Журнал - Проблемы криобиологии 2010 №3

Подождите немного. Документ загружается.

333

Рис. 1. Микрофотографии презумптивных зигот мыши.

Fig. 1. Microphotos of murine presumptive zygotes.

Неокрашенные клетки

Non-stained cells

Клетки, окрашенные Hoechst 33342

Hoechst 33342 stained cells

Контроль Control

Группа 1 Group 1

Группа 2 Group 2

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

334

Неокрашенные клетки

Non-stained cells

Клетки, окрашенные Hoechst 33342

Hoechst 33342 stained cells

Контроль Control

Группа 1 Group 1

Группа 2 Group 2

Рис. 2. Микрофотографии 2-клеточных эмбрионов мыши.

Fig. 2. Microphotos of two-cell murine embryos.

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

335

казали, что индукция хронического воспаления у

самок мышей существенно снижает количество

ооцитов, зигот и 2-клеточных эмбрионов, а также

приводит к ухудшению морфологии эмбрионов, что

свидетельствует о запуске апоптотических реак-

ций как в яичниках, так и в ооцитах, полученных в

результате индукции суперовуляции. Можно пред-

положить, что основной каскад апоптотических

реакций, вызванный хроническим воспалением,

проявляется главным образом в атрезии примор-

диальных фолликулов, снижении их рецептивности

к гонадотропинам и, как следствие, в уменьшении

количества ооцитов после индукции суперовуляции.

Введение препарата “Криоцелл – криоэкстракт пла-

центы” самкам мышей с реактивным воспалением

яичников способствует более эффективной индук-

ции суперовуляции гонадотропными гормонами.

Этот факт подтверждается достоверным увеличе-

нием количества ооцитов и одноклеточных эмбрио-

нов в пересчете на одно животное в эксперимен-

тальной группе 2 по сравнению с группой 1 и

фактически достижением уровня соответствую-

щих показателей контрольной группы. Один из

механизмов позитивного влияния КП, по-видимо-

му, связан с действием его гормональных компо-

нентов – прогестерона, эстрадиола, пролактина,

гонадотропинов. Хотя объяснить эффект подобной

терапии исключительно гормональной составляю-

щей невозможно.

Достоверные отличия в морфологических ха-

рактеристиках эмбрионов между контрольными и

экспериментальными группами животных в нашей

работе не обнаружены, однако была отмечена

тенденция к снижению качества эмбрионов в груп-

пе 1 и возврату к показателям контроля в группе

2. Известно, что на качество ооцитов и последую-

щее развитие эмбрионов существенное влияние

оказывает также и гормональная стимуляция

экзогенными гонадотропными гормонами. В поль-

зу этого свидетельствует тот факт, что в общем

пуле гамет, полученных от животных контрольной

группы и экспериментальной группы 2, присут-

ствуют ооциты без кумулюса. Неоднократно пока-

зано, что введение экзогенных гонадотропных

гормонов (ГСЖК и чХГ) оказывает существенное

влияние на качество и степень зрелости ооцитов

[11, 16, 20]. Препараты с фолликулостимулирующей

активностью (ГСЖК) влияют на фолликулы двояко:

увеличивают митотическую активность в мелких

фолликулах и защищают от атрезии более крупные.

Однако наряду с увеличением общего количества

ооцитов в результате суперовуляции увеличивается

количество ооцитов с признаками дегенерации или

скрытыми нарушениями [10]. По всей видимости,

эти воздействия усугубляются, наслаиваясь на

патологический фон, сопутствующий хроническому

воспалительному процессу.

plete or partial fragmentation of one or two blastomeres

on type of "grape bunch" was observed, testifying to

late apoptosis stage. Staining with Hoechst 33342 ena-

bled the revealing of the blocking of some embryos at

the zygote stage, as well as the presence of fragmen-

tation of nuclear material.

The number of embryos with abnormal morphol-

ogy in experimental and control groups was compara-

ble (Table 3), however it should be noted that in the

group 2 the tendency to a rise in the yield of morpho-

logically intact embryos was observed (Fig. 2).

It is known that the quality and further develop-

ment of embryos depend on numerous factors: state

and age of donor females, genetic line of mice, condi-

tions and composition of incubation medium, effect of

exogenous gonadotropic hormones on ovulation proc-

ess. Quality of oocytes, in its turn, affects the ability of

embryos after fertilization to following fission. The

embryos with different impairments are withdrawn

during fission process as a result of apoptosis [19, 20].

It has been shown that developed previously and

used in this research method of modelling a reactive

chronic inflammation of mice ovaries using λ-carra-

geenan significantly affects the function of ovaries and

surrounding tissues [4]. The results of this study have

shown that induction of chronic inflammation in female

mice significantly reduces the number of oocytes, zy-

gotes and two-cell embryos, as well leads to aggrava-

tion of embryo morphology, testifying to initiation of

apoptotic reactions both in ovaries and oocytes, de-

rived as the result of ovulation induction. One may sup-

pose that the main cascade of apoptotic reactions

caused with chronic inflammation is basically mani-

fested in atresia of primordial follicles, reduction of their

receptivity to gonadotropins and as a consequence in

lessening the number of oocytes after superovulation

induction. Introduction of the "Cryocell – placental

cryoextract" preparation to female mice with reactive

ovary inflammation contributes to more effective in-

duction of superovulaiton with gonadotropic hormones.

This fact is confirmed with statistical and significant

rise in the number of oocytes and one-cell embryos

per one animal in experimental group 2 if compared

with group 1 and actually approaching the level of cor-

responding indices of the control group. One of the

mechanisms of PC positive effect is likely related to

the effect of its hormonal components: progesterone,

estradiol, prolactin, gonadotropins. Though the explain-

ing of the effect of this therapy with hormonal compo-

nent is impossible.

No statistically significant differences in morpho-

logical characteristics of embryos between the control

and experimental groups of animals in our research

were found, however the tendency to the reduction of

the quality of embryos in the group 1 and reversion to

the control indices in the group 2 was noted. It is known

that quality of oocytes and following development of

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

336

Выводы

Проведенные исследования показали, что хро-

ническое реактивное воспаление яичников у самок

мышей оказывает выраженное влияние на резуль-

таты индукции суперовуляции. У животных с

моделированным воспалением яичников сущест-

венно снижается количество ооцитов, зигот и 2-

клеточных эмбрионов, а также отмечается ухуд-

шение морфологии эмбрионов при индукции супер-

овуляции.

Введение криоэкстракта плаценты самкам мы-

шей с синдромом реактивного воспаления яичников

оказывает выраженное терапевтическое действие

и способствует более эффективной индукции су-

перовуляции под влиянием экзогенных гонадотроп-

ных гормонов, вследствие чего увеличивается

относительное количество гамет и ранних эмбрио-

нов. Отмечены тенденции к ухудшению морфоло-

гических характеристик эмбрионов на фоне воспа-

лительного процесса и их улучшению после терапии

криоэкстрактом плаценты.

Авторы благодарят ст.н.с. Коваленко И.Ф., н.с.

Холодного В.С. за методическую помощь в работе,

ст.н.с. Гончарук Е.И. – за помощь в планировании и

обсуждении результатов эксперимента.

Литература

Биология развития млекопитающих. Методы / Под ред.

М. Манк.– Москва: Мир, 1990.– 406 с.

Грищенко В.І., Пітько В.А., Нерадовська О.В. Застосу-

вання тканинних біопрепаратів в лікуванні хворих з

запальними процесами придатків матки // Збірник

наукових праць Асоціації акушерів-гінекологів України.–

Київ, 2000.– С. 420–422.

Грищенко В.И., Юрченко Т.Н., Прокопюк О.С. Новые

криобиологические технологии получения клеточных и

тканевых фетоплацентарных трансплантатов и их

использование в медицине // Трансплантологія.– 2004.–

Т. 7, №3.– С. 123–129.

Грищенко Н.Г., Клименко Н.А., Гоголь Н.И., Татарко С.В.

Обоснование модели реактивного хронического воспа-

ления яичников у мышей // Теоретична і експеримен-

тальна медицина.– 2009.– №4.– С. 10–17.

Дубоссарская З.М., Миляновский А.И., Коляденко В.Г.

Хронические воспалительные процессы внутренних

женских половых органов.– Київ: Здоров'я, 1991.– 151 с.

Питько В.А., Грищенко В.И., Суббота Н.П. Влияние

криоэкстракта хориона на состояние иммунитета у

женщин с подострым сальпингоофоритом // Пробл.

криобиологии.– 2000.– №1.– С. 81–85.

Питько В.А. Динамика биохимических показателей в

плазме крови женщин с подострым сальпингоофоритом

при трансплантации криоконсервированной хориальной

ткани // Пробл. криобиологии.– 2001.– №1.– С. 76–79.

Рыболовлев Ю.Р., Рыболовлев Р.С. Дозирование веществ

для млекопитающих по константам биологической актив-

ности // Докл. АН СССР.– 1979.– Т. 247, №6.– С. 1513– 1516.

Юрченко Т.Н., Прокопюк О.С., Ломако В.В. Клеточная и

тканевая трансплантация. Биопрепараты.– Харьков,

2003.– 67 с.

embryos is affected significantly by hormonal stimula-

tion with exogenous hormones. The fact that in total

pool of gametes derived from animals of the control

group and in the experimental group 2 there are cumu-

lus-free oocytes testifies to this favour. Not once it has

been shown that introduction of exogenous gonado-

tropic hormones (PMSG and hCG) affects significantly

the quality and maturity rate of oocytes [11, 16, 20].

Medicines with follicle stimulating activity (PMSG) af-

fect the follicles doubly: increase mitotic activity in small

follicles and protect bigger ones against atresia. How-

ever, along with the increase of total number of oocytes

as a result of superovulation the number of oocytes

with the signs of degeneration or hidden impairments

[10] rises. These effects are apparently aggravated

due to superposition of pathological background accom-

panying chronic inflammatory process.

Conclusions

The performed investigations have shown that

chronic reactive inflammation of ovaries in female mice

rendered the manifested effect on the results of su-

perovulation induction. In the animals with simulated

inflammation of ovaries the number of oocytes, zygotes

and two-cell embryos significantly reduces, as well the

aggravation of the morphology of embryos during su-

perovulation induction was found.

Introduction of placental cryoextract to female mice

with the syndrome of reactive inflammation of ovaries

causes manifested therapeutic effect and contributes

to more effective induction of superovulation under the

influence of exogenous gonadotrophic hormones, due

to which the relative number of gametes and early

embryos increases. There has been found the tendency

to aggravation of morphological characteristics of em-

bryos on the background of inflammation process and

their improvement after therapy with placental cryo-

extract.

The authors express their thanks to senior scientist

Kovalenko I.F., scientific worker Kholodnyy V.S. for me-

thodical assistance, to senior scientist Goncharuk E.I. for the

help in designing and discussing the experimental results.

References

Biology of mammals' development. Methods/ Ed. by M. Mank.–

Moscow: Mir, 1990.– 406 p.

Grischenko V.I., Pit'ko V. A., Neradovskaya O.V. Application

of tissue biopreparations in treatment of patients with

inflammatory processes of uterine appendages// Collected

volume of scientific papers of the Association of

Obstetricians-Gynaecologists of Ukraine.– Kiev, 2000.–

P. 420–422.

Grischenko V.I., Yurchenko T.N., Prokopyuk O.S. New

cryobiological technologies of obtaining cell and tissue

fetoplacental transplants and their usage in medicine//

Transplantologiya.– 2004.– Vol. 7, N3.– P. 123–129.

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

337

Ertizeid G., Storeng R. Adverse effects of gonadotrophin

treatment on pre- and postimplantation development in mice //

J. Reprod. Fert.– 1992.– Vol. 96, N4.– P. 649–655.

Krisher R.L. The effect of oocyte quality on development //

J. Anim. Sci.– 2004.– Vol. 82, E-Suppl.– P. E14–E23.

Liu K.X., Kato Y., Kaku T., Sugiyama Y. Human placental

extract stimulates liver regeneration in rats // Biol.Pharmaceut.

Bull.– 1998.– Vol. 21, N1.– P. 44–49.

Neo S., Ishikawa T., Ogiwara K. et al. Canine bone marrow

cells differentiate into hepatocyte-like cells and placental

hydrolysate is a potential inducer // Res. Veterin. Sci.– 2009.–

Vol. 87, N1.– P. 1–6.

Neuber E., Powers R.D. Is the mouse a clinically relevant

model for human fertilization failures // Hum. Reprod.– 2000.–

Vol.15, N1.– P. 171–174.

Quinn P., Horstman F.C. Is the mouse a good model for the

human with respect to the development of the preimplantation

embryo in vitro? // Hum. Reprod.– 1998.– Vol. 13, Suppl. 4.–

P. 173–183.

Redina O.E., Amstislavsky S.Ya., Maksimovsky L.F. Induction

of superovulation in DD mice at different stages of the oest-

rous cycle// J. Reprod. Fert.– 1994.– Vol. 102, N2.– P. 263–

267.

Seo T.B.,Han I.S., Yoon J.H. et al. Growth-promoting activity

of hominis placenta extract on regenerating sciatic nerve //

Acta Pharmacol. Sin.– 2006.– Vol. 27, N1.– P. 50–58.

Strandell A., Bergh C., Lundin K. Selection of patients suitable

for one-embryo transfer may reduce the rate of multiple births

by half without impairment of overall birth rates // Hum.

Reprod.– 2000.– Vol. 15, N12.– P. 2520–2525.

Takase K., Ishikawa M., Hoshiai H. Apoptosis in the degene-

ration process of unfertilized mouse ova // Tohoku J. Exp.

Med.– 1995.– Vol. 175, N1.– P. 69–76.

Van der Auvera, D'Hooghe T. Superovulation of female mice

delays embryonic and fetal development // Hum. Reprod.–

2001.– Vol. 16, N6.– P. 1237–1243.

Поступила 17.08.2010

Grischenko V.I., Klimenko N.A., Gogol N.I., Tatarko S.V.

Substantiation of the model of reactive chronic inflammation

of murine ovaries// Theoretical and experimental medicine.–

2009.– N4.– P. 10–17.

Dubossarskaya Z.M., Milyanovskiy A.I., Kolyadenko V.G.,

Chronic inflammatory processes of female internal genital

organs.– Kiev: Zdoroviya, 1991.– 151 p.

Pit'ko V.A., Grischenko V.I., Subbota N.P. Action of chorion

cryoextract on the immunity state of females with subacute

salpingo-oophoritis// Problems of Cryobiology.– 2000.– N1.–

P. 81–85

Pit'ko V.A. Dynamics of biochemical indices in blood plasm of

women with subacute salpingo-oophoritis during trans-

plantation of cryopreserved chorionic tissue// Problems of

Cryobiology. – 2001.– N1.– P. 76–79.

Rybolovlev Yu. R., Rybolovlev R.S. Dosage of substances

mammals on biological activity constants // Doklady AN SSSR.–

1976.–Vol. .247, N6.– P. 1513–1516.

Yurchenko T.N., Prokopyuk O.S., Lomako V.V. Cell and tissue

transplantation. Biopreparations.– Kharkov, 2003.– 67 p.

Ertizeid G., Storeng R. Adverse effects of gonadotrophin

treatment on pre- and postimplantation development in mice //

J. Reprod. Fert.– 1992.– Vol. 96, N4.– P. 649–655.

Krisher R.L. The effect of oocyte quality on development //

J. Anim. Sci.– 2004.– Vol. 82, E-Suppl.– P. E14–E23.

Liu K.X., Kato Y., Kaku T., Sugiyama Y. Human placental

extract stimulates liver regeneration in rats // Biol.Pharmaceut.

Bull.– 1998.– Vol. 21, N1.– P. 44–49.

Neo S., Ishikawa T., Ogiwara K. et al. Canine bone marrow

cells differentiate into hepatocyte-like cells and placental

hydrolysate is a potential inducer // Res. Veterin. Sci.– 2009.–

Vol. 87, N1.– P. 1–6.

Neuber E., Powers R.D. Is the mouse a clinically relevant

model for human fertilization failures // Hum. Reprod.– 2000.–

Vol.15, N1.– P. 171–174.

Quinn P., Horstman F.C. Is the mouse a good model for the

human with respect to the development of the preimplantation

embryo in vitro? // Hum. Reprod.– 1998.– Vol. 13, Suppl. 4.–

P. 173–183.

Redina O.E., Amstislavsky S.Ya., Maksimovsky L.F. Induction

of superovulation in DD mice at different stages of the oest-

rous cycle// J. Reprod. Fert.– 1994.– Vol. 102, N2.– P. 263–

267.

Seo T.B.,Han I.S., Yoon J.H. et al. Growth-promoting activity

of hominis placenta extract on regenerating sciatic nerve //

Acta Pharmacol. Sin.– 2006.– Vol. 27, N1.– P. 50–58.

Strandell A., Bergh C., Lundin K. Selection of patients suitable

for one-embryo transfer may reduce the rate of multiple births

by half without impairment of overall birth rates // Hum.

Reprod.– 2000.– Vol. 15, N12.– P. 2520–2525.

Takase K., Ishikawa M., Hoshiai H. Apoptosis in the degene-

ration process of unfertilized mouse ova // Tohoku J. Exp.

Med.– 1995.– Vol. 175, N1.– P. 69–76.

Van der Auvera, D'Hooghe T. Superovulation of female mice

delays embryonic and fetal development // Hum. Reprod.–

2001.– Vol. 16, N6.– P. 1237–1243.

Accepted in 17.08.2010

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

338

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38

057) 373-57-91, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:

cryopato@rambler.ru

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

5791, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryopato@rambler.ru

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Central Clinical Hospital of Ukrainian Railways, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

Центральная клиническая больница Укрзалізниці, г. Харьков

УДК 612.822.014-053.1:615.014.41:616.831-005.1

Д.В. ЛЕБЕДИНЕЦ

, С.Е. ОВСЯННИКОВ

, В.В. ЛЕБЕДИНЕЦ

, М.В. ОСТАНКОВ

, А.Н. ГОЛЬЦЕВ

Терапия фетальными нервными клетками в остром периоде

экспериментального ишемического инсульта

(антиоксидантный эффект)

UDC 612.822.014-053.1:615.014.41:616.831-005.1

D.V. LEBEDINETS

, S.YE. OVSYANNIKOV

, V. V. L EBEDINETS

, M.V. OSTANKOV

, A.N. GOLTSEV

Therapy with Fetal Neuronal Cells in Acute Period

of Experimental Ischemic Stroke (Antioxidative Effect)

В работе представлены результаты исследования влияния криоконсервированных фетальных нервных клеток (кФНК) на

динамику неврологического дефицита и состояние процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в остром периоде ишемии

мозга у белых крыс. Показано, что введение кФНК корригировало нарушение активности ПОЛ, снижало уровень

свободнорадикальных метаболитов в веществе мозга, печени и сыворотке крови, усиливало эндогенную антиоксидантную

защиту, улучшало клинический статус крыс и повышало показатель выживаемости животных. Проведенные исследования

выявили достоверный защитный эффект введенных внутрибрюшинно кФНК в остром периоде экспериментальной ишемии

мозга лабораторных животных. Полученные результаты позволяют считать перспективным применение кФНК в комплексном

лечении ишемических нарушений мозгового кровообращения.

Ключевые слова: криоконсервированные фетальные нервные клетки, перекисное окисление липидов, ишемия мозга.

У роботі представлені результати дослідження впливу кріоконсервованих фетальних нервових клітин (кФНК) на динаміку

неврологічного дефіциту і стан процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) у гострому періоді ішемії мозку білих щурів.

Показано, що введення кФНК коригувало порушення активності ПОЛ, знижувало рівень вільнорадикальних метаболітів у

речовині мозку, у печінці та сироватці крові, підсилювало ендогенний антиоксидантний захист, покращувало клінічний статус

і підвищувало показник виживання тварин. Проведені дослідження виявили достовірний захисний ефект внутрішньочеревинного

введення кФНК у гострому періоді експериментальної ішемії мозку лабораторних тварин. Отримані результати дозволяють

вважати перспективним застосування кФНК у комплексному лікуванні ішемічних порушень кровообігу мозку.

Ключові слова: кріоконсервовані фетальні нервові клітини, перекисне окислення ліпідів, ішемія мозку.

In this research there are presented the results of the effect of cryopreserved fetal neuronal cells (cFNCs) on the dynamics of

neurological deficit and state of the processes of lipid peroxidation (LPO) in an acute period of brain ischemia in white rats. It has been

shown that the introduction of cFNCs corrected the impairment of LPO activity, reduced the level of free radical metabolites in brain

substance, liver and blood serum, strengthened endogenous antioxidant protection, improved clinical status of rats and increased the

viability index of the animals. The carried-out studies revealed statistically significant effect of introduced intraperitoneally cFNCs in

an acute period of experimental brain ischemia of laboratory animals. The findings enable the considering of the application of cFNCs

in a combined treatment of ischemic impairments of brain blood circulation as perspective one.

Key words: cryopreserved fetal neuronal cells, lipid peroxidation, brain ischemia.

Согласно современным представлениям окси-

дативный стресс является первичной неспецифи-

ческой реакцией организма на изменения как внеш-

ней среды, так и внутренних метаболических про-

цессов. Если незначительные временные сдвиги

прооксидантно-антиоксидантного равновесия при-

водят к интенсификации адаптационных процессов,

повышающих резистентность организма к дейст-

вию неблагоприятных факторов, то существенное

ускорение реакций свободнорадикального окисле-

ния (СРО) биомолекул может вызывать различные

патологии, в том числе ишемический инсульт (ИИ)

[1, 6]. Основную опасность для нервных клеток

при ИИ представляют истощение энергетических

According to current notions an oxidative stress is

primary non-specific reaction of an organism on the

changes of both environment and inner metabolic

processes. Slight shifts of pro-oxidant/antioxidant

balance result in intensification of adaptation proces-

ses, increasing an organism resistance to the effect of

unfavorable factors, though significant acceleration of

the reaction of free radical oxidation (FRO) of biological

molecules may cause different pathologies, including

ischemic stroke (IS) [1, 6]. For neuronal cells at IS

the major threat is exhaustion of energetic stocks,

surplus accumulation of exciting amino acids, rendering

neurotoxic effect, and the formation of reactive oxygen

species (ROS), associated to the leaking of electrons,

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

339

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

ресурсов, избыточное накопление возбуждающих

аминокислот, оказывающих нейротоксическое

действие, и образование активных форм кислорода

(АФК), связанное с утечкой электронов, накапли-

вающихся в промежуточных звеньях дыхательной

цепи [1, 2]. Нарушение энергетического метабо-

лизма приводит к изменению трансмембранных

ионных потоков и накоплению кальция внутри

нейронов. При этом развивается “атака” АФК на

молекулы белков, нуклеиновых кислот и липидов,

протекающая по механизму СРО [3, 4]. Неуправ-

ляемая и некомпенсированная активация процес-

сов перекисного окисления липидов (ПОЛ), истоще-

ние эндогенных антиоксидантов [1, 7] и нарушение

регуляторных механизмов антирадикальной защи-

ты рассматриваются как ключевые звенья по-

вреждения нейронов [6, 14]. Окислительная моди-

фикация белков под действием АФК вызывает

изменение их конформационной организации с

экспансией скрытых антигенных эпитопов и при-

обретением ими новых иммуногенных свойств [5,

17]. Активизирующийся в этих условиях ответ

антител и образующиеся иммунные комплексы, в

свою очередь, стимулируют активность фагоцитов

и продукцию ими АФК. Кроме того, окисление ли-

пидов приводит к появлению хемоаттрактантов,

усиливающих миграцию фагоцитов в очаг воспа-

ления.

Патогенетическое значение интенсивности про-

цессов ПОЛ и снижение антиоксидантной актив-

ности при развитии ИИ описаны в ряде клинико-

биохимических исследований [10, 16]. Показано,

что общепринятая терапия (реополиглюкин, эуфил-

лин, аспирин, курантил, трентал) не снижает высо-

кую активность ПОЛ. Это явилось основанием для

введения в схемы терапии ишемии мозга лекарст-

венных средств, избирательно корректирующих

активность реакций ПОЛ. Несмотря на очевидную

перспективность антиоксидантной терапии при

ишемических состояниях и полученные положи-

тельные результаты [7, 10, 11, 13, 14, 16], до сих

пор не разработаны методы терапии для широкой

клинической практики. В связи с этим необходим

поиск новых способов коррекции уровня СРО в

веществе мозга при гипоксических и ишемических

состояниях. Одним из методов лечения ИИ может

быть тканевая терапия, которая занимает в послед-

нее время ведущие позиции при лечении различных

нейропатологий.

Цель работы – оценить влияние криоконсерви-

рованных фетальных нервных клеток на динамику

неврологического дефицита и состояние ПОЛ в

остром периоде ИИ у белых крыс.

Материалы и методы

Исследование проводили на крысах-самцах

линии Вистар массой 180–200 г в соответствии с

accumulated in intermediate links of the respiratory

chain [1, 2]. Impaired energetic metabolism leads to

the change in trans-membrane ion fluxes and accu-

mulation of calcium inside neurons. Herewith the

“attack” of ROS to protein molecules, nucleic acids

and lipids, proceeding on FRO mechanism, develops

[3, 4]. Uncontrolled and non-compensated activation

of the processes of lipid peroxidation (LPO), exhaustion

of endogenous antioxidants [1, 7] and disorder of

regulatory mechanisms of antiradical protection are

considered as key links of neuron impairment [6, 14].

Oxidative modification of proteins under the effect of

ROS causes the changes in their conformational or-

ganization with the expansion of hidden antigen epito-

pes and gaining by them of new immunogenic properties

[5, 17]. Activating under these conditions response of

antibodies and forming immune complexes, in their turn,

stimulate the activity of phagocytes and ROS produc-

tion by them. In addition, lipid oxidation results in the

appearance of chemoattractants, strengthening the

migration of phagocytes into the inflammation focus.

Pathogenetic value of the intensity of LPO proces-

ses and reduced antioxidant activity at IS are described

in some clinical and biochemical studies [10, 16]. It

has been shown that traditional therapy (rheopolyglukin,

euphyllinum, aspirin, dipyridamolum, pentoxifylline)

does not reduce high LPO activity. This was the reason

to introduce into the brain ischemia therapy protocol

the drugs, selectively correcting the activity of LPO

reactions. In spite of evident prospects of antioxidant

therapy under ischemic states and the obtained positive

results [7, 10, 11, 13, 14, 16], no therapeutical methods

have been designed yet for a wide clinical practice. In

this connection there is a need in searching the new

ways of correction of FRO level in brain substance at

hypoxic and ischemic states. One of the treatment

methods of IS may be tissue therapy, which has taken

the leading positions in the treatment of different

neuropathologies recently.

The research aim is to assess the effect of cryopre-

served fetal neuronal cells on the dynamics of neuro-

logical deficit and LPO state in IS acute period in white

rats.

Materials and methods

The studies were carried-out in male Wistar rats

of 180–200g mass in the accordance with the “General

principles of the experiments in animals”, approved by

the 3

National Congress on Bioethics (Kiev, 2007).

Brain ischemia was caused with occlusion of medial

cerebral artery (MCAo) in the left hemisphere

according to the method reported [8]. Rats were

introduced with ketamine (125 mg/kg) intraperitoneally.

During the surgery and prior to the postanesthetic

recovery the body temperature of animals was main-

tained at the level of 37°C with the standard method.

Operational wound was sutured by layers.

340

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

"Общими принципами экспериментов на живот-

ных", одобренными III Национальным конгрессом

по биоэтике (Киев, 2007).

Ишемию мозга вызывали окклюзией средней

мозговой артерии (СМАо) в левом полушарии по

методу [8]. Крысам вводили кетамин (125 мг/кг)

внутрибрюшинно. Во время операции и до выхода

из наркоза температуру тела животных поддержи-

вали на уровне 37°С стандартным методом. Опе-

рационную рану послойно ушивали.

Суспензию фетальных нервных клеток (ФНК)

получали в стерильных условиях путем дезагрега-

ции мягких тканей мозга плодов крыс 11-ти суток

гестации с помощью гомогенизатора Поттера.

Криоконсервировали ФНК под защитой 10%-го

раствора ДМСО на программном замораживателе

УООП-6 производства СКТБ с ОП при ИПКиК

НАН Украины по методу [5]. Оттаивание прово-

дили на водяной бане при 41°С. Криоконсервиро-

ванные (кФНК) или нативные (нФНК) ФНК вво-

дили внутрибрюшинно по 0,5 мл (8×10

клеток на

крысу) через 6 ч после СМАо.

Животных разделили на 5 групп: 1 – интактные

(контроль); 2 – ИИ; 3 – ИИ + введение кФНК; 4 –

ИИ + введение нФНК; 5 – ИИ + введение пираце-

тама на физиологическом растворе. Крыс выводи-

ли из эксперимента путем декапитации под легким

эфирным наркозом на 3, 7 и 28-е сутки после

инициации ИИ и лечения. Влияние введенных ФНК

на течение ИИ оценивали по динамике показателей

клинических проявлений – выраженности обще-

мозговой и локальной неврологической симптома-

тики с определением Stroke-Index по C. McGrow

[6], а также по показателю выживаемости живот-

ных.

Интенсивность ПОЛ оценивали по содержанию

активных продуктов, реагирующих с тиобарбиту-

ровой кислотой (ТБКАП) в крови, мозгу и печени,

[3]. В печени определяли активность каталазы [9],

содержание глутатионпероксидазы [19], глутатион-

редуктазы [15], общую антиокислительную актив-

ность (АОА) [19], содержание восстановленного

глутатиона [12]. Содержание белка в тканях опре-

деляли в биуретовой реакции [18].

Статистическую обработку полученных резуль-

татов проводили параметрическим методом с

помощью t-критерия Стьюдента или непараметри-

ческим методом Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

При исследовании ПОЛ на модели эксперимен-

тального ИИ у всех животных было выявлено су-

щественное изменение его интенсивности. При

этом установлены определенные тканеспецифи-

ческие особенности. На 3-и сутки эксперимента в

гомогенатах мозга и печени животных с ИИ (груп-

The suspension of fetal neuronal cells (FNCs) was

derived under sterile conditions by means of desaggre-

gation of brain soft tissues of rat fetuses of the 11-

days’ gestation by means of Potter homogenizer. FNCs

were cryopreserved under protection of 1% DMSO

solution using programmable freezer UOP-6 (Special

Designing Constructing and Technical Bureau at the

IPC&C of National Academy of Sciences of Ukraine)

according to the method [5]. Thawing was done in

water bath at 41ºC. Cryopreserved (cFNCs) or native

(nFNCs) cells were intraperitoneally introduced by 0.5

ml (8×10

cells per rat) 6 hrs later MCAo.

Animals were divided into 5 groups: 1 – intact

(control); 2 – IS; 3 – IS + introduction of cFNCs; 4 –

IS + introduction of nFNCs; 5 – IS + introduction of

piracetam with physiological solution. The rats were

taken from the experiments by decapitation under slight

ether narcosis to the 3, 7 and 28

days after IS initiation

and treatment. Effect of introduced FNCs on the

proceeding of IS was assessed on the dynamics of the

indices of clinical manifestations: expression of general

cerebral and local neurological symptoms with exa-

mining the Stroke-index according to C. McGrow [6],

as well as on the index of the survival of animals.

LPO intensity was estimated on the content of

substances reacting with thiobarbituric acid (TBARS)

in blood, brain and liver [9]. The folowing indices were

found in liver: content of glutathione peroxidase [19],

glutathione reductase [15], total antioxidant activity

(AOA) [19], content of reduced glutathione [12]. Pro-

tein content in tissues was determined by means of

biuret reaction [18].

The findings were statistically processed by para-

metrical method using the Student’s t-criterion and non-

parametrical method using Mann-Whitney’s criterion.

Results and discussion

When investigating LPO in the model of experimen-

tal IS in all the animals the change in its intensity was

found. Herewith the certain tissue-specific peculiarities

were established. To the 3

experimental day in brain

and liver homogenates of animals with IS (group 2)

the content of TBARS statistically and significantly

exceeded the control value and to the 7

day this index

of LPO in brain continued the growth and somewhat

decreased to the 28

day, herewith remaining signifi-

cantly higher than the control (Fig. a). At the same

time in liver homogenates the changes in this index

had the dynamics, reverse to the augmenting of neuro-

logical manifestations and significantly reduced to the

day with a slight rise to the 28

day (Fig. b). In

addition, the changes in the TBARS content in brain

and liver of rats after the therapy, though they had

similar orientation if compared with the control, were

more manifested in brain homogenates (Fig. a). It

should be noted that the studied indices approached

341

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

па 2) содержание ТБКАП достоверно превышало

контрольное значение, а к 7-м суткам в мозгу дан-

ный показатель ПОЛ продолжал расти и несколько

снизился к 28-м суткам, при этом оставаясь значи-

тельно выше контроля (рисунок, а). В то же время,

в гомогенатах печени изменения этого показателя

имели динамику, обратную нарастанию невроло-

гических проявлений, и значительно уменьшались

к 7-м суткам с небольшим повышением на 28-е

сутки (рисунок, б). Кроме того, изменения содер-

жания ТБКАП в мозгу и печени крыс после

лечения, хотя и имели одинаковую направленность

по сравнению с контролем, были более выражены

в гомогенатах мозга (рисунок, а). Следует отме-

тить, что исследуемые показатели наиболее при-

ближались к контролю после введения крысам

ФНК (группы 3 и 4), в отличие от животных, полу-

чавших пирацетам (группа 5).

Общая антиокислительная активность сыворот-

ки крови достоверно повышалась на 7-е сутки раз-

вития ИИ по сравнению с контрольными значения-

ми и оставалась на том же уровне к 28-м суткам.

При этом содержание ТБКАП в сыворотке увели-

чивалось на протяжении всего исследуемого срока

развития заболевания (табл.1).

Приведенные результаты согласуются с совре-

менными концепциями о физиологической роли

ПОЛ [1, 16]. Наивысшие показатели содержания

ТБКАП в гомогенатах печени и мозга отмечены

в период доклинической фазы развития заболе-

вания, что свидетельствует о патогенетическом

вкладе ПОЛ в развитие ИИ. Можно предположить,

что снижение содержания ТБКАП в мозгу в период

Содержание ТБКАП в мозгу (а), печени (б) у крыс при развитии экспериментального ИИ и после лечения: – на 3-и

сутки; – 7-е сутки; – 28-е сутки;

– контроль.

Content of TBARS in rat brain (a) and liver (b) during development of experimental IS and after treatment: – to the 3

day; – 7

day; – 28

day;

– the control.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

more to the control after the introduction to rats of

FNCs (groups 3 and 4) in contrast to the animals recei-

ved piracetam (group 5).

Total antioxidant activity of blood serum statistically

and significantly increased to the 7

day of IS deve-

lopment if compared with the control values and

remained at the same level to the 28

day. Herewith

the content of TBARS in the serum increased during

the whole period of disease development (Table 1).

The presented results conform with the current

conceptions about physiological role of LPO [1, 16].

The highest indices of TBARS content in liver and

brain homogenates are noted in the period of pre-

clinical phase of disease development, that testifies to

pathogenetic contribution of LPO into IS development.

One can suppose that the reduction of TBARS content

in brain during an acute phase is likely related to the

exhaustion of brain LPO substrates because of quite

rapid destruction of myelin and release of free fatty

acids into liquor and via BBB into blood channel.

Simultaneous rise in TBARS content in blood serum

partially confirms this supposition. Similar orientation

of the processes is found in the animals during an acute

phase of IS [13, 14]. Consequently, the obtained data

about the effect of biochemical changes on the induc-

tion of immune inflammatory process once again con-

firm the systemic character of the development of

autoimmune diseases as IS.

It is known that the change in ROS concentration,

activity of enzyme antioxidant system, content of low

molecular antioxidants, as well as the regeneration sys-

tem of reducing equivalent donors may affect pro-

oxidant/antioxidant homeostasis [14]. The data of Table 2

ИИ

Содержание ТБКАП, нмоль/мг белка

TBARS content, nmol/mg of protein

нФНК

nFNC

кФНК

cFNC

Пирацетам

Piracetam

ИИ

Содержание ТБКАП, нмоль/мг белка

TBARS content, nmol/mg of protein

нФНК

nFNC

кФНК

cFNC

Пирацетам

Piracetam

а aб b

аппурГ

хынтовиж

fopuorG

slamina

ьлетазакоП

xednI

иктус,яинаводелссикорС

syad,mretnoitavresbO

37 82

)6=n(

ПАKБТ

SRABT

2,0±5,22,0±5,2*2,0±5,2

АОА 3,2±0,94*3,2±0,94*3,2±0,94

)6=n(

ПАKБТ

SRABT

4,0±76,26,0±2,38,0±5,3

АОА *4,2±4,65*0,2±0,95*2,2±9,85

)21=n(

ПАKБТ

SRABT

*2,0±98,27,0±57,22,0±26,2

АОА 2,1±0,251,2±8,052,1±4,05

)21=n(

ПАKБТ

SRABT

6,0±59,24,0±0,36,0±6,2

АОА 0,2±6,255,0±5,153,1±9,05

)21=n(

ПАKБТ

SRABT

4,0±0,3*2,0±59,2*3,0±2,3

АОА 1,2±0,457,2±2,351,3±4,25

342

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

острой фазы, по-видимому, связано с

истощением субстратов ПОЛ головного

мозга вследствие достаточно быстрой де-

струкции миелина и выхода свободных

жирных кислот в ликвор и через гемато-

энцефалический барьер в кровяное русло.

Одновременное повышение содержания

ТБКАП в сыворотке крови частично под-

тверждает данное предположение. Подоб-

ная направленность процессов отмечена у

животных в остром периоде ИИ [13, 14].

Следовательно, полученные данные о

влиянии биохимических изменений на ин-

дукцию иммуновоспалительного процесса

еще раз подтверждают системный харак-

тер развития аутоиммунных заболеваний

на примере ИИ.

Известно, что на прооксидантно-анти-

оксидантный гомеостаз могут влиять из-

менение концентрации АФК, активность

ферментативной антиоксидантной систе-

мы, содержание низкомолекулярных анти-

оксидантов, а также система регенерации

доноров восстановительных эквивалентов

[14]. Данные табл. 2 свидетельствуют о

значительном снижении активности изу-

ченных антиоксидантных ферментов и со-

держании восстановленного глутатиона, а

также о снижении активности глутатион-

6-фосфатдегидрогеназы – фермента, син-

Таблица 1. Содержание ТБКАП (нмоль МДА/мл)

и АОА (%) в сыворотке крови крыс при развитии

экспериментального ИИ и после лечения

Table 1. Content of TBARS (nmol/ml) and AOA (%) in rat

blood serum with IS and after introduction of drugs

Примечание: * – достоверные различия (Р< 0,05) в сравнении с

контролем.

Note: * – the significant differences, if compared with the control (P < 0.05).

тезирующего НАДФН в печени крыс в остром

периоде ИИ. В то же время после введения живот-

ным ФНК данные показатели практически не

отличались от контроля (табл. 2).

На основе данных о патогенетически значимом

повышении активности ПОЛ и снижении уровня

эндогенных антиоксидантов в сыворотке крови у

животных изучали влияние ФНК на эти процессы

при ИИ в зависимости от степени неврологического

дефицита. У крыс групп 3 и 4 установлено положи-

тельное влияние введенных кФНК или нФНК на

показатели ПОЛ, а также на корреляцию между

динамикой клинического статуса и уровнем ПОЛ.

Так, в случае позитивного клинического эффекта

препарата у крыс отмечалась тенденция к депони-

рованию эндогенных антиоксидантов и снижению

способности липидов к окислению. Наиболее су-

щественная коррекция показателей ПОЛ отмеча-

лась у крыс группы 3 после введения кФНК. У

них повышался уровень эндогенных антиоксидан-

тов, что свидетельствовало об усилении эндогенной

антиоксидантой защиты.

Вероятно, высокая терапевтическая эффектив-

ность применения ФНК в остром периоде ИИ

обусловлена тем, что они, обладая широким спект-

testify to a significant reduction in the activity of the

studied antioxidant enzymes and content of reduced

glutathione, as well as a decrease in the activity of

glutathione-6-phosphate dehydrogenase, the enzyme

synthesizing NADPH in rat liver in an acute period of

IS. At the same time after the FNCs introduction to

the animals these indices almost did not differ from

the control (Table 2).

On the base of the data about pathogenetically

significant rise in LPO activity and reduction of the

level of antioxidants in blood serum of animals there

was studied the effect of FNCs on these processes at

IS depending on the extent of neurological deficit. In

the rats of groups 3 and 4 a positive effect of the

introduced either cFNCs or nFNCs on LPO indices

was found, as well as correlation between the dynamics

of clinical status and LPO level. For example, in the

case of positive clinical effect of the preparation in

rats there was noted the tendency to depositing of

endogenous antioxidants and reduction of the ability to

lipid oxidation. The most significant correction of LPO

indices was found in the rats of group 3 after cFNCs

introduction. The level of endogenous antioxidants was

increased, testifying to the strengthening of endogenous

antioxidant protection.