Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 171

Ауксин играет важную роль в процессах регенерации при размножении

каллусных клеток; в процессе образования придаточных и боковых корней,

луковиц, при заложении вегетативных почек.

Механизм действия ауксина на рост клетки связывают с активацией

– выкачивающего насоса в плазмолемме. Происходит подкисление кле-

точной стенки, что приводит к разрыву целлюлозных и пектиновых полиме-

ров. Это облегчает растяжение растущей клетки под действием тургорного

давления.

Избыток ауксина разрушается ИУК-оксидазой.

Синтетические ауксины. Для практических целей в сельском хозяйстве

часто применяют не ИУК, а синтетические ауксины, так как они в растениях

не разрушаются ИУК-оксидазой. Молекулы синтетических ауксинов имеют

разную структуру, но содержат ароматическое или гетероциклическое коль-

цо, боковая часть которого представлена остатком алифатической кислоты.

По действию синтетические ауксины относят: к сильным – индолил-3-масляная

кислота (ИМК), а-нафтил-1-уксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиук-

сусная кислота (2,4-Д); слабым – фенилуксусная кислота (ФУК), фенилмас-

ляная (ФМК).

Гиббереллины обнаружены в 20-е гг. японскими исследователями в ви-

де продуктов обмена веществ Fusarium moniliforme – конидиальной (споро-

вой) стадии сумчатого гриба (аскомицета) Gibberellafujikuroi.

Гиббереллины – это дитерпеноиды с тетрациклическим гиббереллано-

вым скелетом из 19-20 С-атомов. В тканях растений одновременно встреча-

ются несколько гиббереллинов, а в процессе онтогенеза их набор и соотно-

шение изменяются.

Подобно ауксинам, гиббереллины оказывают множественные дейст-

вия: стимулируют рост в фазе растяжения и деления клеток (например, кам-

бия), вызывают рост плодов. Рост в фазе растяжения стимулируется одно-

временно действием гиббереллинов и ауксина. В других случаях гибберел-

лины могут выступать как антагонисты ауксина, например задерживать рост

придаточных корней. Для практических целей наиболее часто используют

гибберелловую кислоту (А

Цитокинины были открыты как фактор, регулирующий деление клеток

в культуре изолированных тканей и названный кинетином (от слова «кинез» –

деление). Другой природный цитокинин назван зеатином, так как был выде-

лен из семян кукурузы в стадии молочной спелости.

Сейчас известно еще 12 цитокининов, их химическое

строение близко к

строению зеатина. Показана высокая кининовая активность и у дифенилмо-

чевины и ряда ее производных. В процессе эволюции этот класс фитогормо-

нов, так же как и ауксины, начал формироваться очень рано. Цитокинины

широко распространены в растительном мире: от водорослей до цветковых

растений. Соединения с цитокининовой активностью обнаруживаются уже у

бактерий.

Цитокинины представляют собой N-замещенные производные аденина

и синтезируются в растении из двух главных предшественников — мевало-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 172

новой кислоты и 5'-АМФ. Возможен синтез цитокининов из продуктов рас-

пада некоторых тРНК, содержащих модифицированный аденозин.

Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточ-

ных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК, РНК, белков. Благо-

даря этому замедляется старение клеток и повышается их устойчивость к не-

благоприятным факторам среды. Во многих случаях для проявления дейст-

вия цитокининов необходимо присутствие ауксина или одновременно и аук-

сина, и гиббереллинов. Под действием кинетина происходит рост активности

многих ферментов.

Применение фиторегуляторов в культуре изолированных тканей

(табл. 4.3

). Фитогормоны в культуре изолированных тканей необходимы для

дедифференцировки клеток и индукции клеточных делений. Поэтому чтобы

получить каллусные ткани, в состав питательных сред обязательно должны

входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокини-

ны, индуцирующие деление клеток. В случае индукции стеблевого морфоге-

неза содержание ауксинов в среде может быть снижено или они могут быть

полностью исключены из питательной среды.

Таблица 4.3

Фитогормоны и их синтетические аналоги, наиболее часто используемые

в культуре изолированных тканей (данные Н.В. Зобовой)

Ауксины

Цитокинины

2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

Аденин

р-хлорфеноксиуксусная кислота

6-бензиламинопурин

Индол-3-уксусная кислота

N-бензил-9(2-тетрагидропиранил)-аденин

Индол-3-ацетилаланин

6-γ-γ-диметилаллиламинопурин

Индол-3-ацетил-аспарагиновая кислота

1 ,3-дифенилмочевина

Индол-3-ацетилглицин

Кинетин

Индол-3-масляная кислота и ее калиевая соль

Зеатин

ά-нафтилуксусная кислота

На безгормональной среде растут опухолевые и «привыкшие» ткани,

Автономность этих клеток по отношению к обоим гормонам или к одному из

них связана со способностью их продуцировать.

Чаще всего в качестве источника ауксинов в питательных средах ис-

пользуется 2,4-Д (2,4-дихлорфенокисиуксусная кислота), ИУК (индолилук-

сусная кислота), НУК (ά -нафтилуксусная кислота). Для получения рыхлого,

хорошо растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д. ИУК почти в 30 раз менее

активна, чем 2,4-Д. В качестве источников цитокининов в искусственных пи-

тательных средах используется кинетин, 6-БАП (6-бензиламинопурин), зеа-

тин. 6-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании

роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кине-

тином. Смешанными функциями обладают абсцизовая, коричная и гибберел-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 173

ловая кислоты, флороглюцинол, 2,2-диметилгидразид янтарной кислоты. Из

гиббереллинов в составе культуральных сред используют гибберелловую ки-

слоту как наиболее доступную для индукции побегообразования у цитрусо-

вых и для поддержания роста суспензионных культур.

Цитокинины в состав сред включают для стимуляции клеточного деле-

ния в каллусных и суспензионных культурах, в культурах протопластов, при

регенерации проростков из соматических эмбриоидов или стеблевых почек.

Абсцизовую кислоту применяют при культивировании протопластов.

Богатая питательная среда – прекрасный субстрат для развития в ней

микроорганизмов. Для обеззараживания питательных сред используют хи-

мическое воздействие (дезинфекция), воздействие температуры и других фи-

зических факторов (ультразвук, ультрафиолетовые лучи, ультрафильтрация).

Каждый из этих методов весьма избирателен для применения.

В биотехнологии широко используют термические методы обеззаражи-

вания (автоклавирование, стерилизацию, кипячение, пастеризацию и др.) [1

, 8].

Как известно, отдельные компоненты питательных сред также по-

разному реагируют на термическое воздействие. Особенно термолабильны

органические соединения: витамины, углеводы, гормоны и др. Сложные са-

хара и полисахариды при автоклавировании частично гидролизуются. Сте-

пень гидролиза зависит от источника углерода, температуры и продолжи-

тельности автоклавирования. При высоких температурах происходит караме-

лизация сахаров. Растворы, содержащие аминокислоты и восстанавливающие

сахара, при термическом воздействии приобретают коричневатый цвет

вследствие сахароаминных реакций.

Все эти процессы сильно зависят от рН используемой среды. Сущест-

вует сложная зависимость между рН среды, содержанием ионов, температу-

рой, продолжительностью автоклавирования, с одной стороны, и степенью

термодеградации питательных сред – с другой.

Во избежание нежелательных деструктивных изменений компонентов

питательных сред (субстратов) применяют по возможности более мягкие ре-

жимы стерилизации (табл. 4.4

) или раздельную стерилизацию компонентов.

Высокие, но кратковременные температурные режимы инактивируют споры

бактерий, оказывая минимальное влияние на биологически активные компо-

ненты среды. В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред и

некоторых других объектов проводят в автоклавах паром под давлением, со-

блюдая необходимые режимы. В отдельных случаях прибегают к сухожаро-

вой стерилизации.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 174

Таблица 4.4

Режимы стерилизации питательных сред

Температура, °С

Пар под давлением

Сухой жар, мин

Время, мин

Давление, атм

121

–

126

1,4

–

134

–

140

–

180

150

–

150

160

–

120

170

–

Установлено, однако, что температура выше 121

С может быть причи-

ной нарушения качества сред и, как следствие, плохого роста культур. К тому же

в принципе желательна стерилизация автоклавированием небольших объемов

питательных сред, что при прочих равных условиях позволяет уменьшать

время стерилизации, так как укорачивается период прогрева проб (табл. 4.5

В последнее десятилетие широкое распространение для получения сте-

рильных воздуха и различных жидкостей приобрела мембранная фильтрация.

Это разновидность холодной стерилизации, которая эффективна для стери-

лизации термолабильных веществ [2

, 8].

Таблица 4.5

Рекомендуемые интервалы стерилизации разных объемов сред (t = 121

С) [8]

Объем среды, мл

Минимальное время стерилизации, мин

100

250

500

1 000

2 000

4 000

Промышленный выпуск мембранных фильтров был начат с конца

40-х гг. прошлого столетия. Согласно Р.Е. Кестингу (1971), наиболее распро-

страненными процессами являются обычная фильтрация (макрофильтрация –

1–10

мкм), микрофильтрация (2·10

–2

–10 мкм), ультрафильтрация (10

–3

–

2·10

–2

мкм), диализ (10

–3

мкм–1 нм). Если для макрофильтрации применяются

обычные бумажные или стеклянные фильтры, то для остальных используют-

ся нитроцеллюлозные, ацетилцеллюлозные, поливинильные, полиамид-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 175

ные, фторуглеродные мембраны толщиной менее 0,1 мкм с высокой степе-

нью пористости и с диаметром пор в пределах 10

–4

–10 мкм. Для стерилиза-

ции в биотехнологических целях достаточно микрофильтрации.

Все манипуляции с культурой изолированных тканей растений прово-

дятся в стерильных условиях. Комплекс мер, обеспечивающих асептику био-

технологических процессов, включает механическую, физическую и химиче-

скую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости – и ко-

нечного продукта [2, 8]. Асептика предусматривает влажную уборку поме-

щений, обработку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средст-

вами, использование стерильных инструментов, сред, технологической оде-

жды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным потоком стерильного

воздуха в боксированных помещениях, поступление в ферментатор стериль-

ного воздуха через барботер – от франц. barbotage – перемешивание) и пр.

К механической защите относятся удаление механических примесей,

например, из воздуха, культиваторов; герметизация оборудования, изоляция

узлов и соединений; к физической – обработка воздуха и поверхностей при-

боров и аппаратов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация па-

ром под давлением, обработка ультразвуком; к химической – обработка рабо-

чих поверхностей и биообъектов химическими антисептиками.

В производственных условиях источниками микробов-контаминантов

могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди. Из почвы в сферу био-

технологических процессов попадают спорообразующие палочки-бациллы,

конидии грибов, актиномицеты; эти же микроорганизмы с пылью могут по-

пасть в воздух, из которого они способны проникнуть в среду выращивания

биообъекта или в конечный продукт производства

Культивирование изолированных тканей растений происходит на све-

ту. Освещенность факторостатной (световой) комнаты должна составлять в

зависимости от культуры 1 000–10 000 лк. Необходимо учитывать фотопери-

од, который требуется для данного культивируемого объекта.

Влажность в световой комнате должна быть 60–70 %. Более сухой воз-

дух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, осо-

бенно если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации, а

значит, и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в

комнате можно использовать поддоны с водой.

Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей –

25–26 °С, для культуры тканей тропических растений – 29–30 °С. В случае

индукции морфогенеза температуру понижают до 18–20 °С.

Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей рас-

тений необходимо соблюдать определенные условия. Большинство каллус-

ных тканей не нуждается в свете, так как не имеет хлоропластов и питается

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 176

гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани,

такие, например, как ткань мандрагоры. Каллусные ткани получают в темно-

те или при рассеянном свете, а для успешного морфогенеза их переносят в

помещения с интенсивным освещением 1 000–4 000 лк.

Световой и температурный режимы, как и остальные условия, зависят

от выполняемых задач. Наилучшие их параметры, а также режим оптималь-

ной влажности можно создать с помощью климатических камер.

Методы культивирования изолированных клеток, органов и тканей на-

ходят широкое применение в экспериментальной биологии и используются

во многих биотехнологических процессах, в которые включены высшие рас-

тения.

Если биологической основой культуры изолированных тканей является

тотипотентность растительных клеток, то обеспечение этого процесса скла-

дывается путем подбора питательных сред определенного состава, регулято-

ров роста и технических (физических) условий введения в культуру и собст-

венно процесса культивирования (выбор экспланта, стерилизация, освещен-

ность, температура и др.).

Культура клеток и тканей растений может использоваться в двух ос-

новных направлениях: 1) размножение или поддержание жизни у неизменен-

ных по сравнению с донорами клеток, тканей, растений; 2) целенаправленное

воздействие на изменение генетического статуса клеток и отбор в селектив-

ных условиях нужных вариантов.

Возможности культуры изолированных клеток и тканей растений весь-

ма обширны [9–11

1) получение вторичных метаболитов, продуцируемых отдельными

клетками и тканями некоторых полезных растений (алкалоидов, глюкозидов,

стероидов и т.д.), используемых для производства лекарств;

2) клеточная и тканевая селекция форм с полезными хозяйственными

свойствами;

3) генетическое улучшение сельскохозяйственных растений;

4) ускоренное (микроразмножение) ценных и уникальных генотипов и

поддержание жизнеспособности ослабленных клеток и тканей;

5) освобождение (оздоровление) посадочного материала от вирусной

инфекции;

6) сохранение генофонда в условиях криоконсервации.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 177

С использованием методов культивирования также решается большое

число теоретических проблем, в том числе:

– особенности старения растительной клетки;

– процессы цитодифференцировки и морфогенеза;

– роль фитогормонов, углеводов, витаминов, минеральных веществ при

каллусогенезе, органогенезе, морфогенезе;

– взаимоотношения клеток высших растений с клубеньковыми бакте-

риями и микоризными грибами;

– механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам сре-

ды: абиотическим (засолению, кислой среде, низким температурам и т.д.),

биотическим (патогенам разного происхождения, вызывающим болезни рас-

тений);

– регуляция вторичного обмена;

– механизмы опухолеобразования;

– механизмы сомаклональной изменчивости;

– популяционные взаимоотношения в клеточной культуре.

Успех в применении культуры клеток и тканей зависит от оптимизации

физиологических процессов, обеспечивающих нормальное деление клеток,

их дифференциацию и регенерацию из них взрослых растений, что определя-

ется многими факторами, прежде всего используемыми гормонами. Наиболее

сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В первую оче-

редь это касается злаковых растений, поэтому важнейшее значение имеет

выяснение механизмов морфогенеза in vitro, регенерации и лежащих в их ос-

нове процессов.

Высокая способность к образованию растений-регенерантов при куль-

тивировании in vitro тканей и клеток растений является необходимым усло-

вием эффективного применения многих клеточных технологий.

В старых пересадочных культурах может протекать процесс, получив-

ший название «привыкание». Он связан с усилением клеточной дедифферен-

цировки, приобретением автономности по отношению к гормонам и превра-

щением каллусных клеток в клетки химических опухолей. «Привыкание»

тканей препятствует в большинстве случаев получению растений-регенерантов.

Утрата регенерационной способности наблюдается также при длительном

пассировании у гормонозависимых, т.е. нормальных, каллусных тканей.

Новообразование растений в культивируемых каллусных культурах в

значительной степени определяется генотипом и физиологическим статусом

экспланта. В связи с этим способ отбора генотипов и эксплантов, эффектив-

ных к образованию морфогенетических структур в культуре in vitro, пред-

ставляет собой актуальную задачу. Решение ее сопряжено с разработкой ряда

физиологических проблем, одной из которых является изучение особенно-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 178

стей целого растения, обуславливающих поведение его органов и тканей в

культуре in vitro.

Имеются данные, которые указывают на связь способности к регенера-

ции растений в культуре первичных эксплантов с модификацией клеточного

метаболизма, функционированием меристем и морфогенезом растения, кото-

рые, в свою очередь, определяются гормональным балансом.

Есть данные о положительном влиянии кустистости и об отрицатель-

ном влиянии скороспелости растений картофеля на число побегов в первич-

ном каллусе клубневых дисков. Склонность к образованию многочисленных

придаточных корней в природе находит отражение в высоком уровне ризоге-

неза в каллусной культуре. У гороха отмечен высокий коэффициент корре-

ляции между азотфиксацией (нитрогеназная активность, интенсивность обра-

зования клубеньков, число клубеньков) и каллусо- и корнеобразованием.

Предполагается, что общая причина формирования клубеньков на корнях

растений и образования каллуса в культуре in vitro заключается в способно-

сти генотипа к пролиферации клеток, определяемой балансом фитогормонов.

Показана связь между полиэмбрионией семян in vivo и числом соматических

эмбриоидов в культуре in vitro у ржи. Выявлено большое сходство при фор-

мировании эмбриоидов в семени пиона (Paeonia anomala L.) in vivo и в куль-

туре in vitro (образование эмбриоидов из клеток эпидермиса, характер их

развития, форма эмбриоидов и др.). Отмечена отрицательная корреляция ме-

жду частотой образования нередуцированных пыльцевых зерен и способно-

стью к андрогенезу в культуре пыльников у картофеля. Возможно, это свиде-

тельствует о сцеплении генов, контролирующих формирование эмбриоидов и

первое деление при образовании реституционных ядер.

У раннеспелых сортов в культуре первичного каллуса, полученного из

развивающихся зародышей, уровень множественной регенерации растений

ниже, чем у позднеспелых. Одной из причин низкого уровня множественной

регенерации растений в группе раннеспелых сортов может быть более бы-

строе развитие зародышей, что определяет более короткий период компе-

тентности их клеток.

В работах, проведенных на злаках, показано влияние на процесс реге-

нерации в культуре in vitro отдельных генов, вовлеченных в контроль гормо-

нального баланса растений. Для пшеницы установлено влияние генов, обу-

славливающих короткостебельность, и гена, определяющего чувствитель-

ность к длине дня на рост каллуса, на соматический эмбриогенез и регенера-

цию растений. У ячменя выявлена сопряженность высокой регенерационной

способности с числом рядов в колосе.

Известно, что древесные, и особенно хвойные, деревья характеризуют-

ся медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество

вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изо-

лированных тканях активируются, окисляя фенолы растений, различные фе-

нолазы. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют

деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или к

уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентив-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 179

ных почек, которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полно-

стью. Однако несмотря на все трудности, исследователи все чаще привлека-

ют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных

растений.

В целом исследования влияния отдельных характеристик целого растения

на поведение его частей в культуре in vitro малочисленны и фрагментарны.

В природе существует два способа размножения растений: половой

(семенной) и вегетативный. Эти способы имеют свои преимущества и недос-

татки. К недостаткам семенного размножения следует отнести генетиче-

скую пестроту получаемого посадочного материала и длительность юве-

нильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип

материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного пе-

риода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных по-

род) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:

1) не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться ве-

гетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоп-

лодные и др.);

2) практически невозможно с помощью черенкования размножать мно-

гие виды древесных пород в возрасте старше 10–15 лет;

3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал (су-

ществует возможность накопления и передачи инфекции);

4) операции при размножении взрослых (древесных) растений с помо-

щью прививок отличаются трудоемкостью и сложностью;

5) разработанные технологии не эффективны для получения достаточ-

ного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию

принципиально нового метода вегетативного размножения – клонального

микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке) неполовым

путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе

метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать

присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий

давать начало целому растительному организму.

Для обозначения растений, полученных бесполым размножением, в

1903 г. Уэббер из Министерства сельского хозяйства США ввел термин клон

от греч. clon – черенок (побег), пригодный для размножения.

Клон – популяция клеток, возникших из одной клетки посредством ми-

тоза, или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем,

все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки.

Клональное микроразмножение – получение in vitro неполовым путем

растений, генетически идентичных исходному.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.4. Клональное микроразмножение растений

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 180

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре

этапа: 1 – выбор растения-донора (донор – растение, часть которого вводится

в культуру), изолирование эксплантов

(эксплант

–

ткань, взятая из своего

оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и

поддержания

жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной

культуры; 2 – собственно микроразмножение, когда достигается получение

максимального количества мериклонов (микропобегов); 3 – укоренение раз-

множенных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а

при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной

температуре (2–10

С); 4 – выращивание растений в условиях теплицы и под-

готовка их к реализации или посадке в поле (рис. 4.1) [12, 14].

Рис. 4.1. Схема клонального микроразмножения растений: I путь –

активация развития существующих меристем; II путь – индукция

возникновения адвентивных почек; 1 – выбор исходного экспланта;

2 – получение стерильной культуры; 3 – образование адвентивных

почек на первичном экспланте; 4 – рост почек и формирование мик-

ропобегов; 5 – размножение микропобегов; 6 – укоренение микропо-

бегов; 7 – депонирование растений-регенерантов; 8 – акклиматизация

растений к грунту; 9 – высадка регенерантов в поле