Журнал - Проблемы криобиологии 2010 №3

Подождите немного. Документ загружается.

313

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

чином, після заморожування-віді-

гріву показано зниження кількості

життєздатних клітин у всіх розгля-

нутих випадках.

Люмінесцентний барвник JC-1

відображує енергетичний стан мі-

тохондрій. Він характеризується

зеленим світінням, а при збіль-

шенні заряду на мембранах міто-

хондрій молекули барвника фор-

мують J-агрегати, що супрово-

джується появою помаранчового

світіння [12]. Дані люмінесцентної

мікроскопії показали, що ККХ

мають 94,5 ± 7,1% світіння в пома-

ранчовій зоні спектра, що свідчить

про високий енергетичний стан

культури клітин. Після кріоконсер-

вування в клітинах хоріона даний

показник мав тенденцію до зни-

ження. Так, 64,3 ± 2,8 та 78,2 ±

амаргорП

яннавувреснокоiрк

noitavreserpoyrC

margorp

инидог,яннежеретсопссаЧ

srh,mretnoitavresbO

138

ьлортноK

lortnoC

3±455±982±096±89

16±8 * 2±03 * 5±14 * 4±94 *

23±843±66 * 7±875±29

36±21 * 4±52 * 5±74 * 4±05 *

45±842±54 * 4±06 * 3±87 *

52±056±177±488±88

Таблиця 1. Ефективність прикріплення КККХ до поверхні

культурального пластику, % (n = 6, M ± m)

Table 1. Efficiency of cryopreserved ChCC adhesion

to culture plastics, % (n = 6, M ± m)

Примітка: * – вірогідно відносно нативного контролю, р < 0,05.

Note: * – statistically significant in respect of the native control, p < 0.05

3,4% клітин, кріоконсервованих за програмами 1

та 2 відповідно, мали світіння в помаранчовій зоні

спектра, що вірогідно нижче, ніж показник у конт-

рольній групі. Кріоконсервування ККХ за програ-

мами 3, 4 та 5 також призводило до зниження

досліджуваного показника: високу енергетичну ак-

тивність мітохондрій мали 72,5 ± 5,1 та 76,4 ± 4,5%

клітин відповідно.

Після добової реабілітації у клітин, кріоконсер-

вованих за програмами 2 і 5, відбулося відновлення

показників світіння до значень контрольних зразків.

Подальшим етапом дослідження було спостере-

ження за адгезією і наступною проліферативною

активністю деконсервованих ККХ. Проведені екс-

перименти показали, що застосування програм 2

та 5 давало позитивний результат (табл. 1). Біль-

шість клітин прикріплювалися до поверхні культу-

рального пластику на 24-у годину спостереження.

При кріоконсервуванні за програмами 1 і 3 дослі-

джуваний показник був вірогідно нижче значень

контрольних зразків. Клітини мали округлу форму,

лише у деяких спостерігали відростки. Відсутність

характерних ознак розпластування на протязі пер-

шої доби після посіву відображає, ймовірно, функ-

ціональні ушкодження клітин, які були отримані в

процесі кріоконсервування. Таким чином, адгезія,

що є першим етапом процесу проліферації клітин,

може бути використана поряд з оцінкою енер-

гетичного стану мітохондрій як тести скринінга

ефективності програми заморожування.

Після спостереження за процесами адгезії кріо-

консервованих ККХ було проведено дослідження

проліферативних характеристик культури протягом

Viability index of the control ChCC made 92.3 ±

4.2%. The found results of cell viability after freeze-

thawing according to the above-mentioned programs

are shown in Fig. 1. When using the program 1 a num-

ber of viable cells reduced in 1.8, program 2 did in

1.25, program 3 diminished in 1.5, program 4 did in 1.3

and program 5 in 1.2 times comparing to the control

samples. Thus, after freeze-thawing the reduction of

number of viable cells was shown in all analyzed cases.

Fluorescent dye JC-1 reflects an energetic state of mi-

tochondria. It is characterized with a green lumines-

cence, and if charge on mitochondria membranes in-

creases the dye molecules form J-aggregates, that is

accompanied with the appearance of orange lumines-

cence [12]. The data of fluorescence microscopy have

shown that ChCC have 94.5 ± 7.1% of cells with fluo-

rescence in orange bandwidth that testifies to a high

energetic state of cell culture. Cryopreservation of cho-

rion cells lead to a tendency of this index reduction.

Herewith 64.3 ± 2.8 and 78.2 ± 3.4 of cells cryopreser-

ved according to the programs 1 and 2, correspond-

ingly had a fluorescence in orange bandwidth. Cryopre-

servation of ChCC according to the programs 3, 4 and

5 also resulted in a reduction of the studied index: high

energetic activity of mitochondria had 72.5 ± 5.1 and

76.4 ± 4.5% of cells, correspondingly.

After 24 hrs rehabilitation in the cells cryopreser-

ved according to the programs 2 and 5 reversion of the

fluorescence to the control values occured.

The further stage of research was observation of

adhesion and following proliferative activity of frozen-

thawed ChCC. The carried out experiments showed

that the application of programs 2 and 5 gave a posi-

314

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

14 діб (рис. 2). Морфологічне вивчення ККХ, кріо-

консервованих за програмами 1, 3 і 4, при подаль-

шому культивуванні показало зниження кількості

клітин, які прикріпилися протягом першої доби

культивування. Крім того, спостерігали виражені

зміни у морфології клітин, що проявлялися у неодно-

рідній щільності цитоплазми, наявності 2-3 відрост-

ків з додатковими розгалуженнями на різних полю-

сах клітини. Іншу картину спостерігали в клітинах,

які були кріоконсервовані за програмами 2 і 5.

Клітини були веретеноподібної та трикутної форми

з однорідною щільністю цитоплазми. В цих випад-

ках спостерігалося збереження адгезивної фракції

клітин з наступною проліферацією.

Таким чином, відзначався активний ріст клітин,

які були попередньо кріоконсервовані за програма-

ми 2 і 5, що корелює з наведеними вище показни-

ками життєздатності, адгезії, енергетичного стану

мітохондрій. Cлід зазначити, що ріст культур,

консервованих за іншими програмами, був уповіль-

нений або взагалі відсутній. У всіх розглянутих

випадках кріоконсервовані ККХ мали деяке запіз-

нення у швидкості утворення моношару по відно-

шенню до контрольної ККХ. У разі оптимальних

програм 2 і 5 це запізнення становило 3 ± 1 доба, в

субоптимальних випадках (програма 4) – 5 ± 2 доби,

в незадовільних (програми 1 та 3) – 7 ± 2 доби.

Дослідження впливу кріоконсервування на пролі-

ферацію та потенціал диференціювання ККХ важ-

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

2,2

014714

Час спостереження, діб

Observation term, days

Коефіцієнт проліферації

Proliferation coefficient

Рис. 2. Динаміка росту ККХ, кріоконсервованих за

різними програмами після деконсервації (n = 6, M ± m):

0– контроль; програми: – 1;  – 2;  – 3; 1 – 4; – 5.

Fig. 2. Growth dynamics of cryopreserved ChCC according

to the different programs after freeze-thawing (n = 6, M ± m):

0– control; programs: – 1;  – 2;  – 3; 1 – 4; – 5.

tive result (Table 1). The most cells adhered to the

surface of cultural plastics to the 24

observation hour.

After cryopreservation according to the programs 1

and 3 the studied index was significantly lower than

the control values. The cells had a round shape, only in

some of them outgrowings were observed. The ab-

sence of marked flattening signs for the first day after

cell seeding likely showed the functional damages of

cells as a result of cryopreservation. Thus, adhesion

being the first stage of cell proliferation may be used

along with the method of evaluation of mitochondria

energetic state as the screening tests for freezing pro-

gram efficiency.

After observation of cryopreserved ChCC adhe-

sion the investigation of proliferative characteristics of

14 days culture was carried-out (Fig. 2). The morpho-

logical study of ChCC cryopreserved according to the

programs 1, 3 and 4 during further culturing showed

the reduction of number of cells, adhered during the

first day of culture. In addition, the expressed changes

were observed in cell morphology, manifesting in cyto-

plasm inhomogeneous density, presence of 2-3 outgrow-

ings with additional branching on different poles of a

cell. Another situation was observed in the cells, which

were cryopreserved according to the programs 2 and

5. The cells were of spindle-like and triangular shapes

with homogeneous density of cytoplasm. In these cases

the adhesive fraction of cells was preserved and pro-

liferated.

Thus, the active post-thaw growth of cells, cryopre-

served according to the programs 2 and 5 was ob-

served, correlating with the given above indices of vi-

ability, adhesion and energetic state of mitochondria.

In addition it has been noted that growth of the cul-

tures, cryopreserved according to other programs was

slow or completely absent. In the all the analyzed cases

the cryopreserved ChCC had a delay in the monolayer

formation as for control ChCC. In the case of optimal

programs 2 and 5 this delay made 3 ± 1 days, in subop-

timal cases (program 4) was 5 ± 2 days, in improper

ones (programs 1 and 3) comprised 7 ± 2 days.

The study of cryopreservation effect on prolifera-

tion and differentiation potential of ChCC is important

not only for understanding the regulation mechanisms

of proliferation-differentiation processes of precursor

cells, and also for development of low temperature

cryopreservation methods, providing integrity of stem

fraction of the studied cells.

Further stage of the work was the study of cryo-

preservation effect on ability for in vitro differentia-

tion (Table 2). To check the preservation of the stem-

ness the adipogenic differentiation test was chosen,

which is rapid and simple.

The first indices of adipocyte differentiation were

observed to the 5–7 days, manifesting in the change of

315

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

ливо як для розуміння механізмів регуляції процесів

проліферації та диференціації процесів клітин-

попередників, так і для розробки методів низько-

температурного консервування, які забезпечують

збереження стовбурової фракції досліджених клі-

тин.

Наступним етапом роботи було дослідження

впливу кріоконсервування на здатність до диферен-

ціювання in vitro (табл. 2). Для доказу збереження

“стовбуровості” ми обрали тест диференціювання

в адипогенному напрямку, який відрізняється

швидкістю та простотою постановки.

Перші ознаки адипоцитарного диференціювання

спостерігали на 5–7 добу, це виражалося в зміні

морфології клітин (округлість, зернистість цито-

плазми). Через 21 добу після початку адипоцитар-

ного диференціювання цитохімічне фарбування

кріоконсервованих ККХ (програма 5) барвником

Sudan IV показало наявність ліпідних крапель

помаранчового кольору в цитоплазмі більш ніж

58 ± 5% клітин, що свідчить про диференціювання

в заданому напрямку. При цьому у морфології

контрольних зразків зазначених змін не спосте-

рігалося. Слід відзначити, що більшу здатність до

диференціювання в адипоцитарному напрямку

мали тонкі веретеноподібні клітини [8]. Отримані

результати свідчать, що кріоконсервовані ККХ, так

само як і контрольні ККХ, здатні до диференцію-

вання у мезенхімально-мезодермальному напрям-

ку. Кількісно ця здатність у клітин, кріоконсервова-

них за програмою 5, суттєво не відрізнялася від

контрольних зразків і становила 63 ± 6%. При цьому

розглянутий показник у ККХ, кріоконсервованих за

іншими програмами, був незначним, або відсутнім.

Найкращими результатами характеризувалась

програма 5, яка відрізнялася від інших програм

заморожування наявністю сидінгу. Незадовільні

результати, отримані для інших використаних про-

грам, можливо пов'язані з переохолодженням.

Цікаві результати, отримані після кріоконсервування

за програмою 2, при якій, незважаючи на повільну

швидкість охолодження, переохолодження внут-

рішньоклітинного вмісту, очевидно, не мало місця.

Отримані дані дозволяють вважати, що ККХ харак-

теризуються досить високою чутливістю до цього

негативного параметра процесу кріоконсервування.

Основне завдання розробки методу кріоконсер-

вування полягає в забезпеченні збереженості мор-

фофункціональних властивостей об'єкта, який під-

лягає впливу низьких температур. Результати пред-

ставлених досліджень кріоконсервованих ККХ

узгоджуються з результатами [7, 17] та свідчать

про збереження їх проліферативних властивостей і

потенціалу до диференціювання після кріоконсер-

cell morphology (roundness and granularity of cyto-

plasm). In 21 day after beginning the adipocyte differ-

entiation the cytochemical staining of cryopreserved

ChCC (program 5) with Sudan IV showed the presen-

ce of orange lipid droplets in the cytoplasm of more

than 58 ± 5% of cells, testifying about differentiation in

the given direction. Herewith no changes were ob-

served in morphology of the control samples. It has

been noted that thin spindle-like cells had higher capa-

city for adipocyte differentiation [8]. The obtained re-

sults testify about the facts that cryopreserved ChCC

as well as control ChCC are capable of mesenchy-

mal-mesodermal differentiation. Quantitatively this ca-

pacity in cells cryopreserved according to the program

5 did not significantly differ from the control samples

and was 63 ± 6%. Herein the examined index in ChCC,

cryopreserved according to the other programs was

either insignificant or quite absent.

Program 5 was characterized with the best results,

differing from other freezing programs with applica-

tion of ice crystal seeding procedure. The unsatisfac-

tory results obtained for other programs testify about

the presence of overcooling. Interesting results obtai-

ned after cryopreservation according to the program 2

where in spite of slow rate was no overcooling present.

The obtained data enable to assume that ChCC are

characterized with sufficiently high sensitivity to this

negative parameter of cryopreservation.

The main task of cryopreservation methods devel-

opment consists in providing the preservation of

амаргорП

яннавувреснокоiрк

noitavreserpoyrC

margorp

опнитiлкхинвитизопьтсiнвяаН

VInaduSюннавубраф

sllecevitisopVInaduSfoecneserP

еннатнопС

яннавюiцнерефид

енавокуднI

яннавюiцнерефид

ьлортноK

lortnoC

1--

2-±

3--

4-±

5-+

Таблиця 2. Вплив кріоконсервування на адипогенні

властивості кріоконсервованих ККХ (n = 6, M ± m)

Table 2. Cryopreservation effect on adipogenic properties

of cryopreserved ChCC (n = 6, M ± m)

Примітка: “+” – диференціювання понад 50% клітин; “±” –

диференціювання менш ніж 30% клітин; “–” – відсутність

диференціювання.

Note: “+” differentiation above 50% of cells; “±” – differentiation

below 30% of cells; “−” – no differentiation.

316

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

Література

Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков.– М.:

Мир, 1983.– 264 с.

Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной

адгезии человека // Успехи совр. биологии.– 1994.– Т. 144,

№6.– С.741–753.

Волкова Н.А., Петренко Т.Ф., Гончарук Е.И., Грищенко В.И.

Криоконсервированная суспензия клеток хориона как

перспективный ресурс для биотехнологий // Ветеринар-

ная патология.– 2007.– №4.– С. 236–238.

Гулевский А.К., Трифонова А.В., Петренко Т.Ф., Лаврик А.А.

Воздействие фракции из кордовой крови крупного рогато-

го скота (до 5 кДа) на пролиферативную активность клеток

in vitro после криоконсервации // Межвідомчий темат.-наук.

збірник "Ветеринарна медицина".– 2008.– С. 147–153.

Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании

клеток, мембран и липопротеинов.– М.: Наука, 1989.– 277 с.

Методы культивирования клеток: Сб. научных трудов /

Под. ред. Г.П. Пинаева.– Л.: Наука, 1988.– 287 с.

Скоробогатова Н.Г., Грищук В.П., Петренко А.Ю. Роль

переохлаждения в сохранении клоногенных свойств

фибробластоподобных клеток-предшественников эмб-

риональной печени человека после криоконсервирования //

Проблемы криобиологии.– 2006.– Т. 16, №1.–С. 24–31.

Суздальцев Ю.Г., Бурунова В.В., Вахрушев И.В. и др.

Сравнение способности к дифференцировке в ткани

мезодермального происхождения мезенхимальных кле-

ток человека, выделенных из разных источников // Кле-

точные технологии в биологии и медицине.– 2007.– №1.–

С. 3–10.

Bratanov M., Neronov A., Nikolova E. Limbal explants from

cryopreserved cadaver human corneas. Immunofluores-

cence and light microscopy of epithelial cells growing in

culture // Cryo-Letters.– 2009.– Vol. 30, N3.– P. 183–189.

Cargnoni A., Gibelli L., Tosini A. et al. Transplantation of

allogeneic and xenogeneic placenta-derived cells reduces

bleomycin-induced lung fibrosis // Cell Transplant.– 2009.–

Vol.18, N4.– P. 405–422.

10.

References

Adams R. Methods of cell culture for biochemists.– Moscow:

Mir, 1983.– 264 p.

Botsenovsky V.A., Baryshnikov A.Yu. Molecules of human

cell adhesion // Uspekhi Sovr. Biologii.– 1994.– Vol. 144, N6.–

P. 741–753.

Volkova N.A., Petrenko T.F., Goncharuk E.I., Grischenko V.I.

Cryopreserved suspension of chorion cells as perspective

resourse for biotechnologies// Veterinarnaya Patologiya.–

2007.– N4.– P. 236–238.

Gulevsky A.K., Trifonova A.V., Petrenko T.F., Lavrik A.A. Effect

of bovine cord blood fraction (to 5 kDa) on cell proliferative

activity in vitro after cryopreservation // Mezhvidomchyy

Temat. Nauk. Zbirnyk "Veterynarna meditsyna".– 2008.–

P. 147–153.

Dobretsov G.E. Fluorescence probes during investigation of

cells, membranes and lypoproteins.– Moscow: Nauka, 1989.–

277 p.

Methods of cell culturing: Coll. of Scientific Papers/ Ed. by

G.P. Pinaeva.– Leningrad: Nauka, 1988.– 287 p.

Skorobogatova N.G., Grischuk V.P., Petrenko A.Yu. Role of

overcooling in preserving clonogenic properties of fibroblast-

like progenitor cells of human embryonic liver after cryopre-

servation // Problems of Cryobiology.– 2006.– N1.– P. 24–31.

Suzdaltsev Yu.G., Burunova V.V., Vakhrushev I.V. et. al. Com-

parison of ability to differentiation in tissue of mesodermal

origin of human mesenchymal cells, derived from different

sources // Kletochnye technologii v biologii i meditsine.– 2007.–

N1.– P. 3–10.

Bratanov M., Neronov A., Nikolova E. Limbal explants from

cryopreserved cadaver human corneas. Immunofluores-

cence and light microscopy of epithelial cells growing in

culture // Cryo-Letters.– 2009.– Vol. 30, N3.– P. 183–189.

вування. Культивовані клітини хоріона характери-

зуються імунофенотипом мультипотентних мезен-

хімальних клітин і мають безперечні перспективи

в галузі клітинної терапії [10, 13]. Результати,

отримані в даній роботі, можуть бути основою для

створення кріобанку перспективних ліній клітин з

можливістю їх наступного використання для потреб

біотехнології.

Висновки

Досліджено вплив низькотемпературного кон-

сервування на такі морфофункціональні властивості

ККХ, як життєздатність, адгезія, проліферація та

спрямоване диференціювання. Розроблено опти-

мальний метод кріоконсервування культури клітин

хоріону. Програма 5, яка складається з охолодження

до –6°С зі швидкістю 1°С/хв, сидінгу з наступним

охолодженням до –80°С зі швидкістю 10°С /хв

забезпечує як добру збереженість популяції ККХ

в цілому, так і виживання фракції мультипотентних

клітин.

morphofunctional properties of bioobject suffering the

low temperature effects. The obtained results of

cryopreservation outcome for ChCC are conformed

to data of other authors [7,17] and testify the preser-

vation of their proliferative properties and differentia-

tion porential after cryopreservation. Cultured chori-

onic cells are characterized by immune phenotype of

multipotential mesenchymal cells and have doubtless

perspectives in cell therapy [10, 13]. The results, ob-

tained in this work, may ground the development of

cryobanks for perspective cell lines and their further

application in biotechnology.

Conclusions

The effect of low temperature preservation on mor-

phofunctional properties of ChCC such as viability,

adhesion, proliferation and directed differentiation was

studied. There has been developed the optimal method

of cryopreservation for chorion cell culture. The pro-

gram 5 comprising the cooling down to –6°C with the

rate of 1°C/min, ice crystal seeding with following cool-

ing down to –80°C with the rate of 10°C/min provides

both high integrity of ChCC population and survival of

the fraction of multipotent cells.

317

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

Chin S.P., Poey A.C., Wong C.Y. et al. Cryopreserved mesen-

chymal stromal cell treatment is safe and feasible for severe

dilated ischemic cardiomyopathy // Cytotherapy.– 2010.–

Vol. 12, N1.– P. 31–37.

Ferrari A., Hannouche D., Oudina K. et. al. In vivo tracking of

bone marrow fibroblasts with fluorescent carbocyanine dye //

J. Biomed. Mater. Res.– 2001.– Vol. 56, N3.– P. 361–367.

Haack-Sorensen M., Bindslev L., Mortensen S. et al. The

influence of freezing and storage on the characteristics and

functions of human mesenchymal stromal cells isolated for

clinical use // Cytotherapy.– 2007.– Vol. 9, N4.– P. 328–337.

Kar M., Ghosh D., Sengupta J. Molecular correlates of syncy-

tialization in muscle and placenta // Indian J. Physiol.

Pharmacol.– 2007.– Vol. 51, N4.– P. 311–325.

Maddalena S., Elsa V., Lucia G. et al. Isolation and characte-

rization of mesenchymal cells from human fetal membranes //

J. Tissue Eng. Regen. Med.– 2007.– Vol. 1, N4.– Р. 296–305.

Parolini O., Alviano F., Bagnara G.P. et al. Concise review:

isolation and characterization of cells from human term

placenta: outcome of the first international workshop on

placenta derived stem cells // Stem Cells.– 2008.– Vol. 26,

N2.– P. 300-311.

Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., et al. Multilineage

potential of adult human mesenchymal stem cells // Science.–

1999.– Vol. 284, N2.– Р. 143–147.

Woods E.J., Perry B.C., Hockema J.J. et al. Optimized cryo-

preservation method for human dental pulp-derived stem cells

and their tissues of origin for banking and clinical use //

Cryobiology.– 2009.– Vol. 59, N2.– P. 150–157.

Zippel N., Schulze M., Tobiasch E. Biomaterials and mesen-

chymal stem cells for regenerative medicine // Recent Patents

on Biotechnology.– 2010.– Vol. 4, N1.– P. 1–22.

Надійшла 13.04.2010

Рецензент Н.О. Волкова

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

Cargnoni A., Gibelli L., Tosini A. et al. Transplantation of

allogeneic and xenogeneic placenta-derived cells reduces

bleomycin-induced lung fibrosis // Cell Transplant.– 2009.–

Vol.18, N4.– P. 405–422.

Chin S.P., Poey A.C., Wong C.Y. et al. Cryopreserved mesen-

chymal stromal cell treatment is safe and feasible for severe

dilated ischemic cardiomyopathy // Cytotherapy.– 2010.–

Vol. 12, N1.– P. 31–37.

Ferrari A., Hannouche D., Oudina K. et. al. In vivo tracking of

bone marrow fibroblasts with fluorescent carbocyanine dye //

J. Biomed. Mater. Res.– 2001.– Vol. 56, N3.– P. 361–367.

Haack-Sorensen M., Bindslev L., Mortensen S. et al. The

influence of freezing and storage on the characteristics and

functions of human mesenchymal stromal cells isolated for

clinical use // Cytotherapy.– 2007.– Vol. 9, N4.– P. 328–337.

Kar M., Ghosh D., Sengupta J. Molecular correlates of syncy-

tialization in muscle and placenta // Indian J. Physiol.

Pharmacol.– 2007.– Vol. 51, N4.– P. 311–325.

Maddalena S., Elsa V., Lucia G. et al. Isolation and characte-

rization of mesenchymal cells from human fetal membranes //

J. Tissue Eng. Regen. Med.– 2007.– Vol. 1, N4.– Р. 296–305.

Parolini O., Alviano F., Bagnara G.P. et al. Concise review:

isolation and characterization of cells from human term

placenta: outcome of the first international workshop on

placenta derived stem cells // Stem Cells.– 2008.– Vol. 26,

N2.– P. 300-311.

Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., et al. Multilineage

potential of adult human mesenchymal stem cells // Science.–

1999.– Vol. 284, N2.– Р. 143–147.

Woods E.J., Perry B.C., Hockema J.J. et al. Optimized cryo-

preservation method for human dental pulp-derived stem cells

and their tissues of origin for banking and clinical use //

Cryobiology.– 2009.– Vol. 59, N2.– P. 150–157.

Zippel N., Schulze M., Tobiasch E. Biomaterials and mesen-

chymal stem cells for regenerative medicine // Recent Patents

on Biotechnology.– 2010.– Vol. 4, N1.– P. 1–22.

Accepted in 13.04.2010

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

318

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38

057) 373-31-26, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

3126, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 578.832.1.084.1:615.361.018.5.013.8.014.41

А.Н. ГОЛЬЦЕВ*, В.В. ВОЛИНА, Е.С. ОНАСЕНКО,

К.А. ГОЛЬЦЕВ, О.Ю. КОЖИНА, В.Л. ПОНОМАРЕВА

Инфицирование животных вирусом гриппа после предварительного

введения препарата “Криоцелл-гемокорд”.

Сообщение III. Изучение морфофункционального

состояния легких мышей

UDC 578.832.1.084.1:615.361.018.5.013.8.014.41

A.N. GOLTSEV*, V.V. VOLINA, E.S. ONASENKO,

K.A. GOLTSEV, O.YU. KOZHINA, V.L. PONOMAREVA

Infection Of Animals with the Influenza Virus After a Preliminary

Administration of Preparation "Cryocell-Haemocord".

Report III. Study of Morphofunctional State of Mice Lungs

Изучали влияние предварительного введения препарата "Криоцелл-гемокорд" на морфофункциональное состояние легких,

а также исследовали содержание вируса гриппа А/Виктория в органах мышей, инфицированных им в летальной дозе. Полученные

данные свидетельствуют о противовирусном действии препарата "Криоцелл-гемокорд", выражающемся в отсутствии

дистрофических и некротических нарушений в легких животных, инфицированных после его введения.

Ключевые слова: мыши, легкие, инфицирование вирусом гриппа, противовирусное действие препарата "Криоцелл-

гемокорд", морфологические исследования.

Вивчали вплив попереднього введення препарату "Кріоцелл-гемокорд" на морфофункціональний стан легень, а також

досліджували вміст вірусу грипу А/Вікторія в органах мишей, інфікованих їм в летальній дозі. Отримані дані свідчать про

противірусну дію препарату "Кріоцелл-гемокорд", яка виявляється у відсутності дистрофічних і некротичних порушень у

легенях тварин, інфікованих після його введення.

Ключові слова: миші, легені, інфікування вірусом грипу, противірусна дія препарату "Кріоцелл-гемокорд", морфологічні

дослідження.

There has been studied the effect of preliminary adminstration of "Cryocell-Haemocord" preparation on morphofunctional state

of lungs, as well as there was investigated the content of influenza virus A/Victoria in murine organs infected with it in a lethal dose.

The findings testify to an anti-viral effect of "Cryocell-Hemocord" preparation, manifesting in the absence of dystrophic and necrotic

impairments in lungs of the animals infected after its introduction.

Key words: mice, lungs, infection with influenza virus, antiviral effect of preparation “Cryocell-Haemocord”, morphological studies.

The carried-out studies have shown that application

of "Cryocell-Haemocord" preparation, which is cryo-

preserved suspension of human cord blood nucleated

cells, suspended in autologous plasma [4], results in

long-term preventive effect providing insusceptibility

by the studied animals to influenza virus for 6 months

from the moment of its intranasal administration [1, 5].

Stimulating effect of preparation on immune com-

petent organs of mice prior to and after infection with

influenza virus has been established. Further study of

antiviral effect of preparation to examine its efficiency

Проведенные исследования показали, что при-

менение препарата "Криоцелл-гемокорд", который

является криоконсервированной суспензией ядро-

содержащих клеток кордовой крови человека, взве-

шенных в аутологичной плазме [4], приводит к

долгосрочному профилактическому эффекту, обес-

печивающему невосприимчивость исследуемых

животных к вирусу гриппа в течение 6 месяцев с

момента его интраназального введения [1, 5].

Было установлено стимулирующее действие

препарата на иммунокомпетентные органы мышей

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

криомедицина, клиническая

и экспериментальная

трансплантология

cryomedicine, clinical

and experimental

transplantology

319

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

as non-specific mean of influenza prevention is of evi-

dent interest.

The research aim is to determine the content of

influenza virus in organs of the mice infected after

preliminary introduction of "Cryocell-Haemocord"

preparation, as well as histological examination of their

lungs.

Materials and methods

Strain of influenza virus A/Victoria provided by

R&D Institute of Grippe of Russian Academy of

Medical Sciences (St. Petersburg) was subjected to 6

passages in white mice and 2 passages in chicken emb-

ryos. The titer of hemagglutinins of infected allantoise

fluid was 1:512, infection titer was 10

50/10

Experiments were carried-out in 2 months' breedless

white mice in accordance with the statements of

"European convention on the protection of vertebrate

animals used for experimental and other purposes"

(Strasbourg, 1985). All surgical invasions in animals

including decapitation were done under inhalation ether

narcosis.

Experimental animals were divided into control and

research groups:

C1, mice intrasally administered with influenza virus

in a dose of 0.05 ml LD

100/10

;

C2, mice intranasally administered with "Cryocell-

Hemocord" preparation in a dose of 0.05 ml;

C3, intact mice;

E1, mice infected with influenza virus to the 2

day after preparation introduction;

E2, mice infected with influenza virus to the 7

day after preparation introduction;

E3, mice infected with influenza virus to the 30

day after preparation introduction.

Each group consisted of 18 animals.

To the 2

, 5

, 7

and 10

days after infection the

virus content in lungs and blood serum of the animals

of all experimental groups was examined.

In the research the standard virusological and sero-

logical methods were used [3]. The presence of influen-

za virus and its titers in lungs and blood serum of

animals was examined by means of hemagglutination

reaction (HAR). The volume of HAR ingredients made

0.05 ml. 0.05 ml of 1% suspension of human erythro-

cytes of blood group I(0) were added to the wells.

The preparing of lungs to HAR comprised the frag-

mentation of lung tissue with scissors and following

hard homogenization in physiological solution. Homoge-

nized material was centrifuged at 1,500 rpm for 20 min.

Virus presence was assessed in supernatant liquid. The

sequence of gradual two-fold dilutions of the studied

material was made in the wells of plastic plate. Two

control wells were filled with physiological solution.

до и после инфицирования вирусом гриппа.

Безусловный интерес представляет дальнейшее

изучение противовирусного действия препарата для

определения степени его эффективности как неспе-

цифического средства профилактики гриппа.

Цель работы – определение содержания вируса

гриппа в органах мышей, инфицированных после

предварительного введения препарата "Криоцелл-

гемокорд", а также проведение гистологического

исследования их легких.

Материалы и методы

Штамм вируса гриппа А/Виктория, который был

предоставлен НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петер-

бург, Россия), прошел 6 пассажей на белых мышах

и 2 пассажа на куриных эмбрионах. Титр гемагглю-

тининов инфицированной аллантоисной жидкости

был 1:512, инфекционный титр – 10

50/10

Эксперименты проводили на 2-месячных беспо-

родных белых мышах в соответствии с положения-

ми "Европейской Конвенции о защите позвоночных

животных, используемых для экспериментальных

и других научных целей" (Страсбург, 1985). Все

оперативные вмешательства на животных, включая

декапитацию, проводили под ингаляционным эфир-

ным наркозом.

Экспериментальные животные были разделены

на контрольные и опытные группы:

К1 – мыши, которым интраназально вводили

вирус гриппа в дозе 0,05 мл LD

100/10

;

К2 – мыши, которым интраназально вводили

препарат "Криоцелл-гемокорд" в дозе 0,05 мл;

К3 – интактные мыши;

О1 – мыши, инфицированные вирусом гриппа

на 2-е сутки после введения препарата;

О2 – мыши, инфицированные вирусом гриппа

через 7 суток после введения препарата;

О3 – мыши, инфицированные вирусом гриппа

через 30 суток после введения препарата.

Каждая группа состояла из 18 животных.

На 2, 5, 7 и 10-е сутки после инфицирования

определяли содержание вируса в легких и сыворот-

ке крови животных всех экспериментальных групп.

В работе использовали стандартные вирусологи-

ческие и серологические методы исследований [3].

Наличие вируса гриппа и его титр в легких и сыво-

ротке крови животных определяли с помощью реак-

ции гемагглютинации (РГА). Объем ингредиентов

РГА составлял 0,05 мл. Во все лунки добавляли

также по 0,05 мл 1%-й взвеси эритроцитов человека

группы крови I (0).

Подготовка легких к проведению РГА включала

измельчение ткани легких ножницами и последую-

щую жесткую гомогенизацию в физиологическом

асуривртиТ

)АГРоп(

retitsuriV

)RAH(

оитсомисивазвппургхыньлатнемирепскэхынтовижеинеледерпсаР %,асуривартитт

%,retitsurivnognidneped,spuorglatnemirepxefoslaminafonoitubirtsiD

котус2

syad2

котус5

syad5

котус7

syad7

котус01

syad01

1О

2О

3О

1О

2О

3О

1О

2О

3О

1О

2О

3О

йынвитагеН

evitageN

6,671,873,6704,086,274,5703,871,28080 00100179-

2:14,329,127,32446,914,726,4207,129,7102 0003-

4:1 0000000 8,27 000 2,16 000-

8:100065 000 2,72 000 8,83 000-

320

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

After adding of 1% suspension of thrice washed hu-

man erythrocytes the mixtures in the wells were

accurately mixed and incubated in thermostat at 37°C

for 45 min. The last dilution, under which HAR was

found not less than by two crosses, was assumed as

virus titer.

To produce histological preparations the lung frag-

ments of experimental animals were fixed in 10%

formalin, washed with running water, dehydrated in

alcohols of ascending concentrations, cleared in xylol

and embedded into paraffin.

Microtome slices of 5–7 micron width from paraffin

blocks were stained with hematoxylin and eosin to

obtain demonstrative histological samples.

Results and discussion

In the serum of peripheral blood of the animals of

C1 group the virus was found in 100% of cases.

Maximum titer of virus made 1:8 in 56% of animals of

this group to the 2

day after infection. In the animals

of experimental groups introduced with "Cryocell-

Haemocord" prior to the infection the maximum titer

of virus was 1:2. High percent in these groups made

the animals in those the influenza virus in serum of

peripheral blood was not found. The obtained results

are shown in Table 1.

The next research stage was determination of the

content of virus in murine lungs at various stages of

viral infection development.

Maximum hemagglutinating virus titer (1:64) was

found in lungs of 35.8% control animals to the 7

day

of development of viral infection. To the 10

observa-

tion day the death of animals of the group C1 made

100%. It was noted the different extent of damage of

pulmonary tissue in the animals of various experimental

растворе. Гомогенизированный материал центри-

фугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин.

Вирус определяли в надосадочной жидкости. В

лунках планшета готовили последовательные

двукратные разведения исследуемого материала.

В эксперимент включали две контрольные лунки с

физиологическим раствором. После внесения 1%-й

взвеси трижды отмытых эритроцитов человека

смесь в лунках аккуратно перемешивали и инку-

бировали в термостате при 37°С в течение 45 мин.

За титр вируса принимали последнее разведение,

в котором определялась РГА не менее, чем на два

креста.

Для изготовления гистологических препаратов

фрагменты легких экспериментальных животных

фиксировали в 10%-м формалине, промывали про-

точной водой, обезвоживали в спиртах возрастаю-

щей концентрации, просветляли в ксилоле и зали-

вали в парафин. Микротомные срезы толщиной 5–

7 микрон из парафиновых блоков окрашивали гема-

токсилином и эозином для получения обзорных

гистологических препаратов.

Результаты и обсуждение

В сыворотке периферической крови животных

группы К1 вирус определялся в 100% случаев.

Максимальный титр вируса составлял 1:8 у 56%

животных этой группы на 2-е сутки после инфициро-

вания. У животных экспериментальных групп, кото-

рым перед инфицированием вводили препарат

"Криоцелл-гемокорд", максимальный титр вируса

был 1:2. Большой процент в этих группах составляли

животные, у которых вирус гриппа в сыворотке

периферической крови не определялся. Полученные

результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1. Титр вируса гриппа в сыворотке периферической крови мышей

на разных этапах развития вирусной инфекции

Table 1. Titer of influenza virus in serum of peripheral blood of mice

at different developmental stages of viral infection

Примечание: “–” – все животные погибали.

Notes: “–” – all animals died.

асуривртиТ

)АГРоп(

retitsuriV

)RAH(

оитсомисивазвппургхыньлатнемирепскэхынтовижеинеледерпсаР %,асуривартитт

%,retitsurivnognidneped,spuorglatnemirepxefoslaminafonoitubirtsiD

котус2

syad2

котус5

syad5

котус7

syad7

котус01

syad01

1О

2О

3О

1О

2О

3О

1О

2О

3О

1О

2О

3О

йынвитагеН

evitageN

3,388,774,8502,277,662,1504,490,080,8600010010,39-

2:17,617,614,6201,117,612,822,76,53,318,21 000 0,7-

4:105,52,511,117,91,110,510,2107,60,01 0000-

8:10002,710,75,56,57,8002,50,21 000-

61:10008,12 000 4,32000,41,81 000-

23:10006,72 000 4,82 000 1,43 000-

46:10003,22 000 3,02 000 8,53 000-

321

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

groups. Lungs of the animals of experimental groups

E1 and E2 were impaired slightly, only rare local bleed-

ings were revealed. Maximum titer of influenza virus

in murine lungs of these groups to the 5

day after

infection was 1:8. Lungs of animals in the group E3

were damaged in a greater extent (10–20% of lungs

surface). Maximum titer of influenza virus 1:16 was

found in 4% of animals to the 7

day after infection.

The results of the assessment of pathological material

(lungs), isolated from the animals under investigation

are shown in Table 2.

Basing on the carried-out studies it has been estab-

lished that influenza virus A/Victoria was not found in

the majority of animals (83.3%) of the group E1. These

data testify to the fact that the highest effect of the

application of "Cryocell-Haemocord" preparation is

manifested if infection of animals was performed in a

short period (48 hrs) from the preparation introduction.

However, antiviral effect of preparation was preseved

within a month, becoming slightly weaker.

During infection of mice with adapted to them

influenza virus strains the infection process develops

in their lungs causing, as a rule, hemorrhagic pneumonia

with focal or confluent tissue "hepatization" [2]. Visual

investigation of pathological material, isolated during

experiment, confirms this. Hemorrhagic pneumonia

injury of 60–90% pulmonary tissue was found

macroscopically in animal lungs in the group C1.

Histological investigations of lung preparations in

the control groups C2 and C3 revealed almost no

Следующим этапом исследования было опреде-

ление содержания вируса в легких мышей на

разных этапах развития вирусной инфекции.

Максимальный гемагглютинирующий титр ви-

руса (1:64) определялся в легких у 35,8% контроль-

ных животных на 7-е сутки развития вирусной

инфекции. К 10-м суткам наблюдения гибель

животных группы К1 составляла 100%. Необходи-

мо отметить различную степень поражения легоч-

ной ткани у животных разных экспериментальных

групп. Легкие животных опытных групп О1 и О2

были поражены незначительно, лишь изредка выяв-

лялись точечные кровоизлияния. Максимальный

титр вируса гриппа в легких мышей этих групп на

5-е сутки после инфицирования был 1:8. Легкие

животных в группе О3 были поражены в большей

степени (10–20% поверхности легких). Макси-

мальный титр вируса гриппа 1:16 определялся у 4%

животных на 7-е сутки после заражения. Результа-

ты изучения патологического материала (легкие),

выделенного у исследуемых животных, приведены

в табл. 2.

На основании проведенных исследований уста-

новлено, что вирус гриппа А/Виктория не опреде-

лялся у большинства животных (83,3%) группы О1.

Эти данные свидетельствуют о том, что наиболь-

ший эффект от применения препарата "Криоцелл-

гемокорд" выявляется в более короткий срок (2-е

суток) от его введения до инфицирования живот-

ных. Однако противовирусный эффект препарата

Таблица 2. Титр вируса в легких животных, зараженных вирусом гриппа после введения

препарата "Криоцелл-гемокорд", в разные сроки исследования

Table 2. Titer of virus in lungs of the animals infected with influenza virus after introduction

of “Cryocell-Hemocord” preparation at different terms of study

Примечание: “–” – все животные погибали.

Notes: “–” – all animals died.

322

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

difference between them: in both cases the normal

structure of the organ was observed. The sites of lungs

with sections of small bronchi were found in prepara-

tions (Fig. 1a, b).

Lung parenchyma was of laced appearance as it

was mainly composed of the thin-wall terminal alveolar

sacs (alveoli) sections. Small bronchi were layered with

cubic epithelium. The layer of smooth muscles was

located beyond the bronchi coat. In submucous layer

of small bronchi a single small gland bundles were

found. With lessening of bronchi caliber the glands

completely disappeared. Small bronchi were accompa-

nied with bronchial arteries, the sections of which were

constantly found nearby. Pulmonary veins, containing

in their walls a big amount of smooth muscles, were

similar with arteries by their structure, but were located

independently on bronchi. Respiratory regions of lungs

(acini) began with respiratory (alveolar) bronchioles

and followed by smallest bronchi. Alveolar bronchioles

being the parts of acinus were layered with cubic

epithelium, interchanged with alveolar protrusion and

had a very thin wall. No muscles were found in the

walls of alveolar bags. The majority of lung sections

were the cross-sections of alveolar pathways and

terminal alveoli which were variously extended.

Sponge-like structure was preserved in 5 days only

in small areas on the lung edge in parenchyma of the

group C1 mice; however, alveoli in these areas were

unevenly stretched, and the wall ruptures were obser-

сохраняется на протяжении 1

месяца, становясь несколько

слабее.

При заражении мышей

адаптированными к ним

штаммами вируса гриппа

инфекционный процесс раз-

вивается у них в легких, вы-

зывая, как правило, геморра-

гическую пневмонию с оча-

говым или сливным "опече-

нением" ткани [2]. Визуальное

исследование патологичес-

кого материала, выделяемо-

го в ходе эксперимента, под-

тверждает это. Макроскопи-

чески в легких животных

группы К1 определялось по-

ражение геморрагической

пневмонией 60–90% ткани

легких.

При гистологическом ис-

следовании препаратов лег-

ких контрольных групп

животных К2 и К3 было

Рис. 1. Легкие мышей: а – через 5 суток после введения препарата "Криоцелл-

гемокорд" (группа К2); б – интактные животные (группа К3). Окраска

гематоксилином и эозином, ×100.

Fig. 1. Lungs of mice: a – in 5 days after introduction of “Cryocell-Hemocord”

preparation (group C2); b – intact animals (group C3). Staining with hematoxylin and

eosin, ×100.

а a

б b

установлено, что они практически не отличались

между собой: в обоих случаях определялось

нормальное строение этого органа. На препаратах

обнаруживались участки легких с разрезами

малых бронхов (рис. 1, а, б).

Паренхима легких имела ажурный вид вслед-

ствие того, что основную массу их составляли

разрезы тонкостенных концевых альвеолярных

мешочков (альвеол). Малые бронхи были выст-

ланы кубическим эпителием. За их собственной

оболочкой залегал слой гладких мышц. В подсли-

зистом слое малых бронхов встречались отдель-

ные небольшие пакеты желез. С уменьшением

калибра бронхов железы абсолютно исчезали. Ма-

лые бронхи сопровождались бронхиальными

артериями, разрезы которых постоянно встреча-

лись около них. Легочные вены, содержащие в

своих стенках большое количество гладких мышц,

по своему строению были схожи с артериями, но

проходили независимо от бронхов. Респираторные

отделы легких (ацинусы) начинались респира-

торными (альвеолярными) бронхиолами, в которые

переходили мельчайшие бронхи. Альвеолярные

бронхиолы, являющиеся отделами ацинуса, кото-

рые были выстланы кубическим эпителием и чере-

довались с альвеолярными выпячиваниями, имели

очень тонкую стенку. В стенках альвеолярных

мешочков мышц уже не наблюдалось. Большая

часть срезов легких была занята разрезами аль-