Журнал. Биотехнология. Теория и практика

Подождите немного. Документ загружается.

характеристики полученных конъюгатов

определялись методом латексагглютинации

с положительными и отрицательными

контрольными антигенами.

В результате проведенных исследований

было выявлено, что при соотношении

моноклональных антител и латекса в

конъюгате 3:1, т.е. на 3 мг латекса 1 мг

антител, в реакции латексагглютинации

выявлялось 500 мкг вирусного антигена. При

использовании соотношения 3:2 выявлялось

60 мкг вирусных антигенов. Дальнейшее

увеличение концентрации моноклональных

антител не приводило к значительному

увеличению чувствительности латексного

конъюгата (рисунок 1).

Рис. 1. График чувствительности латексного

коньюгата в зависимости от концентрации МКА

Анализ результатов конъюгации моно

клональных антител с латексными частица

ми показал, что наиболее оптимальной

концентрацией моноклональных антител и

модифицированных латексных частиц

является соотношение 3:2. При этом реакции

латексагглютинации с контрольными

антигенами и исследуемыми пробами

показали одинаковые результаты оптималь

ного соотношения МКА и латекса.

При подготовке мембраны для иммо

билизации использовали лист Hi-flow Mylar

для обеспечения стабильности нитро

целлюлозных мембран, так как используе

мые мембраны не устойчивы к механи

ческим воздействиям.

При подготовке нитроцеллюлозной

мембраны важным показателем является

концентрация моноклональных антител и

контрольных антигенов, иммобилизуемых

на мембране. С этой целью моноклональные

антитела были иммобилизованы на

мембрану в концентрации 0,25, 0,5, 1 и 2

мг/мл. Антигены были иммобилизованы в

концентрации 100 мкг, так как, согласно

теоретическим данным, концентрации

антигенов, иммобилизуемых на мембране

для иммунохроматографии ниже 100 мкг/мл,

не являются актуальными и могут приводить

к ложноотрицательным результатам. Приго

товленные таким образом стрипы обраба

тывали положительными контрольными

антигенами и латексным конъюгатом.

Результаты представлены на рисунке2.

Анализ полученных результатов показы

вает, что наиболее оптимальной концентра

цией моноклональных антител, иммуно

билизуемых на нитроцеллюлозную мем

брану, является 1 мг/мл.

Рис. 2. Чувствительность реакции в

зависимости от концентрации МКА

Блокирование свободной поверхности

мембраны необходимо для предотвращения

неспецифического связывания реагентов. В

качестве блокирующих реагентов исполь

зуют желатин 0,1-0,5% концентрации, 1-2%

казеин, 1-2% бычий сывороточный

альбумин, 1-2% IgG и т.д. В качестве

блокирующего раствора наиболее оптималь

ные результаты показал бычий сывороточ

ный альбумин в концентрации 1-2%.

Другим важным компонентом теста

является стекловолокнистый ватман, пропи

танный латексным конъюгатом. Для этого

-олученный латексный конъюгат диали

зовали в 2 мМ боратном буфере (pH 7,2),

содержащем 5% сахарозы, и пропитывали

полоску стекловолокна размером 1 см .

Пропитанные латексным конъюгатом

кусочки стекловолокна высушивали при

37°С в течение2 часов.

С целью определения рабочего разведе

Биотехнология. Теория и практика. № 20092

ния латексного конъюгата использовали

метод иммунохроматографии со стекло

волокнистым ватманом, пропитанным

различными концентрациями латексного

конъюгата.

Для этого готовили 10 стрипов со

стекловолокнистыми ватманами, содер

жащими конъюгат в разведении 1:100, 1:200,

1:400, 1:800 и 1:1600. После этого 100 мкл

положительного контрольного антигена с

концентрацией антигена 10 мкг/мл

разводили в 5 мл буфера для образцов.

Конечная концентрация антигена в буфере

составляла 200 нг/мл.

Затем 4 капли буфера для образцов с

растворенными антигенами вируса перено

сят на стеловолокнистый ватман для

образцов, расположенных на стрипе. Через

20 минут учитывают результат, при этом

если на стрипе проявились две полосы после

высыхания, то исследуемая проба считается

положительной, если только одна нижняя

полоса - проба считается отрицательной.

Полученные результаты свидетельствуют,

что тест-система работает правильно. В

Таблица 1

Температурные и временные параметры высушивания мембран

случае отсутствия нижней полосы при

различных вариантах реакция считается

недействительной.

Для фиксации подготовленных реагентов

(конъюгата, моноклональных антител или

антигенов) на мембранах проводили процесс

высушивания при 37°С в течение 2 часов, как

оптимальных параметров сушки компонен

тов. Результаты исследований параметров

высушивания приведены в таблице 1.

В результате проведенных исследований

было выявлено, что наиболее оптимальным

разведением латексного конъюгата для

пропитывания стекловолокнистого ватмана

является разведение 1:200, которое обеспе

чивает появление четкой линии латекса

глютинации на нитроцеллюлозной мембра

не. Более высокие разведения конъюгата не

обеспечивали свечение полной полосы на

нитроцеллюлозной мембране. А при

использовании конъюгата в разведении

1:1600 реакция отсутствовала даже на

контрольной полосе.

Температура, °С Время высушивания,

Комментарии

15-25 > 16

Может потребоваться больше

времени

35-40 1-2 Сохраняет свойства антител

45-55 <0,5

Большинство антител сохраняет

свойства, быстрая сушка

Из таблицы 1 видно, что оптимальными условиями высушивания мембран является

температура 37°С. Оптимальное время высушивания 2 часа. Данные условия позволяют

сохранять свойства иммунореагенов.

С целью определения минимальной концентрации вирусов выявляемой тест-системой

проводили реакцию иммунохроматографии с различными концентрациями вирусных

антигенов. В результате было выявлено, что тест-система, подготовленная на основе

моноклональных антител к вирусу ящура, выявляла антиген в концентрации 0,06 мкг/мл

(рисунок3).

Биотехнология. Теория и практика. № 20092

Рис. 3. Концентрация антигена, выявляемая

тест-системой

Для определения специфичности

разработанной тест-системы на основе

моноклональных антител против вируса

ящура проведен сравнительный анализ

реакции иммунохроматографии, иммуно

ферментного анализа и реакцией связывания

комплемента с использованием гомо

логичных и негомологичных вирусов

(таблица2).

Таблица 2

Изучение специфичности реакции иммунохроматографии на основе

моноклональных антител против вируса ящура

Антигены РИХ ИФА РСК

Вирус бешенства штамм «Ovis» - - -

Вирус бешенства, выделенный из патматериала - - -

Вирус ящура (серотип А

) +++

Вирус ящура (серотип О

) +++

Вирус Гамборо - - -

ВирусМарека ---

Вирус везикулярного стоматита - - -

Как следует из таблицы 2, реакция

иммунохроматографии на основе моно-

клональных антител выявляет только гомо-

логичные вирусы, что свидетельствует о ее

специфичности.

Аналогичные результаты были получены

иммуноферментным анализом и реакцией

связывания комплемента. Однако из-за

высокой чувствительности ИФА и РСК час-

то дают ложноположительные результаты.

Кроме того, ELISAи РСК обычно требует ла-

бораторного оборудования, квалифициро-

ванных кадров и не могут использоваться как

тесты для полевых условий [11, 12].

Выводы

На основании полученных результатов

можносделатьвывод,чтоотработана

технология производства иммуно-

хроматографической тест-системы на

основе моноклональных антител к вирусу

ящура. Разработанные хроматографические

тесты не уступают по своим диагнос-

тическим характеристикам иммуно-

ферментному анализу, а простота поста-

новки реакции позволяет проводить

диагностикув полевых условиях.

Биотехнология. Теория и практика. № 20092

Литература

1. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines forTerrestrial. OIE.Accessed 28 December, 2005.

2. Recommended laboratory tests to identify avian influenzaA virus inspecimens from humans.

WHO. - 2005.

3. Snyder,D.B. Latest developments in the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) //

Avian Dis. – 1986. – 30(1). – Р. 19-23.

4. Shafer A.L., Katz J.B., Eernisse K.A. Development and validation of acompetitive enzyme

linked immunosorbent assay for detection of typeAinfluenza antibodies in avian sera //Avian Dis. –

1998. – 42(1). – Р. 28-34.

5. Scott M.R., Nigel P., Geoffrey H., Lennart A. Development of a rapid chromatographic strip

test for the pen-side detection of foot-and-mouth disease virus antigen // Journal of Virological

Methods. – 2001. – 96. – Р. 189–202.

6. Егоров А.М. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. – М.: Высшая

школа,1991. - 288 c.

7. Heeschen C., Goldman B.U., Moeller R.H., et al. Analytical performance and clinical

application of a new rapid be dside assay for the detection of serum cardiactropon in T // Clin. Chem.

– 1998. – 44(9). – Р. 1925-1930.

8. Toshio W., Yuichi O., Hidekazu M., et al. Development of a simple whole blood panel test for

detection of human heart-type fatty acid-binding protein // Clin. Biochem. – 2001. – 34(4). –

Р. 257-263.

9. Yu H., Wang Y.W., Chen L., et al. Development of test paper for rapid diagnosis of IBD //

Chinese Journal ofAnimalQuarantine. – 2004. – 21(4). – Р. 27-28.

10. Gao L.M., Tian F.L., Niu Z.H.X., et al. Development and preliminary application of rapid

test strip for Newcastle disease // Chinese Journal ofAnimal Quarantine. – 2004. – 21(8). – Р. 22-24.

11. Bishai F.R., Galli R. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to

influenza A and Band parainfluenza type 1 in sera of patients // J. Clin Microbiol. – 1978. – 8. –

Р. 648-656.

12. Julkunen I., Pyhala R., Hovi T. Enzyme immuno assay, complement fixation and

hemagglutination inhibition tests in the diagnosis of influenza A and B virus infections. Purified

hemagglutinin in subtype-specific diagnosis // J.Virol. Methods. – 1985. – 10. – Р. 75-84.

Түйін

Summary

Бұл мақалада ауыл шаруашылық жануарларының аусылын балау үшін моноклоналды антидене негізінде

иммунды хроматография реакциясын әзірлеудегі зерттеу нәтижелері берілген. Моноклоналды антиденелер мен

латекс бөлшектерінің оңтайлы қатынасы 1 мг-ға 3 мг құрайтыны айқындалды. Нитроцеллюлозалы мембранаға

ерітіндідегі моноклоналды антиденелерді иммобилиздеу үшін оңтайлы концентрациясы мл-ге 1 мг болып

табылады. Иммунды хроматография реакциясы мен дәстүрлі әдістермен балауды салыстыра талдау нәтижелері

алынған мәліметтердің ұқсастығын көрсетті.

In the given article described the research result of prepare immunochromatographic assay based on monoclonal

antibodies for diagnostics FMD in agricultural animals. It is fined out that, the optimum ratio of latex particles and

monoclonal antibodies is 3 mg to 1 mg respectively. Optimum concentration of monoclonal antibody in a solution for

immobilization on a nitrocellulose membrane is 1 mg in ml. The comparative analysis of results of traditional diagnostics

methods and immunochromatographic assay has shown analogousness of the obtained data.

Биотехнология. Теория и практика. № 20092

УДК 633.11.111: 631.147

ОСОБЕННОСТИ КАЛЛУСООБРАЗОВАНИЯ И РЕГЕНЕРАЦИИ В ПРОЦЕССЕ

АНДРОГЕНЕЗА ПШЕНИЦЫ IN VITRO

Л.Ф. Созинова

Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан КН МОН РК

В статье приведены данные цитологического анализа каллусных тканей, сформированных в культуре

пыльников мягкой пшеницы. Выявлены типы каллусных клеток в гаплоидном каллусе, показаны типы

изменений в процессе формирования андрогенных структур. C помощью цитологического анализа изучено

формирование каллусов из отдельных микроспор. Показано формирование меристематических зон, в которых

образуются меристемы корня, меристемы стебля, проводящиесистемы и формируется растение-регенерант.

lfsuv@mail.ru

При получении стабильных гомо

зиготных линий в биотехнологии растений

используют метод получения удвоенных

гаплоидов. В традиционной селекции сорта

сельскохозяйственных культур создаются

путем отбора растений из расщепляющихся

популяций. При этом отбор из ранних

поколений малоэффективен, особенно по

таким важнейшим признакам, как урожай

ность качество продукции, засухоустой

чивость. При использовании традиционных

методов селекции – гибридизации и отбора

селекционный процесс растягивается на

много генераций, что удлиняет время

создания нового сорта до 10-12 и более лет.

Один из методов биотехнологии - гаплоидия

позволяет расширить возможности селекции

и ускорить ее [1, 2]. Получают гаплоидные

растения в культуре пыльников или в

культуре микроспор. Пыльник является

специализированным генеративным

органом, основная функция которого связана

с формированием мужских гамет –

спермиев. Спорогенные клетки пыльников в

условиях в полной мере проявляют

свой морфогенетический потенциал.

Основным методом, наиболее широко

используемым на практике, является метод

культуры изолированных пыльников, осно

ванный на использовании процесса андро

генеза – образования гаплоидного растения

(спорофита) из микроспоры или клеток

пыльцевого зерна через формирование

зародышеподобной структуры – эмбриоида

(прямой андрогенез) или через образование

Введение

in vitro

каллусной ткани (непрямой андрогенез

). Уникальность андрогенеза

заключается в том, что спорогенные клетки

(в стадии микроспор или пыльцевых зерен),

предназначенные для образования гамето

фита, меняют программу развития и

формируютспорофиты [3, 4].

В работах Анапияева Б.Б. довольно

подробно изучены особенности путей

развития микроспор пшеницы в условиях

. Выделены два пути деления микроспор

– А и В. При развитии по пути А

образовывалось две неравных клетки –

вегетативная и генеративная. При развитии

по пути В – образовывались две равные

клетки. Также выявлено значительное

количество аномалий – большинство

микроспор приступает к делению

асинхронно, может происходить слияние

ядер, синхронное деление обеих клеток и

другиеявления[5].

В зависимости от пути деления микро

спор в изолированных пыльниках проис

ходит тот или иной тип морфогенеза – могут

образоваться эмбриоиды, глобулы или

каллусные ткани. В результате завершения

процесса морфогенеза могут регенерировать

растения [5, 6, 7].

Из литературных источников следует, что

процессы морфогенеза, регенерации

растений очень сильно зависят от генотипа

растений. Одни и те же условия могут

приводить к эффективной перестройке

морфогенеза у одного сорта и не давать

результатов на других сортах. У каждого

vitro in vitro

vitro

Биотехнология. Теория и практика. № 20092

генотипа имеется специфическая потреб

ность в факторах культивирования, которые

должны подбираться опытным путем

[8, 9, 10].

Выбор отзывчивых к андрогенезу

генотипов – важная в практическом

отношении задача. Облегчить ее решение

можно с помощью варьирования физиологи-

ческими факторами культивирования.

Одним из важных факторов культуры

пыльников является стадия развития

пыльцы. Только на определенных стадиях

развития пыльцы можно с высокой эффек-

тивностью индуцировать образование

гаплоидов – для злаковых культур это стадия

ранней, средней и поздней одноядерной

микроспоры [11, 12].

Таким образом, при введении пыльников

в культуру необходимо, чтобы в них

имелись спорогенные клетки, морфо

генетически компетентные к смене гаме-

тофитной программы развития на споро-

фитную. Такие клетки находятся на стадии

сильно вакуолизированной микроспоры. В

культуре эти микроспоры дают

начало андроклинным структурам –

эмбриоидам или каллусам, которые разви-

ваются в растения-регенеранты. При

инокуляции пыльников, содержащих споро-

генные клетки на поздних стадиях развития

– дву- и трехклеточного пыльцевого зерна,

повышается выход растений-альбиносов

[13].

Круглова Н.Н. с соавторами выделяют три

группы наиболее важных факторовпереклю

чения программы развития спорогенных

клеток по пути андрогенеза. Первый важный

фактор – оптимальная для стадии андроге

неза стадия развития спорогенной

клетки. Чаще всего оптимальной является

стадия сильновакуолизированной микро-

споры. Но некоторые авторы считают, что

более оптимальной на кукурузе, ячмене,

рисе, твердой пшенице является средняя

фаза микроспорогенеза – слабовакуо

лизированная микроспора. Саттарова Т.Н.

считает, что для кукурузы оптимальной

является фаза двуклеточного пыльцевого

зерна. Вопрос об оптимальной фазе развития

пыльцевых зерен для андрогенеза не

решен однозначно [7, 13].

in vitro

Анализ литературных источников пока-

зывает, что гаплоидная технология

является интенсивно развивающимся нап-

равлением биотехнологии растений. Раз-

работка и усовершенствование подходов к

получению и удвоению гаплоидного исход-

ного материала для селекции является

актуальной. Большая зависимость процесса

андрогенеза и регенерации гаплоидных

растений от генотипа, от внешних факторов

культивирования требует многочисленных

научных разработок, позволяющих опти-

мизировать различные этапы получения

удвоенных гаплоидов [14, 15].

Ценность дигаплоидных форм заклю

чается в том, что это стабильные генотипы,

не расщепляющиеся в потомстве, даже если

они получены на основе гибридов. При

получении дигаплоидов гибридные колосья

отбирались в фазу трубкования за 5-7 дней до

выхода колоса из влагалища флагового

листа, затем подвергались холодовой

обработке, в течение 7-10 дней при темпе-

ратуре +4 С. Для индукции андрогенеза

использовалась среда N6, содержащая 1,0

мг/л гормона 2,4-Д, 2 мг/л глицина, 90 г/л

сахарозы. Культивирование осуществлялось

в климатической камере, в темноте, при

температуре+26 С.

Цитологический анализ проводили на

давленных временных препаратах пыльни

ков, окрашенных красителем ацетокар

мином или красителем Гимзы. Фото

графировали изображение с помощью

видеокамеры, помещали фотоснимок в

компьютер. Анализ препаратов делали на

микроскопе Micros.

При цитологическом анализе пыльников

исходных для гаплоидии сортов и гибридов

мягкой пшеницы было установлено, что в

основном пыльники изолировали на стадии

одно- и двуядерных микроспор. Было

обнаружено несколько типов микроспор по

расположению ядра в клетке (рисунок 1).

in vitro

Материалы и методы

Результаты и обсуждение

Биотехнология. Теория и практика. № 20092

Рис. 1.

1-2 – фрагменты пыльника с микроспорами, вычлененные из цветка пшеницы (объектив 5х); 3 – строение

стенки пыльника (объектив 5х); 4-6 – микроспоры в пыльнике (объектив 10х); 7 – одноядерная стадия с

расположением ядра в центре клетки (объектив 20х); 8 – поздняя одноядерная стадия – микроспора

вакуолизирована,ядро расположено в противоположном от поры прорастания (объектив 20х); 9 - двуклеточное

пыльцевое зерно – после деления ядра микроспоры образовалось две гаплоидные клетки – вегетативная и

генеративная (объектив 20х); 10 – аномальная микроспора (объектив20х)

Типы развития микроспор в пыльниках пшеницы:

123

456

78910

У разных генотипов соотношение

оличества различных типов микроспор

было различным. Срезание колосьев

происходит на стадиях, когда тетрады

микроспор распадаются на отдельные

микроспоры, при этом микроспоры

увеличиваются, они находятся в периоде

интерфазы, который довольно длительный.

У микроспор в этот период ядра распо-

ложены в центре клеток, цитоплазма не

вакуолизирована. Постепенно происходит

вакуолизация микроспоры, меняется ее

оболочка – формируется экзина, энтина,

пора прорастания - оперкулум. Такие

микроспоры полярны. Они имеют два

полюса – внутренний, который соответ-

ствует месту связывания с тапетумом и

наружный - противоположный внутреннему

полюсу. На следующем этапе происходит

формирование пыльцевого зерна – мито-

тическое деление полярной сильно-

вакуолизированной микроспоры приводит к

возникновению двух гаплоидных клеток -

генеративной и вегетативной, что составляет

двуклеточное пыльцевое зерно.

Наблюдения за развитием микроспор

на питательной среде показало

изменение высыпавшихся из пыльников

микроспор: постепенно на части таких

микроспор формировались многоклеточные

структуры, дающие начало будущим

эмбриоидам (рисунок 2).

vitro

Биотехнология. Теория и практика. № 20092

12 3

456 7

Рис. 2.

1 – выход микроспор в среду культивирования через 3 дня после вычленения пыльника (объектив 5х); 2 –

микроспоры в среде культивирования через 5 дней после вычленения пыльника (объектив 10х); 3-5 –

микроспоры через 7 дней после вычленения пыльника (объектив 20х); 6 – микроспоры через 10 дней после

вычленения пыльника (объектив 20х); 7 – многоклеточные образования через 30 дней, окрашивание красителем

Гимзы (объектив 10х)

Вычленение пыльника после холодовой обработки на среду и развитие микроспор на

среде №6:

in vitro

Задача экспериментальной гаплоидии –

переключить микроспору с развития по

генеративному пути на спорофитный путь

развития. При этом используется такой

прием, как обработка холодом. При выдер-

живании срезанных колосьев в условиях

пониженных положительных температур в

пыльниках происходят значительные изме-

нения. Уже через неделю практически все

микроспоры отрываются от тапетума пыль-

ника и теряют с ним связь. Такие микро-

споры не делятся обычным путем с образо-

ванием двуклеточного и трехклеточного

123

456

789

Рис. 3.

1-3 – постепенное превращение

микроспор в каллусные клетки (объектив

10х); 4-5 – зоны деления клеток в

гаплоидном каллусе (объектив 20х);

6-8 клетки андрогенного каллуса

(объектив 10х); 9 – формирование

апикальных меристем в андрогеном

каллусе (объектив10х)

Образование гаплоидного

каллуса из микроспор на питательной

среде in vitro:

пыльцевого зерна, а их ядра претерпевают

равное деление, симметричное, что в

дальнейшем приводит к развитию или через

каллусогенез или через эмбриоидогенез.

Этого мнения придерживаются боль-

шинство исследователей, однако есть

работы, в которых сообщается о том, что

обработка холодом не влияет на выход

новообразований – эмбриоидов и каллусов.

С помощью цитологического анализа можно

проследить, как формируется гаплоидный

каллус (рисунок 3).

Биотехнология. Теория и практика. № 20092

Формирование каллусов происходит из

отдельных микроспор, которые теряют

дифференциацию, увеличиваются в разме-

рах, изменяют округлую форму на вытяну-

тую или становятся крупными, бесфор-

менными. Иногда в каллусе закладываются

меристематические очаги, что позволяет

развиваться каллусам по типу морфогенеза с

образованием меристемы корня, меристемы

стебля, проводящих систем. Такие каллусы

позволяют получить растениярегенеранты, с

гаплоиднымнаборомхромосом.

Рис. 4.

1 – андрогенные новообразования; 2 – гаплоидные

каллусы; 3 – гаплоидное растение-регенерант

Формирование гаплоидов in vitro:

Для удвоения числа хромосом исполь-

зуются пробирочные растения с сформиро-

вавшимися корешками, стеблями и несколь-

кими листочками. Обычно это начало фазы

кущения. Для колхицинирования нами с

целью удвоения числа хромосом исполь-

зуется метод, разработанный в Институте

биологии и биотехнологии (г. Алматы). В

пробирку с растением заливается 0,05%

раствор колхицина в 2% ДМСО с добав-

лением 10 мг/л гибберелловой кислоты. В

этом растворе растение выдерживается

приемы по удвоению и укоренению

растений-регенерантов. Для обработки

колхицином высаживали гаплоидные

растения в сосуды с гидрогелем, в которые

добавляли 0,1% раствор колхицина и

оставляли в геле на 5 часов. После

выдерживания в гидрогеле корешки промы-

вали проточной водой и пересаживали рас-

тения в аэропонную установку с целью фор-

мирования корневой системы (рисунок 5.).

Для создания влажной камеры растения

Рис. 5.

1 – гаплоидное растение из пробирки; 2 –

колхицинирование в гидрогеле; 3 – формирование

корневой системы в условиях аэропоники; 3 -

доращивание растений-регенерантов в почвогрунте

до получения семян

Колхицинирование и доращивание

дигаплоидных растений:

Заключение

Экспериментальная гаплоидия является

одним из перспективных направлений

современной биотехнологии растений.

Удвоенные дигаплоиды используются в

качестве стабильных гомозиготных линий

для селекционного процесса. Проблема

экспериментальной гаплоидии требует

всестороннего изучения, в том числе и на

цитологическом уровне. В работе изучены

этапы формирования каллусов из микроспор

в процессе культивирования изолированных

пыльников мягкой пшеницы. Изучено

формирование меристематических зон,

морфогенных структур в условиях

Подобраны эффективные приемы для

регенерации и удвоения хромосом в

гаплоидныхрастениях.

in vitro.

Постепенно из апикальной меристемы стеб-

ля начинает расти колеоптиле, появляется

первый лист и надземная часть растения

формируется так же, как и в условиях .

Из апекса корня формируется корневая

система.

in vivo

дов, они пассируются на среду для регене-

рации (рисунок 4). В каллусных тканях зак-

ладываются апексы побегов с почками. На

таких каллусах через несколько дней фор-

мируются корешки, которые связывают-ся с

апексами стеблясосудистыми элементами.

После образования каллусов и эмбриои-

высаживается во влажную камеру до

Корни опрыскивали раствором Кнопа с

добавлением ИУК. Эти приемы позволяют

получить семенное потомство у дигаплоид-

ных растений пшеницы.

5 часов, затем отмывается проточной водой и

укоренения. Также мы применили новые

накрывали пластиковым стаканом на 7 дней.

Биотехнология. Теория и практика. № 20092

Литература

1. ЖамбакинК.Ж. Гаплоидная биотехнология растений. – Алматы,2004. – 186 с.

2. Zhang J., Li D. Культивирование пыльников мягкой пшеницы // Ичуань, Hereditas. –

1984. – Vol. 6, № 3. – P. 18-23.

3. Henry Y., De Buiser J. Wheat anther culture:Agronomic performance of doubled haploid lines

and the release of a new variety “Florin”. – In. Biotechnology in agriculture and forestry wheat. –

Spting-Verlag, Berlin, Hidelberg, 1990. – Vol. 13. – P.285-345.

4. Chase S.S. Monohaploids and monohaploid-derivatives of maize ( L.) // Bot. Rev. –

1969. – Vol. 35, № 2. – P.117.

5. Анапияев Б.Б. Некоторые особенности путей развития микроспор пшеницы //

Известия Национальной академии наук Республики Казахстан. Серия биологическая. – 2003.

- № 1 (235). – С. 11-15.

6. Рахимбаев И.Р. Культура репродуктивных клеток и гаплоидная биотехнология

генетическогоулучшения растений // Биотехнология.Теорияи практика.– 1997. - № 3. –

С. 8-10.

7. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в

культуре изолированных пыльников злаков // Усп. совр. биологии. – 1995. – Т.115, № 6. –

С. 692-695.

8. Bajaj J.P.S. In vitro induction of haploids in wheat ( ) // Crop. Improv. – 1990. - Vol.

419, № 77. – P. 54-64.

9. Махновская М.Л., Лукьянюк С.Ф., Шерер Н.В., Игнатова С.А. Влияние питательной

среды на гаплопродукцию гибридов мягкой пшеницы. - Тезисы докл. Всесоюз. конф. по

биотехнологиизлаковых культур. – Алма-Ата, 1988. – С. 12-13.

10. Лаврова Н.В. Регенерация растений в культуре изолированных микроспор мягкой

пшеницы ( L.) озимых форм // 3-я Межд. науч. конф. «Биотехнология в

растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». – Москва, 2004. – С. 116-117.

11. Ding-Gang H., Jun Wen O. Callus and plantlet formation from cultured wheat anthers at

differentdevelopmental stages // Plant Sci. Lett. – 1984. – Vol. 33. – P.71-79.

12. Жамбакин К.Ж. Частота образования эмбриоидов и каллусов у различных сортов

яровой мягкой пшеницы в культуре пыльников // Тезисы докл. Всесоюз. конф. по

биотехнологиизлаковых культур. – Алма-Ата, 1988. – С. 18.

13. Cаттарова Т.Н. Аномалии развития пыльцевых зерен кукурузы в связи с андрогенезом

// Сельскохозяйственная биология. Серия биология растений. – 2002. - №3. –

С. 99-103.

14. Hu H., Huang B. Application of pollen derived plants to crop improvement // International

Review of Cytology. – 1987. – Vol. 107. – P.293-313.

15. Литовкин К.В. Андрогенез в культуре пыльников яровых сортов ячменя // Тезисы

докладов 8 Межд. конф. «Биология растительных клеток и биотехнология». –

Саратов,2003. – С. 185.

Zea mays

in vitro

T. aestivum

Triticum aestivum

in vitro

Tүйін

Summary

Мақалада жұмсақ бидай тозаңдары культурасынан түзілген каллус ұлпаларына жасалған цитологиялық анализ

мәліметтері келтірілген. Гаплоидты каллуста каллус ұлпаларының типтері анықталды, андрогенді құрылым

түзілу процесінде өзгеріс типтері көрсетілді. Цитологиялық анализ нәтижесінде жеке микроспоралардан түзілген

каллус ұлпалары зерттелді. Тамыр меристемасы, сабақ меристемасы, өткізгіш жүйелер және өсімдік-регенерант

түзілетін меристематикалық аймақ түзілуі көрсетілді.

The data of the cytologic analysis of callus tissue, which were formed in the anther culture of soft wheat presented in

the article. The types of callus cells in haploid calluses revealed. The types of changes during formation of androgenic

structures were demonstrated. By means of the cytologic analysis the formation of calluses from separate microspores

was studied. Formation of meristematic zones in which are formed a root meristems, a stalk meristems, spending

systems and the plantlets formation was studied.

Биотехнология. Теория и практика. № 20092