Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.9. Культура протопластов

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 211

Рис. 4.15. Схема получения и культивирования

протопластов из клеток растений

Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Со-

став солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического

стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, ви-

таминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды – 5,4–5,8, тем-

пература – 22–28

С, невысокая освещенность (не более 2 000 лк).

Общее представление об этапах получения, культивирования in vitro

протопластов и регенерации из них растений дано на рис. 4.15

Сразу после того, как отмыты ферменты, протопласты начинают реге-

нерировать клеточную стенку. Отмечается появление целлюлозных микро-

фибрилл, постепенно организующихся в типичную клеточную оболочку. Че-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.9. Культура протопластов

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 212

рез 2–4 дня протопласт может утратить сферическую форму, и произойдет

полное восстановление клеточной стенки. В зависимости от происхождения

протопластов и культуральных условий может отмечаться отсутствие синтеза

клеточной оболочки в течение нескольких недель или месяцев.

Одним из факторов культуральной среды, обусловливающим синтез

клеточной стенки, является сахароза. В ее отсутствие синтеза клеточной

стенки не происходит.

Протопласты, не регенерировавшие клеточную стенку, теряют способ-

ность к нормальному митотическому делению и образованию клеточных ко-

лоний. Такие протопласты или не приступают к делению, или в результате их

деления формируются многоядерные структуры, так как кариокинез не со-

провождается цитокинезом.

Формирование клеточной стенки не всегда является условием, доста-

точным для перехода клетки к делению. В зависимости от объекта и условий

культивирования к последующему делению может приступить от 0,1 до 80 %

восстановивших клеточную стенку протопластов. Первые деления могут

происходить через 2–10 дней с начала культивирования протопластов. Обра-

зовавшиеся клеточные колонии могут стать источником растений-

регенерантов.

Первое сообщение о регенерации растений в культуре протопластов

мезофилла табака было опубликовано в 1971 г. японскими исследователями.

Наиболее хорошо отработаны методы изоляции и культивирования прото-

пластов у представителей семейства Solanaceae и отдельных видов Brassica.

Трудными объектами для получения протопластов, способных к реализации

тотипотентности, являются однодольные растения, в том числе злаки, и хвойные.

Для культивирования протопластов могут быть использованы модифи-

кации сред Мурасиге и Скуга или Гамборга (В-5) с добавлением комплекса

витаминов и фитогормонов. До того как протопласты синтезируют клеточ-

ную стенку, необходимо обеспечить в среде соответствующий уровнь осмо-

тического давления для поддержания стабильности протопластов. В качестве

осмотиков используют сахара: глюкозу, маннитол, сорбит, ксилозу, сахарозу

или их разные сочетания. После регенерации клеточной стенки и развития

клеточных колоний осмотики из среды исключают. Другой важный фактор

успешного культивирования протопластов – плотность их высева, которая

может составлять 10

–10

протопластов на 1 мм среды.

Существуют два способа культивирования протопластов: метод жид-

ких капель и метод платирования.

В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на

пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирова-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.9. Культура протопластов

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 213

ние единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл,

предложенное Ю. Глебой в 1978 г.

Во втором – суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки

Петри, добавляют равный объем той же среды с 1 %-м агаром при темпера-

туре не выше 45

С. После остывания чашки Петри переворачивают и куль-

тивируют при 28

С. В данном случае протопласты фиксированы в одном по-

ложении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблю-

дать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стен-

ки, делением, ростом и развитием растения.

Вариантом этой техники является использование кормящих протопла-

стов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения,

что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки

смешивают с жизнеспособными протопластами, и они поддерживают и сти-

мулируют их рост.

Сразу после удаления раствора фермента начинается образование кле-

точной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений.

Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через

развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого

добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.

На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 факто-

ра: видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани

растения, способ и условия выделения протопластов, плотность высева про-

топластов, состав питательной среды.

Отсутствие клеточной стенки у протопластов обусловливает им свой-

ства, отличные от целых клеток. Благодаря тому, что протопласты способны

поглощать макромолекулы и органеллы, их используют в качестве реципиен-

тов при трансформации, а также в экспериментах по клеточной селекции и

мутагенезу. Изолированные протопласты служат источником для выделения

неповрежденных и функционально активных субклеточных и цитоплазмати-

ческих структур и органелл (хлоропластов, ядер, хромосом). Способность

протопластов сливаться друг с другом нашла применение для получения со-

матических гибридов.

И все же проблема соматической гибридизации в норме нескрещиваю-

щихся видов растений еще не решена. Даже если будут разработаны удобные

методы отбора соматических клеток, останутся проблемы генетической и

физиологической несбалансированности. Наиболее вероятно, что слиянием

протопластов в практической селекции будут пользоваться только для пере-

носа отдельных хромосом или хромосомных фрагментов, которые удается

сохранить после ряда делений и спонтанной элиминации хромосом одного из

видов.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.9. Культура протопластов

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 214

Слияние протопластов – парасексуальная гибридизация. Изолиро-

ванные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливать-

ся между собой. Слияние протопластов – своеобразный метод гибридизации,

так называемая парасексуальная, или соматическая, гибридизация [11

]. В от-

личие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве роди-

тельских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные

клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты у большинства

высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и ма-

терински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить:

– скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов);

– получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного

из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цито-

плазмой другого;

– слияние трех и более клеток;

– получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей;

– перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать

жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез до-

вольно часто дает дефектное по морфогенезу растение;

– получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.

Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов,

так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд призна-

ков – скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факто-

рам и т.д. Наличие косегрегации генов (признаки, контролирующие внеядер-

ный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцепле-

нии генов.

Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей

или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния

протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических.

При физическом способе слияния протопластов, разработанном

Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 г., протопласты помещают в камеру

с неоднородным электрополем. На электродах формируются агрегаты из 2-3

протопластов либо цепочки из 5-6 протопластов между электродами. Допол-

нительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию

пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, так

как переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и

протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток обуславливает

возвращение сферической формы у слившихся протопластов.

В основе слияния лежит различное действие постоянного и переменно-

го электрического тока на плазмалемму. Постоянное эклектическое поле

сжимает мембраны, способствуя их локальному разрушению, а переменное

электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя

свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные

мембраны могут установить контакт.

Чаще для индукции слияния протопластов используют методику ПЭГ –

высокие значения рН – высокая концентрация Са

, которая дает до 50 %

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.9. Культура протопластов

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 215

слившихся протопластов (рН – 9–11, концентрация Са

– 100–300 ммоль/л).

В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопла-

стов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция – их слияние.

Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что

связано с их жидкостно-мозаичной структурой.

При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, мо-

гут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Же-

лаемый продукт слияния – АВ, поэтому разрабатываются способы увеличе-

ния частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только

продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. По-

верхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки

ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать

поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А,

имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами

В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться

комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов.

Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного

растения с помощью разных флуоресцентных красителей. Если обработать

протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а прото-

пласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не из-

меняя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной

(RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных

типов клеток, будут иметь оба цвета флуоресценции – желто-зеленый и красный.

Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количест-

ве. Многоядерные продукты слияния, как правило, разрушаются. Первое со-

общение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось

в 1972 г. (Карлсон и коллеги), в нашей стране подобное осуществили в лабо-

ратории Р.Г. Бутенко в 1975 г.

Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния про-

топластов может быть различной:

1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и

однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии

сегрегируют в процессе клеточных делений.

2. Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродитель-

ски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к со-

матическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплаз-

матических геномов.

3. Возникают гибридные клетки и растения в результате слияния более

чем двух родительских клеток.

Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию

гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид – продукт

слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цитоплазматиче-

ский гибрид) – растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родите-

лей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один

из протопластов γ-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток про-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.9. Культура протопластов

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 216

водится по генам – маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондри-

ального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК

митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках.

При слиянии могут образовываться и так называемые асимметричные

гибриды – продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного

из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто воз-

никают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от

друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловлен-

ных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом,

в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из

родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жиз-

неспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родитель-

ских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная

обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом.

Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы.

Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских

клеток. Из таких гибридных клеток могут выращены растения-регенеранты.

В результате соматической гибридизации можно получить межвидо-

вые, межродовые, межтрибные, межсемейственные, межцарственные отда-

ленные гибриды.

Для отдаленных гибридов характерно:

1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не

наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей.

2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация

хромосом).

3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток.

4. Ограниченная морфогенетическая способность.

Конструирование клеток. Протопласты широко используются в качестве

реципиентов для клеточных органелл. В 1973 г. И. Потрикусс и Ф. Хоффман

успешно трансплантировали изолированные ядра петуньи в протопласты та-

бака. Ввести ядро или другие клеточные органеллы в протопласт можно не-

сколькими методами:

– использованим в трансплантации сэндвич-метода в условиях слабого

деплазмолиза протопласта;

– переносом клеточных органелл посредством липосом;

– слиянием одно- и многоламелльных частиц с мембранами протопла-

стов, в присутствии таких веществ, как фосфатидилсерин, холистерол и т.д.;

– переносом органелл путем микроинъекций.

Кроме ядра трансплантируют и другие органеллы, такие как митохонд-

рии и хлоропласты. Выбор этих органелл объясняется их полуавтономно-

стью, т.е. наличием собственной ДНК и способностью делиться самостоя-

тельно, независимо от деления самой клетки. Кроме того, эти органеллы кон-

тролируют важнейшие физиологические процессы растительной клетки, та-

кие как фотосинтез и дыхание. Например, перенос хлоропластов может ис-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.9. Культура протопластов

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 217

пользоваться для выведения новых форм хозяйственно важных сортов расте-

ний. Трансплантация высокоэффективных хлоропластов может способство-

вать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растения.

Одним из важных моментов является сохранение клеточных органелл,

поэтому для переноса их в последнее время используются субпротопласты –

фрагменты, полученные из протопластов. Они могут содержать большую

часть цитоплазмы, но без ядра (цитопласты), ядро с небольшим количеством

цитоплазмы (кариопласты), часть хромосом с небольшим количеством цито-

плазматического материала (микропротопласты).

Биологическое конструирование на уровне клетки может оказаться по-

лезным и перспективным для создания клеток, клеточных систем и целых

растений, удовлетворяющих потребности человека. Под биологическим кон-

струированием следует понимать не только введение отдельных органелл.

Аналогичным образом в клетку можно вводить и чужеродный генетический

материал, как в виде фрагментов ДНК, так и в виде отдельных хромосом.

Кроме того, в изолированные протопласты можно вводить клетки микроор-

ганизмов, создавая таким образом искусственные ассоциации.

Однако необходимо учитывать и следующее явление (по аналогии с

сомаклональной изменчивостью): у растений, регенерировавших в результа-

те культивирования протопластов, также проявляется изменчивость. Ее на-

зывают протоклональной изменчивостью, а регенерировавшие растения –

протоклонами.

Спектр изменчивости у протоклонов выражен в большей степени, чем

у сомаклонов, так как протопласты в большей степени, чем клетки, подвер-

жены воздействиям экзогенных факторов, спектр которых более широк [11].

Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при котором

в половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара гомоло-

гичных хромосом представлена лишь одной из них. Гаплоидом или моно-

плоидом называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный

набор негомологичных хромосом.

Уровень спонтанного возникновения гаплоидов очень низкий – при-

мерно один гаплоид на 10

–10

растений. Для повышения частоты образова-

ния гаплоидов используют разные приемы:

– воздействуют на процессы опыления и оплодотворения радиацион-

ным излучением или химическими веществами;

– опыляют растения чужеродной пыльцой, индуцирующей к развитию

неоплодотворенную яйцеклетку;

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.10. Культура гаплоидных тканей

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 218

– выполняют отдаленные скрещивания с такими генотипами, когда

обеспечивается двойное оплодотворение, но в процессе развития зародышей

происходит элиминация хромосом опылителя, что приводит к развитию гап-

лоидного зародыша материнского генотипа (метод гаплопродюссера);

– культивируют изолированные пыльники;

– культивируют неоплодотворенные завязи и семяпочки.

Генотип гаплоидов имеет характерные особенности. У гаплоидов про-

являются рецессивные гены. По внешнему виду гаплоиды сходны с соответ-

ствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплоидов имеют меньший

размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют полноценных гамет.

Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно полу-

чить полностью гомозиготное диплоидное растение.

Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибри-

дизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из

пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже

получены у 200 видов растений.

Отдаленная гибридизация – важный метод формообразования и улуч-

шения существующих сортов. Основная ее проблема – низкая совместимость

или полная несовместимость скрещиваемых видов. Для ее преодоления эф-

фективны различные модификации методов культуры тканей: своевременное

изолирование и доращивание гибридных зародышей на питательных средах;

каллусогенез при культивировании незрелых гибридных зародышей и реге-

нерация растений из каллусных тканей.

Известны несколько методов создания гаплоидов в культуре изолиро-

ванных тканей растений, имеющих свои преимущества и недостатки:

1) использование (введение в культуру) гаплоидных тканей нативного

растения (пыльники, пыльцевые зерна, семяпочки);

2) гаплопродукции – создание условий для получения гаплоидной тка-

ни на интактном растении (отдаленная гибридизация, приводящая к элими-

нации (абортированию) одного из родительских генотипов), а затем доращи-

вание недоразвитого семени или зародыша.

Гут и Магешвари, впервые занявшиеся культурой пыльников, вызвали

рост гаплоидных клеток действием кинетина, а рост диплоидных клеток –

включением в среду ауксина, индолилуксусной кислоты (ИУК) с кинетином.

Затем последовали сообщения разных авторов о получении ими гап-

лоидов риса, рапса, ячменя, паслена черного, томата, эгилопсов, спаржи и

других культур. В 70-х гг. из пыльцевых зерен уже получили гаплоиды

23 видов 5 семейств и 4 межвидовых гибрида.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.10. Культура гаплоидных тканей

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 219

В процессе культивирования пыльников в условиях in vitro имеет место

андрогенез – развитие эмбриоидов, а затем и растений из мужских половых

клеток (микроспор).

Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников

на питательные среды является стадия «средних» или «поздних» одноядер-

ных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобож-

даются из тетрад и готовятся к первому митозу.

Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с

концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрак-

том, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д.

Из цитокининов применяют кинетин и 6-БАП. Агар-агар тщательно промы-

вают, так как он содержит вещества, неблагоприятно влияющие на развитие

пыльников. Для адсорбции метаболитов, ингибирующих ростовые процессы

в культуре тканей, в питательные среды добавляют активированный уголь.

Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре

4–6

С в течение 2–8 сут. Изолированные пыльники культивируют либо в

темноте, либо при слабом освещении при температуре (25+

С.

На питательных средах микроспора может образовать каллус или гап-

лоидный зародыш (сначала формируется 40–50-клеточный проэмбрио). За-

родыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогич-

ные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличива-

ются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотно-

шение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение

гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомо-

зиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции

и генетики.

В процессе культивирования изолированных пыльников на питатель-

ных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (обра-

зованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов) [10

] (рис. 4.16),

либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифферен-

цируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при

пассировании на специальные среды – морфогенный каллус и регенеранты.

Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднород-

ны по ряду морфологических признаков. Это обусловлено гетерогенностью

каллусов. Поэтому необходимо проводить цитологическое изучение и каллу-

сов, и растений-регенерантов.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.10. Культура гаплоидных тканей

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 220

Рис. 4.16. Схема формирования андрогенных эмбриоидов

Как показали опыты, таким способом образуются не только гаплоид-

ные, но и диплоидные и полиплоидные растения. Первые формируются из

микроспор или из каллуса микроспоры, а диплоиды – из спонтанно удвоен-

ных ядер, из клеток гаплоидного каллуса.

Пыльники капусты благоприятно реагируют на смесь кинетина и 2,4-Д,

пыльники риса – на 2,4-Д или 1-нафтилуксусную кислоту (НУК). Исключи-

тельно активный рост пыльцы индуцирован у дурмана и рода Brassica коко-

совым молоком, а у дурмана – и соком сливы. Эти продукты оказались для

названных растений эффективнее, чем какие-либо синтетические индукторы.

У многих видов наилучший выход микроспор обеспечивается при пре-

добработке культивируемых пыльников низкими температурами. У ячменя,

например, обработка в течение 7–14 дней при 7

С дает оптимальные ре-

зультаты.

Отдаленная гибридизация – важный метод формообразования и улуч-

шения существующих сортов. Основная его проблема – низкая совмести-

мость или полная несовместимость скрещиваемых видов. Для ее преодоле-

ния эффективны различные модификации методов культуры тканей: свое-

временное изолирование и доращивание гибридных зародышей на питатель-

ных средах; каллусогенез при культивировании незрелых гибридных заро-

дышей и регенерация растений из каллусных тканей.