Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.6. Органогенез в культуре соматических тканей

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 201

Сомаклоны, у которых проявляется генетическая изменчивость, отно-

сят к сомаклональным вариантам.

Приняты следующие обозначения для растений-регенерантов или, со-

ответственно, для сомаклонов и их самоопыленных потомков:

R – растение-регенерант; R

и т. д. – первое, второе и последующие

самоопыленные поколения растения-регенеранта;

SC – сомаклон; SC

, SC

и т. д. – первое, второе и последующие само-

опыленные поколения сомаклона.

Сомаклональная изменчивость характеризуется высокой частотой му-

тирования. По данным корпорации DNA Plant Technology (США), до 15 %

регенерированных в культуре тканей растений томатов имели в потомстве

генетические изменения. При исследовании числа хромосом у растений-

регенерантов различных сортов пшеницы структурные изменения хромосом

обнаружены примерно у 25 % регенерировавших растений.

Сомаклональные изменения наследуются и связаны с простыми ген-

ными мутациями. Однако в настоящее время неизвестен конкретный генети-

ческий механизм, приводящий к нестабильности культивируемых клеток.

В различных исследованиях обнаружены многочисленные кариологические

нарушения у регенерантов – полиплоидия, анеуплоидия, фрагментирование

хромосом, хромосомные мосты, транслокации, делеции, инверсии, много-

численные хромосомные аберрации.

Условия in vitro являются стрессом для культивируемых клеток и тка-

ней. Это связано с изоляцией от целого организма его фрагментов и помеще-

нием их в новые условия.

В процессе культивирования наблюдается цитогенетическая и генети-

ческая гетерогенность клеточных культур, что определяется:

– клеточной гетерогенностью исходных эксплантов, связанной с уров-

нем их полисоматии (миксоплоидии);

– условиями культивирования, где ведущая роль в индуцировании кле-

точной изменчивости принадлежит фитогормонам.

Вследствие этого растения, регенерировавшие в условиях in vitro из

развивающихся соматических эмбриоидов или из стеблевых почек, могут ха-

рактеризоваться фенотипической и генетической изменчивостью.

Так, спектр фенотипического разнообразия у растений-регенерантов

более выражен, чем у их потомков, полученных после самоопыления. Это

связано с физиологическими нарушениями, происходящими в процессе куль-

тивирования на искусственной питательной среде и приводящими к подавле-

нию роста и развития растений, снижению их фертильности. Например, у ре-

генерантов ячменя и пшеницы можно наблюдать формирование сдвоенных

колосьев, супротивно расположенных листьев. Такие нарушения, как прави-

ло, не наследуются.

На основании изучения сомаклонов выявлены следующие механизмы,

которые могут объяснить сомаклональную изменчивость:

1) грубые кариологические нарушения (изменения числа хромосом –

полиплоидия, анеуплоидия; хромосомные перестройки – транслокации, де-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.6. Органогенез в культуре соматических тканей

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 202

леции, инверсии, дупликации), которые хорошо определяются цитологиче-

скими методами анализа;

2) хромосомные перестройки, не выявляемые при цитологическом ана-

лизе и квалифицируемые как точковые мутации;

3) соматический (митотический) кроссинговер и обмен сестринских

хроматид (наиболее хорошо изучено у томатов);

4) изменчивость цитоплазматических геномов;

5) амплификация и редукция генов;

6) активация ранее репрессированных (молчащих) генов;

7) активация мобильных элементов (изучено у отдельных моделей –

люцерны, табака, кукурузы) [11].

Таким образом, под термином «сомаклональная изменчивость» пони-

мают разнообразный спектр генетической, цитогенетической, молекулярной

изменчивости, обусловленный изменениями в ядерном или цитоплазматиче-

ских геномах в результате культивирования in vitro.

Выявлено несколько причин генетической нестабильности культиви-

руемых клеток. В большинстве случаев генетической основой сомаклональ-

ной изменчивости являются мутации единичных или небольшой группы ге-

нов доминирующего или рецессивного характера в ядерном, пластидном или

митохондриальном геномах [12

, 14]. Другой причиной может являться дли-

тельное пассирование тканевых и клеточных культур, приводящее к накоп-

лению в них генетических изменений.

Каждый из указанных выше механизмов, обусловливающих изменчи-

вость у сомаклонов, в определенной степени связан с другими и зависит от

нарушений клеточного цикла, которые индуцируются действием фитогормо-

нов, содержащихся в культуральной среде [5, 11, 13].

Экспериментально установлены следующие закономерности:

1. Регенеранты, развившиеся в результате непрямого эмбриогенеза или

органогенеза, характеризуются большей изменчивостью, чем регенеранты,

полученные в результате прямого эмбриогенеза или органогенеза.

2. С длительностью культивирования частота сомаклональной измен-

чивости у регенировавших растений увеличивается.

3. Степень изменчивости по частоте цитогенетических нарушений у

сомаклонов определяется жизнеспособностью растений.

Для выявления у сомаклонов изменений в виде точковых мутаций про-

изводят их скрещивание с исходными линиями и прослеживают расщепление

в ряду поколений.

Значительная часть сомаклональной изменчивости у мягкой пшеницы,

томатов, риса обусловлена стабильными генетическими изменениями сле-

дующего характера:

– у сомаклонов мягкой пшеницы и риса, например, выявлены измене-

ния по биохимическим и морфологическим признакам, находящиеся под мо-

ногенным (состав глиадинов, цвет зерновок) и полигенным (высота растений,

сроки колошения, урожайность) генетическим контролем;

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.6. Органогенез в культуре соматических тканей

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 203

– сомаклоны могут иметь изменения по ряду признаков, которые в по-

томстве группируются независимо;

– мутации у сомаклонов могут быть рецессивными, доминантными, ко-

доминантными;

– мутации, обнаруженные у сомаклонов мягкой пшеницы, могут затра-

гивать гены, локализованные во всех семи гомеологических группах хромо-

сом мягкой пшеницы;

– у сомаклонов томатов обнаружены новые генные мутации, ранее не

индуцированные в результате химического или радиционного мутагенеза;

– одиночные генные мутации у сомаклонов могут проявляться с отно-

сительно высокой частотой (в среднем в одном растении на каждые 20–25

растений-регенерантов).

Изменчивость митохондриального генома обнаружена у сомаклонов

разных растений. Наиболее хорошо это явление изучено у растений кукуру-

зы, регенерировавших из каллусной ткани незрелых зародышей. Анализ ми-

тохондриальной ДНК показал, что в структуре мт-ДНК сомаклонов про-

изошли изменения, которые определяли их высокую чувствительность к гри-

бу Helminthosporium maydis и которые не были выявлены у растений семен-

ных поколений.

Примером изменчивости пластидного генома, вызванной его делеция-

ми, служат многочисленные данные по получению альбиносов среди сома-

клонов пшеницы, риса, ячменя, сорго, кукурузы.

Амплификация (увеличение дозы гена, приводящее к возрастанию ко-

личества соответствующего фермента) описана в клетках суспензионной

культуры люцерны. Была выделена клеточная линия, которую по сравнению

с исходной характеризовала более высокая устойчивость к гербициду фос-

финотрицину.

Таким образом, сомаклональную изменчивость можно рассматривать

как один из источников увеличения генетического разнообразия растений.

Ткани, образованные «привыкшими» клетками, которые приобретают

способность расти без гормонов (становятся автономными по отношению к

экзогенным цитокининам и ауксинам), называются гормоннезависимыми.

Еще их называют химическими опухолями. «Привыкшие» ткани, как и опу-

холевые, в большинстве случаев не способны к нормальной регенерации и

образуют лишь тератомы, хотя в отдельных случаях формируются и регене-

ранты. В таких тканях, как и в опухолевых, наблюдается интенсивный синтез

собственных гормонов, поэтому они не нуждаются во внесении их в пита-

тельную среду.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.6. Органогенез в культуре соматических тканей

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 204

Кроме «привыкших» тканей существуют опухоли растительного про-

исхождения, вызванные бактериями, вирусами, а также генетические опухо-

ли, возникающие на межвидовых гибридах различных растений. Наиболее

распространенными в природе и представляющими интерес для исследовате-

лей являются корончатые галлы-опухоли, индуцированные у двудомный рас-

тений агробактериями (Agrobacterium tumefaciens). Часто встречаются еще

два вида истинных опухолей у растений – бородатый корень (Agrobacterium

rhizogenes) и стеблевой галл (Agrobacterium rubi), сходный с корончатым

галлом [3

, 8, 12].

Общим свойством химических и природных опухолей растений явля-

ется их гормоннезависимость. Внешне и те, и другие ткани сходны с каллус-

ными. У «привыкших» тканей гормоннезависмость достигается в результате

изменения активности генов, отвечающих за синтез ферментных белков, уча-

ствующих в построении молекул гормонов, следовательно, в конечном счете

отвечающих за синтез гормонов. Таким образом, изменения в данном случае

носят эпигенный характер, хотя нельзя исключить и возможность мутации.

В опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в раститель-

ную клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс.

В 40-х гг. Браун показал, что ткани корончато-галловой опухоли даже в

отсутствие агробактерий (например, после гибели под воздействием высоких

температур) сохраняют опухолевые свойства. На искусственной среде эти

ткани продолжают активно пролиферировать. Ткани корончатых галлов со-

держат более высокие уровни ауксинов, чем нормальные, и продуцируют не-

сколько цитокининов.

В 1977 г. Чилтон показал, что опухоли корончатого галла возникают в

результате включения определенного фрагмента Ти-плазмиды (Т-ДНК) агро-

бактерий в растительную ядерную ДНК. Таким образом, сегмент Ти-

плазмиды интегрируется в хромосому и становится частью наследственного

аппарата трансформированной (опухолевой) растительной клетки. Гормонне-

зависимость, являющаяся следствием экспрессии генов, контролирующих

синтез ауксинов и цитокининов, приводит к дедифференцировке и пролифе-

рации клеток. Путь синтеза этих гормонов в опухолевых клетках более про-

стой и короткий, чем в нормальных и «привыкших» клетках.

Кроме ауксинов и цитокининов Т-ДНК детерминирует синтез галлами

нового класса веществ, не встречающихся в природе, – опинов. Они содер-

жатся только в тканях корончатых галлов и служат их маркерами. Они явля-

ются ростовыми веществами агробактерий, однако опухоли продуцируют их

и в отсутствие микроорганизмов.

Общие свойства «привыкших» и опухолевых клеток: гормоннезависи-

мость и отсутствие регенерации.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 205

Суспензию клеток можно получить из каллуса при помещении его в

жидкую питательную среду на качалку или непосредственно из ткани экс-

планта с помощью пектиназы и встряхивания. Вначале на поверхности экс-

планта образуется каллусная ткань, а затем от нее отделяются клетки и кле-

точные агрегаты, в результате образуется клеточная суспензия [11

, 14].

Суспензионные культуры – это одиночные клетки, мелкие, средние и

крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной

среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях.

Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры

необходимо 2-3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60–100 мл жидкой

питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой

питательной средой на круговых качалках со скоростью 100–120 об/мин.

Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, который легко

фрагментируется на отдельные клетки или небольшие агрегаты и получается

на средах с 2,4-Д. Облегчает суспендирование исключение из питательной

среды ионов кальция, цитокининов или уменьшение их концентрации и уве-

личение ауксинов. Еще более – добавление в среду пектиназы, которая раз-

рушает пектат кальция, склеивающий между собой отдельные клетки

Основным условием культивирования клеточных суспензий является

постоянное встряхивание или перемешивание среды. Иначе опять формиру-

ется каллусная ткань! Деление поддерживается присутствием ауксинов и ци-

токининов, которые необходимы для индукции и роста каллусной ткани.

Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включа-

ет лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации.

Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это

зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питатель-

ной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 сут. Обыч-

но длительность культивирования составляет 14–16 дней. При этом плот-

ность возрастает от 10 000 до 1 000 000 кл/мл. Для субкультивирования сус-

пензия берется в конце экспоненциальной фазы, метаболиты – лучше в ста-

ционарной.

Назначение суспензий – получение вторичных метаболитов (лекарства,

парфюмерия, биомасса, селекция и протопласты). Суспензии используют для

получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов,

алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фар-

макологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском

хозяйстве [2

, 3, 8].

Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и

особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают про-

топласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической ин-

женерии, а также для изучения метаболизма клеток.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.7. Суспензионные культуры

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 206

Характеристики суспензии – жизнеспособность, плотность в суспен-

зии, степень агрегированности, скорость роста.

По плотности суспензии можно не только охарактеризовать состояние

клеточной популяции, но и определить время субкультивирования (отбора

инокулянта и пересадки на свежую питательную среду). В большинстве слу-

чаев суспензию для субкультивирования отбирают в конце экспоненциаль-

ной фазы (через 14–16 дней после начала культивирования). При построении

кривой роста показатели снимают через день. Плотность суспензии за 2-3 не-

дели культивирования возрастает в 20 раз.

В зависимости от целей исследования условия культивирования и со-

став питательной среды подбирают так, чтобы в суспензии преобладала оп-

ределенная фракция клеток. Обычно в суспензии различают 4 основные

фракции: одиночные клетки, мелкие агрегаты, средние агрегаты, крупные аг-

регаты.

При работе с суспензиями необходимо учитывать и ее жизнеспособ-

ность. О жизнеспособности клеток можно судить по движению цитоплазмы,

по степени проницаемости клеточной стенки для красителей, по активности

ферментов.

Жизнеспособность определяется по окрашиванию метиленовой синью

или синей Эванса (0,5 %-м раствором синей Эванса или 0,01 %-м раствором

флуоресцеинацетата). Прижизненные красители клетки не убивают и через

оболочки живых клеток в цитоплазму не проникают. Жизнеспособность

культуры определяют соотношением количества жизнеспособных клеток к

общему количеству в миллилитре суспензии. Жизнеспособные или живые

культуры характеризуются наличием клеток с ядрами и движением цито-

плазмы при окрашивании препаратов красителями [11].

Суспензия считается жизнеспособной, если более 70 % клеток не ок-

рашиваются в синий цвет; агрегат жизнеспособен, если более 50 % его кле-

ток не окрасились.

Культивирование суспензий осуществляется в периодическом или не-

прерывном (проточном) режиме. Клетки не удаляются в закрытой системе,

частично удаляются – в открытой. Для промышленного производства приме-

няют ферментеры.

Во многих случаях изучение особенностей размножения и роста клеток

связано с необходимостью использования синхронизированных клеточных

популяций.

Как правило, клеточная популяция суспензионных культур не только

гетерогенна, но и асинхронна, так как содержит клетки, различающиеся по

времени вхождения в митоз. Для синхронизации клеточных культур исполь-

зуют методы индукции, когда течение клеточного цикла блокируется в опре-

деленном периоде под влиянием или физических факторов, например, пони-

женной температурой, или химических соединений.

Так, индукторами синхронизации в системе культивируемых клеток

могут быть ингибиторы синтеза ДНК: тимидин, 5-аминоурацил, оксимочеви-

на. В результате обработки клеток этими веществами клеточный цикл про-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.7. Суспензионные культуры

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 207

должается только до Gi-периода и клетки накапливаются перед синтетиче-

ским периодом. Удаление из среды ингибитора приводит к синхронизиро-

ванному переходу клеток к синтезу ДНК, а затем и делению.

Другой способ синхронизации заключается в создании условий «голо-

дания» по одному из компонентов культуральной среды, например, ауксину,

цитокинину, углеводам, азоту. Клетки накапливаются в Gi- или Ог-периоде

клеточного цикла. Затем пассирование суспензии на среду с недостающим

компонентом приводит к синхронизации клеточного деления. С помощью

индукции синхронизации клеточных делений удается повысить митотиче-

ский индекс с 2-3 до 30–35 %.

Получение культуры отдельных изолированных клеток очень ценно

для генетических и физиологических исследований, практического использо-

вания в клеточной селекции. Так, получение клона потомства одиночной

клетки помогает установить причины генетической неоднородности каллус-

ных клеток.

Выделяют одиночные клетки из клеточных суспензий, тканей расте-

ний, из каллусных тканей или культуры протопластов после восстановления

клеточной стенки. Для получения одиночных клеток иногда достаточно от-

стаивания суспензионной культуры (10–15 мин в колбе) или использования

мацерирующих ферментов, центрифугирования в градиенте сахарозы либо

фильтрования через сито.

Первые работы по изоляции клеток растений и получению изолирован-

ных клонов было выполнено в 1954 г. в Висконсинском университете, США.

Отдельные клетки выделяли из рыхлой каллусной ткани табака, культивиро-

ванной в жидкой питательной среде при постоянном встряхивании на шейке-

ре. Трудности связаны с тем, что отдельные клетки не делятся в тех услови-

ях, при которых растет каллусная ткань. Предварительные эксперименты по-

казали, что при помещении отдельной изолированной клетки в культураль-

ную среду ее деления не происходило.

Однако клоны из таких клеток удалось получить Мьюиру с соавторами

с использованием метода ткани-«няньки». В этом случае изолированную

клетку переносили на фильтровальную бумагу, смоченную питательной сре-

дой и помещенную на поверхность хорошо растущей каллусной ткани. Кал-

лусная ткань индуцировала и поддерживала деление клетки, а затем и разви-

тие клеточного клона. В тех же целях используют суспензионные культуры

клеток [12] (рис. 4.14).

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 208

Рис. 4.14. Использование в качестве «няньки»

культуры суспензионных клеток при выращи-

вании одиночных клеток: 1 – колонии клеток;

2 – фильтровальная бумага; 3 – алюминиевая

сетка; 4 – пенополиуретан; 5 – суспензия клеток

Для индукции клеточных делений одиночных клеток можно использо-

вать кормящий слой (активно делящиеся клетки суспензионной культуры то-

го же вида растений), отделенный от культивируемых одиночных клеток по-

лупроницаемой мембраной.

Стимулирует клеточное деление и кондиционирование среды, для чего

в нее добавляют питательную среду интенсивно делящейся культуры клеток.

Кондиционирующий фактор получают при фильтровании клеточной суспен-

зии в экспоненциальной фазе роста через бактериальный фильтр.

Позже был разработан метод массового культивирования отдельных

изолированных клеток – метод плейтинга (от the plate – чашка) [11]. Метод

состоит из следующих процедур:

– получение клеточной суспензии в жидкой питательной среде из хо-

рошо растущей каллусной ткани;

– фильтрование суспензии через сито для удаления крупных клеточных

агрегатов;

– приготовление 0,6–1 %-й агаровой среды того же состава, который

был использован для поддержания роста суспензии;

– нагревание агаровой среды до жидкого состояния и перемешивание

ее с равным количеством суспензии, которую необходимо разлить в чашки

Петри слоем около 1 мм;

– определение местоположения отдельных клеток с использованием

инвертированного микроскопа и нанесение пометок об их наличии на крыш-

ках чашек;

– культивирование в темноте при t = 25 °С;

– наблюдения за развитием одноклеточных клонов.

В экспериментах Бергмана около 20 % изолированных каллусных кле-

ток табака делилось и образовывало колонии.

При данном способе культивирования, даже при недостаточно сбалан-

сированном составе питательной среды, может происходить деление отдель-

ных клеток. Это обусловлено тем, что в соседних колониях, образованных из

мелких клеточных агрегатов, синтезируются ростовые вещества, которые

выделяются в среду и стимулируют клеточное деление.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 209

Метод микрокамеры разработан Джонсом в 1960 г., который может

быть использован при оптимальной сбалансированности состава питательной

среды для культивирования отдельной изолированной клетки.

Метод включает следующие процедуры:

– на предметное стекло с помощью парафинового масла на небольшом

расстоянии наклеивают два покровных стекла;

– между покровными стеклами наносят квадрат из парафинового масла;

– в камеру из парафинового масла помещают каплю питательной среды

с изолированной клеткой;

– сверху камеру накрывают третьим покровным стеклом;

– за развитием клеточной колонии наблюдают под микроскопом.

Использование микрокамеры Джонса позволило Вэсилу и Хильдеб-

рандту в 1965 г. продемонстрировать возможность получения из изолирован-

ной клетки табака нормально развивающегося и достигшего цветения расте-

ния. Таким образом, впервые экспериментально была доказана тотипотент-

ность клетки растения. К указанному методу близок способ Ю.Ю. Глеба – в

микрокаплях.

Протопласт – клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная

цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие рас-

тительной клетке. Протопласт имеет характерную сферическую форму, его

поверхность защищена только плазмолеммой.

Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который исполь-

зовал механический способ [11

]. При этом способе у плазмолированных кле-

ток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее

время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:

– невысокая производительность;

– возможность использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом;

– трудоемкость и длительность.

Другой метод выделения протопластов – энзиматический, с использо-

ванием ферментов. В 1952 г. Салтон с помощью фермента лизоцима впервые

разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 г. Коккинг обработал кончики

корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости

плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолирован-

ные протопласты высших растений энзиматическим способом.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.9. Культура протопластов

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 210

По сравнению с механическим энзиматический метод обладает сле-

дующими преимуществами:

– одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн

из грамма ткани или клеток);

– клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу;

– клетки не повреждаются;

– метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: цел-

люлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотно-

шение специфично для каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:

1) обработка ферментами;

2) выделение протопластов из клеточных стенок;

3) отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

В зависимости от происхождения растения и взятой для изоляции про-

топластов ткани подбирается вид ферментов, их комбинация и концентрация.

Для выделения протопластов используют разные ткани растения, а также

каллусные и суспензионные культуры. С целью получения большого числа од-

нотипных протопластов у двудольных используют мезофилл молодых листьев.

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки.

Когда протопласт «голый», один из компонентов регуляции водообмена те-

ряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды

выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической,

чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти

условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве

осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит,

ксилозу), ионные осмотики (CaCl

, KCl) в концентрации 0,3–0,8 моль/л. Кон-

центрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных

культур [12

]. Лучше всего – в поздней стадии логарифмического роста, когда

клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жиз-

неспособны.