Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.3. Основы молекулярной терапии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 151

принимавший участие в испытаниях препарата. В 2002 г. у двух детей во

Франции во время лечения от иммунодефицита (введением терапевтических

генов в стволовые клетки с помощью ретровирусов) развилось состояние,

похожее на лейкемию. Поэтому разрабатываются невирусные системы дос-

тавки генов. Самый простой и неэффективный способ – это инъекция плаз-

мидной ДНК в ткани. Второй подход – это бомбардировка тканей микрочас-

тицами золота (1–3 мкм), конъюгированными с ДНК. При этом терапевтиче-

ские гены экспрессируются в тканях-мишенях и их продукты – терапевтиче-

ские белки – поступают в кровь. Основным недостатком этого подхода явля-

ется преждевременная инактивация или разрушение этих белков компонен-

тами крови.

Рис. 3.19. Схема получения вектора на основе аденовируса

Доставку ДНК можно осуществить, упаковав ее в искусственную ли-

пидную оболочку. Полученные таким образом сферические частицы-липосомы

легко проникают через клеточную мембрану. Созданы липосомы с самыми

разными свойствами, однако пока эффективность такой доставки невысока,

поскольку большая часть ДНК подвергается лизосомному разрушению. Так-

же для доставки генетической конструкции синтезируют конъюгаты ДНК с

различными молекулами, способными обеспечить ее сохранность, адресную

доставку и проникновение в клетку.

В последние годы проводятся интенсивные эксперименты по созданию

искусственной 47-й хромосомы, которая позволила бы включить большое

количество генетического материала с полным набором регуляторных эле-

ментов для одного или нескольких терапевтических генов. Это дало бы воз-

можность использовать геномный вариант терапевтического гена и тем са-

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.3. Основы молекулярной терапии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 152

мым обеспечить его стабильность и эффективную длительную экспрессию.

Проведенные эксперименты показали, что создание искусственной хромосо-

мы человека, содержащей терапевтические гены, вполне реально, однако по-

ка непонятно, каким образом вводить такую огромную молекулу в ядро клет-

ки-мишени.

Основными проблемами, которые стоят перед генной терапией, поми-

мо риска тяжелой иммунной реакции, являются трудности длительного хра-

нения и функционирования терапевтической ДНК в организме пациента,

мультигенность многих болезней, делающая их трудной мишенью для ген-

ной терапии, а также риск использования вирусов в качестве векторов.

Помимо рассмотренных нами способов лечения генетических заболе-

ваний с помощью введения в дефектную клетку терапевтических генов, ак-

тивно разрабатываются лекарственные средства на основе нуклеиновых ки-

слот: антисмысловые олигонуклеотиды, РНК-ферменты (рибозимы), олиго-

нуклеотиды, корректирующие мутации in vivo. Эти средства направлены

прежде всего на лечение заболеваний, связанных с гиперпродукцией белков

(рак, воспаления, вирусные и паразитные инфекции). Уменьшить продукцию

можно снижением уровня транскрипции или трансляции. Этого можно дос-

тичь несколькими способами: гибридизацией соответствующего олигонукле-

отида со специфическим геном или мРНК, блокированием фактора транс-

крипции белка, уменьшением количества мРНК в результате расщепления

РНК-ферментами и т.п. Рассмотрим принципы некоторых из них.

Рибоолигонуклеотид, который связывается с определенной мРНК и тем

самым ингибирует трансляцию кодируемого ею белка, называется «анти-

смысловой» мРНК. Этот механизм используют некоторые бактерии для регу-

лирования генов (рис. 3.20

). На практике применяют искусственно сконст-

руированные гены, у которых ДНК-вставка находится в такой ориентации,

чтобы их транскрипты были антисмысловыми по отношению к мРНК-

мишени (рис. 3.21

). Было показано, что возможно использование синтетиче-

ских антисмысловых олигонуклеотидов, однако их терапевтический эффект

будет сильно зависеть от их устойчивости к действию клеточных нуклеаз,

системы доставки и специфичности их гибридизации. Для определения наи-

более эффективных сайтов-мишеней на специфической мРНК производят

тестирование набора антисмысловых олигонуклеотидов длиной 15–20 осно-

ваний с культурой клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Состав синтезиро-

ванных белков определяют электрофорезом и устанавливают, введение како-

го олигонуклеотида приводит к снижению синтеза белка-мишени.

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.3. Основы молекулярной терапии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 153

Рис. 3.20. Регулирование гена бактериоферритина (bfr)

с помощью антисмысловой РНК

Рис. 3.21. Ингибирование трансляции мРНК

синтетическим антисмысловым олигонуклеотидом

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.3. Основы молекулярной терапии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 154

Для защиты от нуклеазного расщепления синтезируются модифицирован-

ные олигонуклеотиды, при этом не утратившие способность гибридизовать-

ся. На рис. 3.22

приведены структуры модифицированных нуклеотидов, эф-

фективность которых интенсивно изучается. Например, показано, что олиго-

нуклеотиды с заменой свободного кислорода фосфодиэфирной связи на серу

(структура б) эффективно гибридизуются с комплементарной РНК-мишенью

и полученные РНК-ДНК дуплексы активируют внутриклеточную рибонук-

леазу Н. Этот эндогенный фермент, гидролизует РНК-последовательность в

таких гибридах. С такими олигонуклеотидами уже проведены многообе-

щающие клинические испытания, в которых мишенями являлись РНК цито-

мегаловируса, ВИЧ, некоторых РНК, ответственных за развитие рака.

Рис. 3.22. Модификации олигонуклеотидов: а – нормальная фосфодиэфирная связь;

б – тиофосфатная связь; в – фосфамидная связь; г – 2'-O-метилрибоза;

д – С-5-пропинилцитозин

Для эффективной доставки антисмысловых олигонуклеотидов их часто

пакуют в липосомы, в свою очередь модифицированные специфическими ли-

гандами, обеспечивающими адресную доставку (такой прием мы уже встречали,

когда рассматривали способы невирусной доставки терапевтических генов).

К настоящему времени проведен ряд испытаний и показана высокая терапев-

тическая эффективность антисмысловых олигонуклеотидов для подавления

нежелательной пролифирации гладкомышечных клеток (осложнения после

ангинопластики, коронарного шунтирования, атеросклероз), для лечения ви-

русных инфекций и малярии.

Принцип действия и строение рибозимов – природных РНК, обладаю-

щих нуклеазной активностью, показан на рис. 3.23

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.3. Основы молекулярной терапии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 155

Рис. 3.23. Расщепление мРНК под действием рибозимов.

Стрелкой показан сайт расщепления

Обнаружено, что эти короткоцепочечные РНК способны эффективно

подавлять экспрессию вирусных генов, онкогенов, факторов роста и других

терапевтически важных генов, расщепляя их мРНК [8

]. Модифицируя суб-

страт-связывающую последовательность, можно получать рибозимы, специ-

фичные к определенной мРНК. Рибозимы можно синтезировать непосредст-

венно в клетке транскрипцией синтетического олигодезоксирибонуклеотида,

кодирующего каталитический домен и фланкирующие его гибридизующиеся

участки. Такой олигонуклеотид встраивают в эукариотический экспресси-

рующий вектор и помещают в клетку. Образующаяся РНК самопроизвольно

приобретает активную конформацию, так называемую форму «головки мо-

лотка». Множество рибозимов различной структуры и активности синтези-

ровано химически. Например, в лаборатории нуклеиновых кислот Института

химической биологии и экспериментальной медицины СО РАН (Новоси-

бирск) проводятся многолетние исследования по получению синтетических

рибозимов, обладающих повышенной активностью и стабильностью. Для по-

вышения защиты от преждевременного расщепления внутриклеточными

нуклеазами получают различные производные рибозимов – с метилирован-

ными 2'-гидроксильными (см. рис. 3.22, г

) группами, бинарные конструк-

ции и т.п. Строение молекулы рибозима существенным образом влияет на

его эффективность. На рис. 3.24

показана кинетика расщепления мРНК гена

множественной лекарственной устойчивости mdr1 с помощью синтезирован-

ных рибозимов разной структуры.

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.3. Основы молекулярной терапии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 156

а б

Рис. 3.24. Расщепление 190-звенного 5'-концевого фрагмента MDR1 мРНК

модифицированными бинарными (1,3) и полноразмерными (2,4) рибозимами:

а – структура РНК с выделенным специфическим сайтом; б – накопление

продуктов расщепления (материалы предоставлены А.Г. Веньяминовой,

ИБХиФМ, Новосибирск)

Особое место в молекулярной терапии занимают так называемые ме-

тоды активирования пролекарств. Например, одним из способов генной те-

рапии рака является уничтожение опухолевых клеток с помощью активиро-

ванного производного ганцикловира (GCV, производное гуанозина), продук-

та гена тимидинкиназы, из уже упомянутого нами вируса простого герпеса

HSVtk. Опухолевые клетки трансфецируют in vivo геном HSVtk под актив-

ным промотором и через несколько дней вводят ганцикловир, который фос-

форилируется вирусной тимидинкиназой до монофосфата, а затем киназами

клетки-хозяина до трифосфата. Это производное ингибирует ДНК-полимеразу и

останавливает синтез ДНК, что приводит к гибели пролифилирующих кле-

ток. Через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат проникает в со-

седние немодифицированные клетки и таким образом уничтожается допол-

нительно до десятка опухолевых клеток. Ген, приводящей к гибели собст-

венной клетки, называется геном «самоубийства» (в нашем случае это ген

тимидинкиназы), а термин «пролекарство» относится к неактивной форме

лекарственного вещества (в данном случае это ганцикловир). Этот подход

был использован и для создания других вариантов комбинации ген–

активатор–пролекарство, но эффективность системы GCV-HSVtk уже дока-

зана рядом доклинических испытаний.

Генная терапия является новой лечебной дисциплиной, становление

которой происходит на наших глазах. Несмотря на некоторые успехи и мно-

гообещающие перспективны, существует ряд проблем, которые еще пред-

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.3. Основы молекулярной терапии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 157

стоит преодолеть. Часть проблем лежит далеко не в плоскости медицины и

молекулярной биологии. Речь идет о проблемах этических и политических.

Как вы уже заметили, мы рассматривали методы генетической терапии толь-

ко соматических клеток. Это означает, что произведенные коррекции огра-

ничиваются определенным органом или тканью, «исправленные» гены не

будут передаваться следующему поколению. Изменения генотипа зародыше-

вых клеток (сперматозоидов или яйцеклеток) или оплодотворенных клеток

должны передаваться из поколения в поколение.

В настоящее время генная терапия соматических клеток отнесена к

стандартным методам медицинского вмешательства. В противоположность

этому генная терапия зародышевых клеток является технологически гораздо

более сложной, проблематичной и непредсказуемой. Поэтому эксперименты

в этой области во многих странах запрещены.

В конце 80-х гг. в США были установлены правила, регулирующие ис-

пытания в области генетической терапии соматических клеток. Они гаранти-

руют беспристрастный и репрезентативный отбор больных и их информиро-

ванность (насколько опасно лечение, какова вероятность его успеха и пр.),

конфиденциальность сведений о больных и произведенных исследованиях,

осуществление всех манипуляций должным образом без причинения вреда,

как конкретным больным, так и человеческой популяции в целом.

Поскольку лечение соматических клеток приводит к улучшению со-

стояния и значительному продлению жизни больных с генетическими забо-

леваниями, но «улучшенный» ген не передается по наследству, существует

мнение, что это приведет к накапливанию генетических заболеваний в чело-

веческой популяции. Однако, по данным популяционной генетики, для суще-

ственного повышения частоты вредного гена в результате эффективного ле-

чения требуются тысячи лет.

Вряд ли в наше время найдется человек, незнакомый с фантастически-

ми рассказами и фильмами о человеческих клонах, творящих то добро, то

зло, используемых недальновидными политиками или тупыми солдафонами.

Современный уровень знаний и методы манипулирования с генетическим

материалом, получение различных трансгенных животных создают впечат-

ление, что клонирование человека – дело не столь отдаленного будущего.

Привлекательность идеи получения копий животных с улучшенными полез-

ными свойствами или копий гениальных людей, или просто живой копии по-

гибшего дорогого человека подогревает интерес к проблеме. Процедура кло-

нирования млекопитающих в принципе заключается в следующем: в энук-

леированную (лишенную ядра) яйцеклетку вводят ядра соматических клеток

донора и развивающиеся яйцеклетки на стадии бластоцист вносят в матку

суррогатной матери. При этом будет получено потомство с тем же геноти-

пом, что и у донора, или, другими словами, его генетический клон. Именно

так была получена клонированная овечка Долли. Однако, как показали мно-

гочисленные эксперименты, проблема клонирования не так проста, как пер-

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.3. Основы молекулярной терапии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 158

воначально думали, имеется множество «подводных камней» и рано строить

рассчитанные под клоны коровники. Разговоры же о клонировании человека

лишены оснований и безответственны.

Нерешенными остаются главные вопросы.

1. Способны ли ядра соматических клеток полностью и эквивалентно

заменить ядра зародышевых клеток в их функции обеспечения нормального

развития зародыша? Соматические клетки – это специализированные клетки,

прошедшие определенный цикл развития, затрагивающий, в том числе, и мо-

дификацию ДНК (изменения в некодирующих повторах, укорачивание тело-

мер и пр.). Тщательный молекулярно-генетический анализ функционирова-

ния ядер пересаженных соматических клеток показал, что 4 % генов работа-

ют неправильно, включаются не в том месте, не в то время или не включают-

ся вовсе. Как возвратить изменившиеся ядра клеток в исходное состояние,

«поймать» такую соматическую клетку, ядро которой не утратило свой по-

тенциал?

2. Какова вероятность полного сходства потомков? Даже если удастся

получить нормально развивающиеся эмбрионы, условия их развития в матке

различных приемных матерей будут различаться. Существующие определен-

ные пределы колебаний проявления данного гена в фенотипическом призна-

ке неизбежно приведут к тому, что одинаковые гены будут проявляться по-

разному и вероятность получения полного сходства потомков крайне мала.

3. Даже если развивающиеся яйцеклетки трансплантировали сотне при-

емных матерей и получили хотя бы одну-единственную живую и точную ко-

пию индивида (процент успеха крайне низок!), встанет вопрос: а что с ос-

тальными зародышами? Часть неизбежно погибнет, а остальные – уроды? И как

поступить с этими искусственно созданными несчастными? Запрет такого

рода исследований как аморальных является вполне естественным. В нашей

стране на манипуляции с человеческими зародышами принят мораторий.

Репродуктивное клонирование человека запрещено, но вопрос о тера-

певтическом клонировании остается открытым. Суть его заключается в сле-

дующем: ядро соматической клетки пациента трансплантируется в яйцеклет-

ку донора, выращивается до стадии бластоцисты, внедряется в стенку матки.

Внутри содержится так называемая внутренняя клеточная масса из эмбрио-

нальных стволовых клеток, из которых развиваются органы и ткани зароды-

ша. Предполагается, что благодаря их колоссальному потенциалу к развитию

в разных направлениях, из них можно будет получать «запчасти» для пере-

садки пациенту – хозяину ядра. Но что это за запчасти, если 4 % генов будут

работать неправильно? Ведь известно, что при пересадке эмбриональных

стволовых клеток приблизительно у 30 % реципиентов развиваются опухоли.

И, кроме того, не надо забывать об этических проблемах, связанных с поис-

ками доноров яйцеклеток и суррогатных матерей. В такой ситуации многие

ученые высказываются в пользу проведения масштабных работ в этом на-

правлении на экспериментальных животных и объявлении хотя бы времен-

ного моратория на использование этой техники в клинике и призывают про-

являть максимум осторожности и аккуратности при решении проблем, свя-

занных с клонированием человека.

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 159

Биотехнология как наука базируется на использовании биологических

процессов в технике и промышленном производстве.

В свете современных представлений биотехнология растений – это

соединение методов культуры клеток и тканей растений с методами молеку-

лярной биологии и техникой рекомбинантных ДНК. Созданная система –

клетки и ткани высших растений, выращиваемые вне организма на искусст-

венных питательных средах в строго контролируемых условиях – позволяет

изучать рост, клеточную дифференцировку и развитие растительного орга-

низма, разрабатывать новые клеточные технологии для промышленности и

сельского хозяйства [6

Вся сфера научной деятельности по реорганизации геномов обычно на-

зывается биотехнологией, хотя этот термин включает в себя более широкий

круг понятий, чем культура изолированных тканей, генная и хромосомная

инженерия.

Роль биотехнологии и, в частности, культуры изолированных тканей,

состоит в решении таких глобальных проблем, как обеспечение населения

продовольствием, более эффективная медицина, оптимальная экология.

Несомненно, что в настоящее время наиболее перспективными обсуж-

даемыми и иногда осуждаемыми направлениями биотехнологии являются

генная и хромосомная инженерии, но вытекали они из культивирования изо-

лированных органов, тканей и клеток и немыслимы без него.

Методы культивирования изолированных фрагментов растений осно-

ваны на использовании важного свойства растительной клетки — тотипо-

тентности [11].

Тотипотентность (лат. Totus – весь, potentia – сила) – это свойство

клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую ее диффе-

ренцировку и развитие до целого организма.

Тотипотентностью обладают оплодотворенные яйцеклетка растений и

яйцо животных организмов. Что касается дифференцированных клеток, то у

животных тотипотентность присуща только некоторым клеткам кишечнопо-

лостных. Так, соматические клетки гидры дают начало новому организму.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 160

У высших животных с ранних этапов эмбриогенеза, с началом специализа-

ции клеток, тотипотентность не реализуется. Однако клетки, изолированные

из эмбрионов млекопитающих, в условиях культивирования могут сохранять

плюрипотентность – способность дифференцироваться во все типы клеток

как собственно зародыша, так и экстраэмбриональных тканей. Такие клетки

получили название эмбриональных стволовых клеток.

У растений в природных условиях (in vivo) тотипотентность могут про-

являть и специализированные клетки. Пример тому – вегетативное размно-

жение, в том числе наблюдаемое в результате развития растений из клеток

листьев бегонии, узумбарской фиалки или каланхое.

Тотипотентность у растений реализуется и при заживлении ран. В этом

случае на раневой поверхности растений в результате неорганизованной про-

лиферации клеток происходит развитие каллуса (лат. callus – толстая кожа,

мозоль).

Образование каллуса можно наблюдать при прививках в местах сра-

стания привоя и подвоя. Каллус способствует заживлению ран и первона-

чально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на ране-

вой поверхности дают клетки тканей, способные к дедифференциации (кам-

бий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Впоследствии в каллусе может иметь

место вторичная дифференциация с образованием специализированных тканей и

органов.

Однако в природных условиях растения ряда систематических групп

тотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клеток многие

однодольные растения утратили способность к раневой реакции и вегетативно-

му размножению.

Возможность реализации супрессированной in vivo и активной тотипо-

тентности предоставляется в условиях in vitro при выращивании фрагментов

тканей, органов или клеток на искусственных питательных средах. Этот пе-

реход специализированных клеток к эмбриональным синтезам, последующе-

му делению с образованием недифференцированных клеток, а затем и к по-

вторной дифференциации осуществляется под действием экзогенных фито-

гормонов.

Образование каллуса впервые описано французским энциклопедистом

Дугамелем (1756), опубликовавшим результаты по изучению циркуляции

клеточного сока и заживлению ран у растений, срастанию тканей при при-

вивках.

Позже выполненный микроскопический анализ срезов каллуса, инду-

цированного на стеблях декоративных древесных растений, позволил Треку-

лу (1853) выявить, что образование каллуса может происходить от разных

тканей (камбиальной, флоэмы и очень молодых частей ксилемы).