaCl [3, 5]. Поскольку

в процессе криоконсервирования клетки подвер-

гаются воздействию гиперосмотических раство-

ров солей и криопротекторов, это может спровоци-

ровать изменение формы и объема клеток, а также

повлиять на гормоносинтезирующую функцию АК.

Таким образом, дегидратация-регидратация кле-

ток в гипертонических растворах NaCl может быть

использована для моделирования влияния замора-

живания-отогрева на стероидогенный потенциал

АК [3].

Для стероидпродуцирующих клеток не свойст-

венно накопление стероидных гормонов, скорость

секреции которых целиком определяется механиз-

мами регуляции скорости биосинтеза [11]. Этапом,

лимитирующим скорость биосинтеза стероидных

гормонов, является превращение холестерина в

прегненoлон с участием фермента Р450scc [10].

Под действием адренокортикотропного гормона

запускается процесс переноса холестерина, кото-

рый находится в липидных каплях (ЛК), к

внутренней мембране митохондрий, где и происхо-

дят ферментативные превращения (рис. 1). Ключе-

вым этапом стероидогенеза является сближение

ЛК и митохондрий, при этом важную роль играют

компоненты цитоскелета, в частности актиновые

нити и микрофиламенты [6, 8, 9].

Вероятно, объемные изменения в АК, вызван-

ные факторами криоконсервирования, а именно

дегидратацией и регидратацией, влияют на струк-

турно-функциональные свойства цитоскелета, и

соответственно на расположение ЛК и транспорт

холестерина к месту синтеза гормонов. Это может

приводить к неспецифическому повышению ба-

зального стероидогенеза после криоконсервирова-

ния.

Цель работы – изучение влияния объемных

изменений АК, вызванных гипертоническими

растворами хлорида натрия и последующей регид-

ратацией, на пространственное расположение ЛК

в клетках.

Материалы и методы

Эксперименты проводили в соответствии с

"Общими принципами экспериментов на живот-

ных", одобренными III Национальным конгрессом

по биоэтике (Киев, 2007) и согласованными с поло-

жениями "Европейской Конвенции о защите позво-

ночных животных, используемых для эксперимен-

тальных и других научных целей" (Страсбург, 1985).

В работе использовали суспензию клеток АК

3-месячных половозрелых крыс, полученную фер-

ментативным способом. Для этого из извлеченных

надпочечников под микроскопом отделяли корко-

вый слой от медуллярного. Кортикальную ткань

Рис. 1. Схема синеза стероидных гормонов в клетках

надпочечников: ЛК− липидные капли; Э − эндосома;

АХАТ − ацетилкоэнзим-А-холестеринацилтрансфераза.

Fig. 1. Diagram of synthesis of hormones in adrenal gland

cells: LD – lipid droplets; E – endosomel, ACAT –

acetylcoenzyme-A-cholesterol acyltransferase.

preservation the cells are exposed to hyperosmotic

salines and cryoprotectant solutions, this may cause

the changes of cell shape and volume and affect hor-

mone-synthesizing function of AC as well. Thus, de-

hydration and re-hydration of cells in NaCl hypertonic

solutions may be used for modeling of freeze-thawing

effect on steroidogenic potential of AC [3].

For steroid-producing cells the accumulation of ster-

oid hormones, the secretion rate of which is absolutely

determined with the mechanisms of regulation of bio-

synthesis rate, is not characteristic [11]. The stage, lim-

iting biosynthesis rate of steroid hormones is a trans-

formation of cholesterol to pregnenolone mediated by

P450scc enzyme [10]. Adrenocorticotropic hormone

triggers the transfer of cholesterol, being situated in

lipid droplets (LD) towards an interior membrane of

284

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

надпочечников помещали в среду 199 (“Биолот”,

Россия) с ферментативным коктейлем, содержа-

щим коллагеназу (1 мг/мл), DNase (0,1 мг/мл), на

15 мин при 37°С и постоянном встряхивании, дис-

пергировали с помощью пастеровской пипетки и

трижды отмывали от ферментативного раствора

в среде 199 с 0,2%-м бычьим сывороточным аль-

бумином путем центрифугирования в течение 3 мин

при 1500 об/мин. Жизнеспособность определяли

методом окрашивания клеток трипановым синим,

в среднем в экспериментах она составила 75–80%.

Для изучения объема внутриклеточного прост-

ранства, в пределах которого располагаются ЛК,

использовали флуоресцентный краситель нильский

красный [7] с длиной волны возбуждения 488 нм,

эмиссии – 530 нм (желто-зеленая область) и 590 нм

(красная область). Нильский красный является ли-

пидным зондом и флуоресцирует в желто-зеленой

области, когда растворен в ЛК, и красной области,

связываясь с липидами цитоплазмы и мембраны.

Для выявления мертвых клеток с помощью флуо-

ресцентной микроскопии использовали пропидий

йодид. Окрашенные (мертвые) клетки исключили

из анализа объемных изменений.

Клетки окрашивали нильским красным

(10 мкг/мл) 15 мин при 37°С, отмывали, после чего

окрашивали пропидий йодидом.

Суспензию АК помещали в 96-луночные план-

шеты (“Sarstedt”, Германия) с подложкой для при-

крепления клеток. Клетки инкубировали в течение

1,5 ч при 37°С и 5%-м содержании СО

в атмосфе-

ре. В эксперименте применяли растворы NaCl с

концентрациями 0,5, 0,75 и 1 М. При микроскопи-

ческих исследованиях использовали флуоресцент-

ный микроскоп Axio Observer Z1 (“Carl Zeiss”, Гер-

мания). Клетки фотографировали при дегидратации

и регидратации в фиксированных полях (для отсле-

живания изменений в одних и тех же клетках).

Изменение клеточного объема и объема, занимае-

мого ЛК, измеряли с помощью приложения “Axio

Vision Rel. 4.7” (“Carl Zeiss”, Германия). Осмоти-

чески неактивный объем определяли по методу [4].

Статистический анализ полученных данных

проводили с помощью t-теста Стьюдента и прило-

жения Microsoft Excel. При р < 0,05 отличия счита-

ли достоверными.

Результаты и обсуждение

Окрашенные нильским красным ЛК были четко

различимы внутри АК в желто-красном спектре

флуоресценции (рис. 2).

Поскольку популяция клеток гетерогенна по

размеру, то, построив кривую распределения Гаус-

са, мы определили, что диаметр основной части

клеток составляет 13–18,5 мкм (рис. 3). Клетки

данного размера использовали для дальнейшего

анализа.

mitochondria, where enzymatic transformations take

place (Fig. 1). The essential stage of steroidogenesis

is the approaching of LD to mitochondria, herewith

the components of cytoskeleton play an important role,

particularly, actin filaments and microfilaments [6, 8, 9].

Seemingly, volumetric changes in AC due to cryo-

preservation factors such as dehydration and re-hy-

dration change structural-functional properties of cy-

toskeleton, and correspondingly affect the location of

lipid droplets and cholesterol transport to the site of

hormone synthesis. It may result in non-specific in-

crease of basal steroidogenesis after cryopreservation.

The research aim is to study the effect of volumet-

ric changes of AC, induced by NaCl hypertonic solu-

tions and further re-hydration on spatial arrangement

of LD in the cells.

Materials and methods

The experiments were performed according to the

"General ethical principles of experiments in animals",

approved by the 3

National Congress on Bioethics

(Kiev, 2010) and agreed with the statements of the

"European Convention for the Protection of Vertebrate

Animals Used for Experimental and Other Scientific

Purposes" (Strasbourg, 1985).

In the work the AC cell suspension of 3 month-old

mature rats, isolated by enzyme method was used.

Herewith a cortical layer was isolated from medullar

one from isolated adrenal glands under microscopic

control. Adrenal cortical tissue was placed into me-

dium 199 (Biolot, Russia) supplemented with enzyme

cocktail with collagenase (1 mg/ml) and DNase

(0,1 mg/ml) for 15 min at 37°C and constant shaking,

then dispersed with Pasteur pipette and thrice washed-

out from enzyme solution by medium 199 supplemented

with 0.2% bovine serum albumin using centrifugation

for 3 min at 1500 rpm. Viability was examined by cell

staining with trypan blue, in average it made 75–80%.

For studying the volume of intracellular space, within

the range of which the LD located the Nile red fluo-

rescent dye was used [7]; the dye has excitation maxi-

mum of 488 nm, and two emission maxima of 530 nm

(yellow-green zone) and 590 nm (red zone). Nile red

is a lipid probe and fluoresces in yellow-green zone,

when dissolved in LD and red zone, when bound with

lipids of cytoplasm and membrane. Propidium iodide

was used for revealing dead cells under fluorescent

microscopy control. The stained (dead) cells were ex-

cluded from the further analysis of volumetric changes.

The cells were stained with Nile red (10 µg/ml) for

15 min at 37°C, washed-out, thereafter stained with

propidium iodide.

AC suspension was placed into the 96 well plates

(Sarstedt, Germany) with the substrate for cell adhe-

sion. The cells were incubated for 1.5 hrs at 37°C and

under 5% CO

atmosphere. 0.5, 0.75 and 1 M NaCl

solutions were used in the experiment. During micro-

285

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

Полученную суспензию АК подвергали воз-

действию гипертонических растворов 0,5; 0,75 и

1 М NaCl. Минимальный объем АК в растворе

0,5 М NaCl составлял 62,2, в 0,75 М – 60,9, а в 1 М –

57,6% от первоначального. Время достижения

минимального объема для раствора с концентра-

цией 0,5 М достигало 80 ± 3 с; 0,75 М – 19 ± 2 с;

1 М – 13 ± 2 с. Объем, занимаемый ЛК, уменьшал-

ся до 65,7; 64 и 62% в соответствующих гипертони-

ческих растворах. Таким образом, тенденция изме-

нения объема клеток и объема, занимаемого ЛК,

в гипертоническом ряду была одинакова (рис. 4, а).

Через 20 мин после возвращения клеток в изото-

ническую среду из раствора 0,5 М NaCl объем

клеток и объем, занимаемый ЛК, восстанавли-

вались до 85,8% от первоначального. При переносе

АК из 0,75М раствора NaCl в изотонию объем

клеток составил 86,4%, а объем, занимаемый

ЛК, – 80,7%; при переносе из 1М раствора NaCl

объем клеток составил 85%, а объем, занимаемый

ЛК, – 77,6% от первоначального (рис. 4, б).

Таким образом, восстановление объема, зани-

маемого ЛК, запаздывало по отношению к объему

клеток при регидратации из гипертонических

растворов NaCl с концентрациями 0,75 и 1 М.

Ранее было показано [3], что при инкубации сус-

пензии АК в растворе 0,8 М NaCl происходит повы-

шение уровня базальной секреции стероидных гор-

монов. При анализе изменения клеточного объема

и объема, занимаемого ЛК (при наблюдении за

единичной клеткой), отмечено, что при регидрата-

ции АК в течение определенного времени объем

клетки восстанавливается быстрее по сравнению

с восстановлением объема, занимаемого ЛК.

Предположительно пространственное сближение

ЛК и митохондрий (место синтеза стероидных

гормонов) при дегидратации и замедленная реакция

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Рис. 3. Распределение диаметров АК.

Fig. 3. Distribution of AC diameters.

Диаметр клеток, мкм

Cell diameter, µm

Количество клеток

Cell number

Рис. 2. Окрашивание суспензии АК нильским красным:

флуоресцентная микроскопия(а); в проходящем свете

(б). Ок. 10, об. 40.

Fig. 2. Staining of AC suspension with Nile red: fluorescent

microscopy (a); in transmitted light (b); oc. 10, ob. 40

scopic studies the Observer Z1 fluorescence micro-

scope (Carl Zeiss, Germany) was used. The cells were

imaged in the fixed visual field (to trace the single cells)

under re-hydration and dehydration. Volumetric chan-

ges in cells and space, occupied with LD were meas-

ured with AxioVision Rel.4.7 (Carl Zeiss, Germany).

Osmotically inactive volume was established by the

method [4].

Statistical processing of the obtained results was

carried-out with Student's t-criterion and Microsoft

Excel software. The differences were significant at

p < 0.05.

Results and discussion

When staining with Nile red the LD in AC were

clearly visualized in yellow-red bandwidth (Fig. 2).

The cell population is size heterogenic, and after

plotting the Gauss distribution curve we marked the

diameters of main part of cells (13–18.5 mm). The cells

of these sizes were used for further analysis (Fig. 3).

The derived suspension of AC was exposed to 0.5,

0.75 and 1 M NaCl hypertonic solutions. Minimum

volume of AC in 0.5 M NaCl solution made 62.2, in

0.75 M did 60.9, and in 1 M did 57.6% of the initial

volume. Time of reaching minimum volume in 0.5 M

solution was 80 ± 3 sec; in 0.75 M it was 19 ± 2 sec;

and in 1 M it was 13 ± 2 sec. The space, occupied with

LD shrank down to 65.7; 64; 62% in corresponding

hypertonic solutions. Thus, the tendency of changes in

cell volume and the volume of the space, occupied with

LD in hypertonic series was similar (Fig. 4, a).

In 20 min after returning the cells into isotonic me-

dium from 0.5 M NaCl solution the cell volume and the

volume of the space, occupied with LD recovered up

to 85.8% of the initial one. When transferring the AC

б ba a

286

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

восстановления их первоначально занимаемого

объема при регидратации, могут приводить к не-

специфической активации базальной секреции

гормонов.

Выводы

1. Инкубация АК в гипертонических растворах

NaCl влияет на объем клетки и объем, занимае-

мый ЛК.

2. При регидратации АК в течение 20 мин из

растворов NaCl с концентрациями 0,5; 0,75 и 1 М

объем клеток в среднем достигает 85% от исход-

ного.

3. При регидратации АК в течение 20 мин из

раствора NaCl с концентрацией 0,5 М объем, зани-

маемый ЛК, восстанавливается в среднем до 85%

от первоначального, тогда как после инкубации в

растворах 0,75 и 1 М NaCl восстановление запаз-

дывает (80 и 77% от исходного соответственно).

4. Уменьшение объема, занимаемого ЛК, после

дегидратации АК из растворов 0,75 и 1 М NaCl,

возможно, оказывает неспецифический стимули-

рующий эффект на базальный синтез стероидных

гормонов.

0,5 0,75 1

Концентрация NaCl, М

NaCl concentration, M

Относительнный объем, %

Relative volume, %

Концентрация NaCl, М

NaCl concentration, M

Относительнный объем, %

Relative volume, %

Рис. 4. Влияние дегидратации (а) и регидратации (б) на объемные изменение клеток ( ) и объема,занимаемого ЛК

( ); * – отличия достоверны относительно объема, занимаемого ЛК при тех же условиях (р < 0,05).

Fig. 4. Effect of dehydration (a) and re-hydration (b) on volumetric changes of cells ( ) and the volume, occupied with LD

( ); * – the differences are significant relative to volume, occupied with LD under the same conditions (p < 0.05).

from 0.75 M NaCl solution into isotonic conditions the

cell volume made 86.4%, and the volume of the space,

occupied with LD did 80.7%; when transferring AC

from 1 M NaCl solution the cell volume made 85%,

and the volume of the space, occupied with LD did

77.6% of the initial one (Fig. 4, b).

Thus, volumetric recovery of the space, occupied

with LD delayed in respect of cell volume under re-

hydration after reversion from NaCl 0.75 and 1 M

hypertonic solutions.

It was shown earlier [3] that during incubation of

AC suspension in 0.8 M NaCl solution the increase of

basal secretion level of steroid hormones was observed.

When analyzing the data about volumetric changes for

cells and the space occupied with LD there was noted

that under re-hydration of AC during certain time the

cell volume recovered faster if compared with the

space, occupied with LD. Spatial approaching of LD

to mitochondria (synthesis site of steroid hormones)

during dehydration and slow reversion of their spatial

distribution during re-hydration may likely lead to a non-

specific activation of basal secretion of hormones.

Conclusions

1. Incubation of AC in NaCl hypertonic solutions af-

fects the volume of cells and the space occupied by LD.

2. During re-hydration of AC after reversion from

NaCl solutions with the concentrations of 0.5; 0.75 and

1 M the cell volume in average reaches 85% of initial

one in 20 min.

3. During re-hydration of AC after revesion from

NaCl solution with the concentration of 0.5 M the vol-

Литература

Бондаренко Т.П., Самченко И.И., Божок Г.А., Алабедаль-

карим Н.М. Гормоносекретирующая способность криокон-

сервированной органной культуры надпочечников

новорожденных поросят in vivo и in vitro // Проблеми

сучасної медичної науки та освіти.– 2002.– №3.– С. 35–37.

287

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

Грищенко В.І., Бондаренко Т.П., Легач, Є.І. та ін.

Заготівля, кріоконсервування та клінічне застосування

органної культури наднирників новонароджених поросят

в лікуванні недостатності наднирників: Метод. рекомен-

дації.– Харків, 2000.– 12 с.

Дудецкая Г.В., Устиченко В.Д. Регидратированные адре-

нокортикоциты как модель криоконсервированных сте-

роидпродуцирующих клеток // Проблемы криобиологии.–

2006.– Т. 16, №4.– С. 432.

Чернобай Н.А., Коваленко И.Ф., Божок Г.А. и др. Осмо-

тическое поведение клеток интерстиция тестисов в ги-

пертонических растворах NaCl и ПЭО-400 // Проблемы

криобиологии.– 2010.– Т. 20, №1.– С.83–87.

Устиченко В.Д. Морфофункціональні характеристики

клітин надниркових залоз при дії різних режимів замо-

рожування: Автореф. дис. … канд. біол. наук.– Харків,

2006.– 20 с.

Cote M., Payet M. D.,Gallo-Payet N. Association of s-subunit

of the Gs protein with microfilaments and microtubules:

implication during adrenocorticotropin stimulation in rat adrenal

glomerulosa cells // Endocrinology.– 1997.– Vol. 138, N1.–

P. 69–78.

Greenspan P., Mayer E.P. Nile red: a selective fluorescent

stain for intracellular lipid droplets // J. Cell Biol.– 1985.–

Vol. 100, N3.– P. 965–973.

Hall P.F., Almahbobi G. Roles of microfilaments and interme-

diate filaments in adrenal steroidogenesis // Microsc. Res.

Tech.– 1997.– Vol. 36, N6.– P. 463–479.

Hall P.F., Charpponier C. The role of microfilaments in the

response of adrenal tumor cells to adrenocorticotropic

hormone // J. Biol. Chem.– 1979.– Vol. 254, N18.– P. 9080–

9084.

Jefcoate C. High-flux mitochondrial cholesterol trafficking, a

specialized function of the adrenal cortex // J. Clin. Invest.–

2002.– Vol. 110, N7.– P. 881–890.

Kacsoh B. Endocrine physiology.– New York: McGraw-Hill,

2000.– 741 p.

Поступила 17.08.2010

Рецензент И.В. Белочкина

10.

11.

ume of the space occupied by LD, recovers in aver-

age up to 85% of the initial value during 20 min, whilst

after incubation in 0.75 and 1 M NaCl solutions the

certain delay is observed (80 and 77%, correspond-

ingly).

4. Shrinkage of the space occupied by LD after

dehydration of AC in 0.75 and 1M NaCl solutions prob-

ably renders non-specific stimulating effect on basal

synthesis of steroid hormones.

References

Bondarenko T.P., Samchenko I.I., Bozhok G.A., Alabedalka-

rim N.M. Hormone-secreting ability of cryopreserved organ

culture of adrenal glands of newly born piglets in vivo and in

vitro // Problemy Suchasnoi Medychnoi Nauky ta Osvity.–

2002.– N3.– P. 35–37.

Grischenko V.I. Bondarenko T.P., Legach E.I. et al. Procu-

rement, cryopreservation and clinical use of organ culture of

adrenal glands of newly born piglets in treatment of deficiency

of adrenal glands: Methodical recommendations.– Kharkiv,

2000. – 12 p.

Dudetskaya G.V., Ustichenko V.D. Rehydrated adrenocortico-

cytes as model of cryopreserved steroid-producing cells //

Problems of Cryobiology.– 2006.– Vol. 16, N4.– P. 432.

Chernobay N.A., Kovalenko I.F., Bozhok G.A. et al. Osmotic

behavior of testes interstitium cells in hypertonic solutions of

NaCl and PEO-400 // Problems of Cryobiology.– 2010.– Vol. 20,

N1.– P. 83–87.

Ustichenko V.D. Morphofunctional characterstics of cells of

adrenal glands under the effect of different freezing regimens:

Author's abstract of the thesis of cand. of biol. sciences.–

Kharkiv, 2006.– 20 p.

Cote M., Payet M. D.,Gallo-Payet N. Association of s-subunit

of the Gs protein with microfilaments and microtubules:

implication during adrenocorticotropin stimulation in rat adrenal

glomerulosa cells // Endocrinology.– 1997.– Vol. 138, N1.–

P. 69–78.

Greenspan P., Mayer E.P. Nile red: a selective fluorescent

stain for intracellular lipid droplets // J. Cell Biol.– 1985.–

Vol. 100, N3.– P. 965–973.

Hall P.F., Almahbobi G. Roles of microfilaments and interme-

diate filaments in adrenal steroidogenesis // Microsc. Res.

Tech.– 1997.– Vol. 36, N6.– P. 463–479.

Hall P.F., Charpponier C. The role of microfilaments in the

response of adrenal tumor cells to adrenocorticotropic

hormone // J. Biol. Chem.– 1979.– Vol. 254, N18.– P. 9080–

9084.

Jefcoate C. High-flux mitochondrial cholesterol trafficking, a

specialized function of the adrenal cortex // J. Clin. Invest.–

2002.– Vol. 110, N7.– P. 881–890.

Kacsoh B. Endocrine physiology.– New York: McGraw-Hill,

2000.– 741 p.

Accepted in 17.08.2010

10.

11.

288

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38

(057) 373-31-41, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:

sv.rosanova@gmail.com

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

3141, fax: +380 57 373 3084, e-mail: sv.rosanova@gmail.com

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 611.013.85:612.015.21].086.13

С.Л. РОЗАНОВА*, Е.И. НАУМЕНКО, Е.Д. РОЗАНОВА, О.А. НАРДИД

Изменение антиоксидантных свойств экстрактов

плаценты человека после замораживания

UDC 611.013.85:612.015.21].086.13

S.L. ROZANOVA*, E.I. NAUMENKO, E.D. ROZANOVA, O.A. NARDID

Change of Antioxidative Properties of Human

Placental Extracts after Freezing

Представлены экспериментальные данные, полученные при сравнительной оценке влияния различных режимов

замораживания-оттаивания на антиоксидантную активность экстрактов плаценты человека, определяемую по способности

восстанавливать трехвалентное железо и ABTS

-радикал, хелатировать ионы железа, удалять перекись водорода, а также по

содержанию фенольных соединений. Показано, что медленное замораживание экстрактов до –20°С приводит к снижению их

антиоксидантной активности, в то время как быстрое замораживание до –196°С – к увеличению этой активности за счет

конформационных изменений белковых антиоксидантов.

Ключевые слова: замораживание-оттаивание, экстракт плаценты человека, антиоксидантная активность.

Представлено експериментальні дані, отримані при порівняльній оцінці впливу різних режимів заморожування-відігріву

на антиоксидантну активність екстрактів плаценти людини, яку визначали за здатністю відновлювати тривалентне залізо та

ABTS

-радикал, хелатувати іони заліза, видаляти перекис водню та за вмістом фенольних сполук. Показано, що повільне

заморожування екстрактів до –20°С призводить до зниження їх антиоксидантної активності, у той час як швидке заморожування

до –196°С – до збільшення цієї активності за рахунок конформаційних змін білкових антиоксидантів.

Ключові слова: заморожування-відтавання, екстракт плаценти людини, антиоксидантна активність.

The experimental data, obtained under comparative evaluation of different freeze-thawing protocols’ influence on human placenta

extract antioxidant activity, estimated by capacity to reduce the ferric iron and ABTS

radical, to chelate ferrous ions, to scavenge

hydrogen peroxide and also by phenolic compound content, have been presented. Slow freezing of the extracts down to –20°С has been

shown to cause the lowering of its activity, while rapid freezing down to –196°С increases the activity due to protein antioxidants‘

conformational changes.

Key words: freeze-thawing, human placenta extract, antioxidant activity.

Известно, что обязательным условием нор-

мальной жизнедеятельности биологических сис-

тем является генерация активизированных кисло-

родных метаболитов – прооксидантов, к которым

относятся супероксидный анион-радикал (О

–

гидроксильный (

ОН), алкоксильный (RO

) и пе-

роксильный (ROO

) радикалы, перекись водорода

(Н

), синглетный кислород (

), гипохлорная

кислота (HOCl), окись азота (

NO), пероксинитрит

(ONOО

–

). Эти соединения, получившие название

"активные формы кислорода" (АФК), обладают

широким спектром действия. С одной стороны, не-

которые из них принимают участие в процессах

сигнальной трансдукции и регуляции ряда важных

функций организма. С другой стороны, в силу своей

высокой химической активности АФК обладают

ярко выраженным гено- и цитотоксическим дейст-

вием и поэтому представляют серьезную опас-

ность для организма [1, 3, 5].

Постоянное образование прооксидантов в жи-

вых организмах уравновешивается за счет их дез-

Mandatory condition for normal vital activity of bio-

logical systems is known to be the generating the acti-

vated oxygen metabolites, the prooxidants, which com-

prise anion-radical (О

–

), hydroxyl (

OH), alcoxyl (RO

)

and peroxyl (ROO

) radicals, hydrogen peroxide (H

singlet oxygen (

), hypochlorus acid (HOCl), nitro-

gen oxide (

NO), peroxynitrite (ONOO

–

). These com-

pounds defined as "reactive oxygen species" (ROS)

are pluropotential ones. On the one hand, some of them

participate in the processes of signal transduction and

regulation of some important functions of an organ-

ism. On the other hand, due to their high chemical ac-

tivity the ROS have manifested gene- and cytotoxic

effect and therefore they are of serious danger for an

organism [1, 3, 5].

The constant formation of pro-oxidants in living or-

ganisms is balanced due to their deactivation with anti-

oxidants (AO), which can interfere with oxidative proc-

esses by means of removing free radicals, chelating of

transition metal ions, scavenging the reactive oxygen

species. Under the effect of different endo- and exo-

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

289

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

активации антиоксидантами (АО), которые могут

препятствовать окислительным процессам посред-

ством удаления свободных радикалов, хелатиро-

вания ионов металлов переменной валентности,

инактивации активных форм кислорода. Под дей-

ствием различных эндо- и экзогенных факторов

баланс между антиоксидантной системой и АФК

в клетках может нарушаться вследствие снижения

уровня АО либо гиперпродукции АФК. Состояние

резко нарушенного окислительно-восстановитель-

ного статуса клеток, когда АФК не могут адекват-

но блокироваться АО, называют окислительным

стрессом. Обладая исключительно высокой хими-

ческой активностью, прооксиданты могут неспеци-

фически взаимодействовать с любыми молекула-

ми, находящимися в радиусе их чрезвычайно

короткого диффузионного пробега, и вызывать

окислительную модификацию нуклеиновых кислот,

белков, углеводов, индуцировать перекисное окис-

ление липидов (ПОЛ) в мембранах, увеличивать

внутриклеточный уровень кальция, активировать

протеазы, нуклеазы, фосфолипазы. В итоге эти на-

рушения приводят к гибели клеток либо к их транс-

формации, включая злокачественную, а также раз-

витию патологических процессов. Таким образом,

в результате нарушения равновесия между про-

оксидантной и антиоксидантной системами разви-

вается окислительный стресс и, как следствие,

возникают и накапливаются окислительные по-

вреждения, что инициирует воспалительные про-

цессы, старение, а также такие заболевания, как

рак, атеросклероз, бронхо-легочные заболевания

и расстройства нервной системы (например, бо-

лезнь Альцгеймера) [1, 3, 5, 22, 25]. Поэтому одной

из основных характеристик многих фармацев-

тических средств является их антиоксидантная

активность.

Экстракты плаценты человека (ЭПЧ), благода-

ря наличию в них большого количества биологи-

чески активных веществ, обладают таким важным

свойством, как антиоксидантная активность. Этот

факт подтверждается экспериментальными дан-

ными, полученными различными методами оценки

антиоксидантной активности. Показано, что ЭПЧ

способны ингибировать гидроксильный и супер-

оксидный радикалы, окись азота, а также восста-

навливать трехвалентное железо, предотвращать

ПОЛ. Такие свойства экстрактов позволяют при-

менять их для лечения заболеваний, характе-

ризующихся окислительным стрессом [19, 20, 24].

Для увеличения срока хранения препаратов в

клинической практике широко применяют низкие

температуры. Однако влияние процессов замора-

живания-оттаивания на свойства гетерогенных

композиций макромолекул, обладающих антиокси-

дантными свойствами, в частности ЭПЧ, в настоя-

щее время еще недостаточно изучено. Известно,

genic factors the balance between anti-oxidative sys-

tem and ROS in cells may be impaired either because

of AO reduced level or ROS hyperproduction. The

state of sharply disordered redox status of cells, when

ROS can not be adequately inactivated by AO, is called

oxidative stress. Possessing quite a high chemical ac-

tivity the pro-oxidants may non-specifically attack any

molecules being within the radius of their quite short

diffusion distance and cause oxidative modification of

nucleic acids, proteins, carbohydrates, induce lipid

peroxidation (LPO) in membranes, increase the intra-

cellular level of calcium, activate proteases, nucleases,

phospholipases. Finally, these disturbances lead to cell

death or transformation, including malignant one, as

well as development of pathological processes. Thus,

the disturbed balance between pro-oxidant and anti-

oxidant systems causes the oxidative stress and as the

consequence the appearance and accumulation of

oxidative injuries, leading to inflammatory processes,

ageing as well as to cancer, atherosclerosis, broncho-

pulmonary diseases and nervous system disorders

(e. g. Alzheimer disease) [1, 3, 5, 22, 25]. Therefore

one of the main characteristics of many pharmaceuti-

cals is their antioxidant activity.

Human placental extracts (HPE) due to the high

concentration of bioactive substances, possess such

an important feature as antioxidant activity. This fact

is confirmed with the experimental data, obtained with

different methods of antioxidative activity assessment.

HPE have being demonstrated to inhibit hydroxyl and

superoxide radicals, nitrogen oxide, reduce ferric iron,

to prevent LPO. These properties of extracts allow

their application for treatment of the diseases charac-

terized by oxidative stress [19, 20, 24].

Low temperatures are widely applied in clinical

practice in order to increase the shelf life of medica-

tions. However, the effect of the freeze-thawing proc-

esses on the properties of heterogenous macromolecu-

lar compositions, possessing antioxidant properties, in

particular, HPE, nowadays has not been fully investi-

gated. It is known that freeze-thawing may contribute

to the formation and accumulation of free radicals with

their following inactivation with antioxidants, as well

as lead to the conformational changes and aggregation

of biological macromolecules, possessing antioxidant

properties [2, 4, 6, 7, 9, 10, 13, 18]. Thus we suppose

that freeze-thawing could change the HPE antioxidant

activity.

The research aim was the investigation of the in-

fluence of different freezing protocols on antioxidant

properties of human placenta aqueous-saline extracts.

Materials and methods

In the research there were used 8 placentas, de-

rived from the parturients with their informed consent

(38 weeks' gestation term). Aqueous-saline placental

extracts were obtained from homogenate of placenta

290

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

что замораживание-оттаивание может способство-

вать образованию и накоплению свободных ради-

калов с их последующей инактивацией антиокси-

дантами, а также приводить к изменению конфор-

мации и агрегации биологических макромолекул,

обладающих антиоксидантными свойствами [2, 4,

6, 7, 9, 10, 13, 18]. Таким образом, мы предпола-

гаем, что в процессе замораживания-оттаивания

может изменяться антиоксидантная активность

ЭПЧ.

Цель работы – изучение влияния различных

режимов замораживания на антиоксидантные

свойства водно-солевых экстрактов плаценты че-

ловека.

Материалы и методы

В работе использовали 8 плацент, полученных

от рожениц с их информированного согласия (срок

беременности 38 недель). Водно-солевые экстрак-

ты плаценты получали из гомогената ткани, осво-

божденной от соединительной ткани, путем 12-ча-

совой экспозиции с физиологическим раствором

при 4°С. Экстракты замораживали до –20 и –196°С

со скоростями 1–2 и 300 градусов/мин соответ-

ственно. Отогрев осуществляли на водяной бане

при 20°С.Свежевыделенные и подвергнутые замо-

раживанию-оттаиванию экстракты разделяли ме-

тодом гель-хроматографии на колонке с сефадек-

сом G-200.

Восстанавливающую активность свежевыде-

ленных и подвергнутых замораживанию-оттаи-

ванию экстрактов, а также их фракций оценивали

по методу Oyaizu [15]. Способность экстрактов

плаценты восстанавливать железо-феррициани-

довый комплекс Берлинской лазури определяли по

поглощению на длине волны 700 нм. Для этого

0,2 мл образца смешивали с фосфатным буфером

(0,5 мл; 0,2 M; pH 6,6) и феррицианидом калия

Fe(CN)

; 0,5 мл; 1%). Полученную смесь вы-

держивали при 50°С в течение 20 мин, затем к

смеси добавляли 0,5 мл трихлоруксусной кислоты

(30%) и фильтровали. К 0,5 мл полученного

фильтрата добавляли FeCl

(0,1 мл; 0,1%). Спектры

поглощения записывали на длине волны 700 нм на

спектрофотометре Pye Unicam SP8000 (Велико-

британия). Увеличение поглощения реакционной

смеси свидетельствовало об увеличении способ-

ности образцов восстанавливать трехвалентное

железо (Fe

→Fe

). В качестве контроля исполь-

зовали аскорбиновую кислоту [15].

Спектрофотометрические исследования анти-

радикальной активности экстрактов и фракций про-

водили по методу Re et al. [17]. Катионный радикал

ABTS

получали путем реакции между 7 мМ ABTS

в H

O и 2,45 мМ персульфатом калия, хранивши-

tissues separated from connective tissue by 12 hrs ex-

posure in physiological solution at 4°C. The extracts

were frozen down to –20 and –196°C with the rates

of 1–2 and 300 grad/min, correspondingly. Thawing

was performed in a water bath at 20°C. Freshly iso-

lated and frozen-thawed extracts were separated by

the method of gel chromatography using the column

with sephadex G-200.

Reducing activity of freshly isolated and frozen-

thawed extracts as well as their fractions were asses-

sed by the method of Oyaizu [15]. The ability of placen-

tal extracts to reduce ferric-ferricyanide complex of

Prussian blue was determined by recording the absorb-

ance at 700 nm. To do this, 0.2 ml of the samples were

mixed with phosphate buffer (0.5 ml; 0.2 M; pH 6.6)

and potassium ferricyanide [K

Fe(CN)

] (0.5 M; 1%).

The resulted mixture was incubated at 50°C for 20 min,

then 0.5 ml of trichloracetic acid (30%) were added

and the mixture was filtrated. 0.5 ml of the obtained

filtrate was mixed with FeCl

(0.1 ml; 0.1%). The ab-

sorbance spectra were recorded at 700 nm using spec-

trophotometer Pye Unicam SP8000 (UK). The rise in

absorption of reaction mixture testified to the increased

ability of the samples to reduce ferric iron (Fe

→

). Ascorbate was used as the control [15].

Spectrophotometrical studies of anti-radical activ-

ity of the extracts and fractions were carried-out ac-

cording to the method of Re et al. [17]. ABTS

cation

radical was obtained by means of the reaction between

7 mM ABTS in H

O and 2.45 mM potassium persul-

fate, stored for 12 hrs in the darkness at room tem-

perature. Initial substance (0.1 ml) was diluted with

3 ml of distilled water. ABTS

(0.1 ml) was added to

the experimental samples and the kinetics of ABTS

radical solution decolorization was recorded. Results

were presented as a percentage changes in optical den-

sity of initial ABTS

solution.

Chelating activity of the experimental samples was

assessed on the method of Dinis et al. [8]. 2 mM FeCl

solution (0.05 ml) was added to 0.2 ml of the experi-

mental sample. The reaction was initiated by the additi-

on of 5 mM ferrozine. The mixture was shaken vigor-

ously and left at room temperature for 10–15 min. After

the mixture had reached equilibrium the absorbance of

the samples was measured spectrophotometrically at

526 nm. The results were represented as the percent-

age of inhibition of ferrozine-Fe

complex formation :

Bound Fe

(%) = [(A

control

– A

sample

)/A

control

]×100,

where A

control

– absorbance of ferrozine-Fe

complex;

sample

– absorbance of ferrozine-Fe

complex in the

presence of the studied sample.

The ability of HPE to neutralize H

was deter-

mined by hydrogen peroxide capacity to form the sta-

291

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

мися 12 ч в темноте при комнатной температуре.

Исходное вещество (0,1 мл) разводили 3 мл дис-

тиллированной воды. ABTS

(0,1 мл) добавляли к

исследуемым образцам и регистрировали кинети-

ку обесцвечивания раствора ABTS

-радикала. Ре-

зультаты представляли в процентах изменения

оптической плотности исходного раствора ABTS

Хелатирующую активность исследуемых об-

разцов оценивали по методу Dinis et al. [8]. К 0,2 мл

исследуемого образца добавляли раствор 2 мМ

FeCl

(0,05 мл). Реакцию инициировали добав-

лением 5 мМ феррозина. Смесь хорошо встря-

хивали и оставляли при комнатной температуре на

10–15 мин. После достижения в смеси равновесия

спектрофотометрически измеряли поглощение об-

разцов на длине волны 562 нм. Результаты пред-

ставляли как процент ингибирования формирования

феррозин-Fe

– комплекса:

Связанный Fe

(%) = [(A

control

– A

sample

)/A

control

] ×100,

где A

control

– поглощение феррозин-Fe

– комплек-

са; A

sample

– поглощение феррозин-Fe

– комплекса

в присутствии исследуемого образца.

Способность ЭПЧ удалять H

определяли по

способности перекиси водорода образовывать с

молибдатом аммония стойкий окрашенный комп-

лекс. Реакцию запускали добавлением 0,1 мл об-

разца к 2 мл раствора перекиси водорода (0,03%)

и останавливали через 10 мин добавлением 1 мл

молибдата аммония (4%). Интенсивность окраски

измеряли на спектрофотометре на длине волны

410 нм против контрольной пробы, в которой вмес-

то исследуемого образца была вода [11]. Посколь-

ку перекись водорода удаляется преимущественно

с помощью ферментов, полученные результаты

относили к концентрации белка в образцах, которую

определяли спектрофотометрически.

Общее содержание фенолов в образцах оцени-

вали с использованием реагента Фолина (Folin-

Ciocalteu, FC) по методу Singleton и Rossi [21] с

незначительными изменениями. Исследуемый

образец (0,1 мл) смешивали с 1,5 мл FC-реагента,

предварительно разведенного 1:10 дистиллиро-

ванной водой. Полученную смесь выдерживали

5 мин при температуре 22°С, затем добавляли

раствор Na

(0,06%). После 30-минутной инку-

бации при 22°C измеряли поглощение на длине

волны 725 нм.

Статистическую обработку полученных резуль-

татов проводили с использованием программного

обеспечения “Origin 6.1”. Значимость различий ре-

зультатов в свежевыделенных ЭПЧ и после замо-

раживания-оттаивания оценивали на основании пар-

ного t-теста. Уровень статистической значимости

принят как Р < 0,05.

ble stained complex with ammonium molybdate. The

reaction was initiated by adding 0.1 ml of the sample

to 2 ml of the hydrogen peroxide solution (0.03%) and

stopped in 10 min with adding 1 ml ammonium molyb-

date (4%). The intensity of staining was measured with

spectrophotometer at 410 nm vs. the control sample,

comprising water instead of the experimental sample

[11]. Since the hydrogen peroxide is mainly scavenged

by means of enzymes, the obtained results were re-

ferred to the concentration of protein in the samples,

which was examined spectrophotometrically.

Total content of phenols in the samples was esti-

mated using the Folin reagent (Folin-Ciocaltea, FC) ac-

cording to the method of Singleton and Rossi [21] with

insignificant modification. The studied sample (0.1 ml)

was mixed with 1.5 ml of FC-reagent, preliminary di-

luted 1:10 with distilled water. The resulted mixture

was incubated for 5 min at 22°C, then Na

(0.06%)

solution was added. After 30 min incubation at 22°C

the absorbance at 725 nm was measured.

The findings were statistically processed using the

software Origin 6.1. The value of the differences of

the results for fresh and frozen-thawed HPE were

assessed using the paired t-test. P values < 0.05 were

considered as statistically significant.

Results and discussion

One of the antioxidant characteristics of bioactive

substances appears to be their reducing activity, stipu-

lated by the presence of antioxidants able to be donors

of electrons.

The method based on the ability of the experimen-

tal substances to reduce the Fe

-ferricyainide com-

plex to the Fe

-ferricyainide (FRAP method) is used

in order to estimate the reducing activity of different

substances. Antioxidants which may be assessed by

this method are the substances of low molecular

masses, possessing a high redox potential (ascorbic

acid, uric acid, phenol compounds).

The experimental results have shown that ferric-

reducing activity of extracts from different placentas

varies within the limits equivalent to 30–120 µM ascor-

bate. In fresh extracts the reducing activity is regis-

tered in different fractions, obtained using the gel chro-

matography method. The main part of the activity (from

60 to 80%) is taken by low molecular fractions with

molecular mass less than 5 kDa. Slow freezing of HPE

down to –20°C leads to the decreasing of this activity.

Apparently it can be associated with the partial utiliza-

tion of antioxidant for scavenging free radicals, gener-

ated during freeze-thawing [4]. Ferric-reducing activ-

ity is preserved after rapid freezing down to –196°C

(Fig. 1).

Kinetics of ABTS

radical reducing has two phases,

due to the presence of rapidly and slowly reducing

antioxidants [12, 17]. Activity of antioxidants respon-

292

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

Результаты и обсуждение

Одной из антиоксидантных характеристик

биологически активных веществ является их

восстанавливающая активность, обусловленная

наличием антиоксидантов, способных быть доно-

рами электронов.

Для оценки восстановительной активности раз-

личных веществ использовали метод, основанный

на способности исследуемых веществ восста-

навливать комплекс Fe

-феррицианид до Fe

феррицианид (метод FRAP). Антиоксиданты, кото-

рые могут быть оценены этим методом, – вещест-

ва с низкими молекулярными массами, обладаю-

щие высоким окислительно-восстановительным

потенциалом (аскорбиновая кислота, мочевая кис-

лота, фенольные соединения).

Результаты исследований показали, что железо-

восстанавливающая активность экстрактов из

разных плацент колеблется в пределах, соответ-

ствующих 30–120 мкМ аскорбата. В свежих экс-

трактах восстанавливающая активность отме-

чается в различных фракциях, полученных мето-

дом гель-хроматографии. Основной частью актив-

ности (от 60 до 80%) обладают низкомолекулярные

фракции с молекулярной массой менее 5 кДа.

Медленное замораживание ЭПЧ до –20°С приво-

дит к снижению этой активности. Возможно, это

связано с частичным расходованием антиоксидан-

тов на ингибирование свободных радикалов, обра-

зующихся в процессе замораживания-оттаивания

[4]. Железовосстанавливающая активность сохра-

няется после быстрого замораживания до –196°С

(рис. 1).

Кинетика восстановления ABTS

-радикала

имеет две фазы, которые обусловлены наличием

быстро и медленно восстанавливающих антиокси-

дантов [12, 17]. Активность антиоксидантов, ответ-

ственных за быстрое восстановление (аскорбино-

вая и мочевая кислоты; α-токоферол; аминокисло-

ты, содержащие SH-группы; восстановленный глу-

татион; фенольные соединения и убихиноны),

оценивали по снижению поглощения за первые 10 с,

активность медленно восстанавливающих центров

определяли по ингибированию окраски за следую-

щие 390 с (рис. 2).

Полученные результаты показали, что медлен-

ное замораживание ЭПЧ до –20°С приводит к

снижению их антирадикальной активности за счет

уменьшения активности антиоксидантов, ответст-

венных за быструю фазу. В результате быстрого

замораживания до –196°С увеличивается антира-

дикальная активность вследствие повышения

активности медленно восстанавливающих центров

(рис. 3). Известно, что медленное восстановление

ABTS

-радикала в основном обусловлено дейст-

вием белков [17]. Поэтому можно предположить,

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

Свежевыделенный

Fresh

Замороженный

до –20°С

Frozen down to

–20°C

Замороженный

до –196°С

Frozen down to

–196°C

Рис. 1. Железовосстанавливающая способность ЭПЧ

свежевыделенного и после замораживания-оттаивания.

Fig. 1. Iron-reducing ability of fresh HPE and the one after

freeze-thawing.

0,45

0,5

0,55

0,6

0,65

0,7

0,75

0,8

0 100 200 300 400 500 600

Время, с Time, sec

Поглощение на длине волны 734 нм

Absorbance at 734 nm

Свежевыделенный

Fresh

Замороженный до –20°С

Frozen down to –20°C

Замороженный до –196°С

Frozen down to –196°C

Рис. 2. Кинетика восстановления экстрактами ABTS

радикала.

Fig. 2. Kinetics of reduction of ABTS

radical with the ex-

tracts.

sible for rapid reduction (ascorbic acid; uric acid; α-

tocopherol; amino acids, containing SH-groups; redu-

ced glutathione; phenol compounds and ubiquinones)

was evaluated by decolorization during the first 10 sec-

onds, the activity of slowly reducing centers was esti-

mated by decay during following 390 seconds (Fig. 2).

The obtained results have shown that slow freez-

ing of HPE down to –20°C results in a decrease of

their antiradical activity due to the lessening of the ac-

tivity of antioxidants, responsible for a rapid phase.

Восстановительная активность, экв. мМ аскорбата

Reducing activity, eq. mM of ascorbate