Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 131

ментный анализ, общую схему которого можно представить следующим

уравнением:

АГ (или АТ) + АТ~Е (или АГ~Е) → АГ ~ АТ~Е + S → P,

где Е – это фермент; АТ~Е – антитело, меченное ферментном (химически

синтезированный комплекс); S – субстрат данного фермента; Р – продукт

ферментативной реакции, обладающий каким-либо визуальным признаком

(окраской, флуоресценцией или люминесценцией).

Рис.3.5. Взаимодействие антиген – антитело

По интенсивности полученного от продукта сигнала судят о наличии и

количестве молекулы-мишени. Широко распространенной разновидностью

иммуноферментного анализа является так называемый ферментный иммуно-

сорбентный анализ (ELISA, по английской транскрипции названия метода).

Схема такого анализа приведена на рис. 3.6

Поскольку иммуноферментный метод получил весьма широкое рас-

пространение, поиск ферментов, как можно более полно удовлетворяющих

всем требованиям, продолжается и в настоящее время. Весьма перспектив-

ными оказались биолюминесцентные ферменты – люциферазы – белки, од-

ним из продуктов реакций которых является квант света в видимой области

спектра. Все люциферазы считаются оксигеназами, т.е. катализируют реак-

ции окисления субстрата молекулярным кислородом.

Перспективность аналитического использования люцифераз обуслов-

лена высоким квантовым выходом биолюминесцентной реакции. Например,

для люциферазы, выделенной из светляков, он составляет около 90 %. В на-

стоящее время известно огромное количество различных биолюминесцент-

ных животных, в основном морских, изучены их биолюминесцентные систе-

мы, клонированы гены люцифераз, установлены структуры и синтезированы

молекулы субстратов. Особое место среди биолюминесцентных белков за-

нимают Са

-активируемые фотопротеины морских кишечнополостных. Мо-

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 132

лекула фотопротеина представляет собой стабильный фермент-субстратный

комплекс, состоящий из односубъединичного полипептида (молекулярная

масса около 20 кДа) и «преактивированного» кислородом субстрата,

2-гидропероксицелентеразина, прочно, но нековалентно связанного с белком.

Биолюминесценция инициируется ионами кальция и возникает вследствие

окислительного декарбоксилирования связанного с белком субстрата.

Рис. 3.6. Схема проведения ELISA: Е – репортер-

ный фермент; S, Р – субстрат и визуально опре-

деляемый продукт фермента соответственно

В Институте биофизики СО РАН была клонирована кДНК одного из

фотопротеинов – обелина гидроидного полипа Obelia longissima, сконструи-

рован штамм E.coli – суперпродуцент апобелка и разработана высокоэффек-

тивная технология его выделения, позволяющая получать 50–70 мг высоко-

очищенного рекомбинантного обелина. Было показано, что белок стабилен

при хранении в растворе и лиофилизованном виде, а также при проведении

химических и генно-инженерных модификаций. Синтезированные конъюга-

ты с другими белками (авидином, иммуноглобулинами и др.) и гаптенами

(биотином, тироксином) были использованы в качестве меток для иммуноа-

нализа целого ряда диагностически важных веществ (альфафетопротеинов,

гормонов различной природы, антител на инфекционные агенты) и проде-

монстрирована их перспективность и преимущества по сравнению с другими

метками.

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 133

Это высокая чувствительность анализа, сравнимая с изотопной меткой

(благодаря высокому квантовому выходу реакции (25–30 %) определяют

атомолярные количества фотопротеина); практически полное отсутствие фо-

нового сигнала вследствие высокой специфичности фотопротеина к ионам

Са

; практически неограниченный линейный диапазон зависимости биолю-

минесцентного сигнала от концентрации фотопротеина (при насыщающей

концентрации Са

величина светового потока прямо пропорциональна коли-

честву белка, поскольку он непосредственно участвует в реакции); простота

запуска (надо только добавить раствор Са

) и высокая скорость реакции (от-

сутствие дополнительных субстратов или кофакторов, биолюминесцентная

реакция происходит в течение нескольких секунд); отсутствие токсичности.

Наличие коммерчески доступных современных высокочувствительных фо-

тометров, в том числе и планшетного формата, позволяет надеяться, что в

самое ближайшее время биолюминесцентный иммуноанализ найдет широкое

практическое применение в медицинской диагностике.

На рис. 3.7

показан пример использования обелина как репортера в

ИФА тиреотропного (ТТГ) гормона в сыворотке. Можно видеть, что резуль-

таты биолюминесцентного определения этого гормона в сыворотках пациен-

тов хорошо коррелируют с результатами РИА. Если чувствительность имму-

ноферментного анализа обеспечивается ферментативной реакцией репортера

и чувствительностью инструментов для измерения соответствующего сигна-

ла, то его специфичность зависит от аффинности иммуноглобулинов к моле-

куле-мишени. Для получения иммуноглобулинов к данной мишени его очи-

щенный (в случае белков) или дезактивированный (в случае патогенного ор-

ганизма) препарат используют для иммунизации экспериментальных живот-

ных. Антитела, которые при этом образуются в сыворотке (антисыворотке)

животного (мыши, кролика и др.), представляют собой смесь иммуноглобу-

линов к различным антигенным детерминантам (эпитопам) мишени. Такую

смесь антител называют поликлональными антителами. Их использование

для некоторых методов диагностики имеет два недостатка:

1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может

варьировать от одной партии к другой;

2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо раз-

личить две сходные мишени, отличающиеся единственной детерминантой.

В настоящее время используются моноклональные антитела, получае-

мые с помощью технологии гибридом. Эта технология состоит в создании

клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, высокоспецифич-

ные к одному эпитопу антигена-мишени. Известно, что В-лимфоциты, про-

дуцирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. В то же время

клетки миеломы прекрасно пролиферируют и при их слиянии с лимфоцитами

могут образовываться гибридные клетки, обладающие требуемыми свойст-

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 134

вами. Кратко процедура получения гибридных клеток состоит из следующих

этапов:

1) клетки селезенки иммунизированных антигеном животных смеши-

вают с взвесью миеломных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанин-

фосфорибозилтрансферазе (HGPRT

–

) в 35 %-м растворе полиэтиленгликоля,

и высевают в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (сре-

да ГАТ);

2) на 10–14-е сут в среде остаются только слившиеся клетки селезенки-

миеломы (остальные гибриды и исходные клетки погибают);

3) полученные гибриды выращивают на полной среде без ГАТ и иден-

тифицируют с помощью иммунного анализа, затем субкультивируют, чтобы

получить отдельные клоны.

[ ТТГ ], µМЕ/мл

0.1 1 10 100

Биолюминесценция

100

Рис. 3.7. Схема (вверху) и результаты (слева) биолюминесцентного им-

муноанализа ТТГ сэндвич-типа. Справа – корреляция результатов био-

люминесцентного (BLIA) и радиозотопного (RIA) методов определения

содержания ТТГ в сыворотках пациентов (R = 0,96, n = 39)

Применение моноклональных антител позволяет существенно повы-

сить специфичность иммуноанализа. Часто для определения одной мишени

применяют два моноклональных антитела на разные эпитопы (сэндвич-

анализ): первое антитело используют для первичной сорбции антигена на по-

верхности, а второе, меченное ферментом, – для обнаружения антигена (см.

пример на рис. 3.7

Существующий рынок иммунодиагностикумов, поставляемых различ-

ными зарубежными и отечественными фирмами, чрезвычайно разнообразен

(табл. 3.1

µU/мл, RIA

0 10 20 30 40 50 60

U/мл, BLIA

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 135

Таблица 3.1

Важнейшие антигены определяемые

коммерческими иммуноферментными диагностикумами

Полипептидные гормоны

Хорионический гонадотропин

Гормон роста

Лютеинезирующий

Фолликулстимулирущий

Тиреотропный гормон

Пролактин

Маркеры опухолей

Канцероэмбриальный антиген

Специфичекий антиген предстательной железы

Рецептор интерлейкина-2

Рецептор фактора роста эпидермиса

Альфафетопротеин

Цитокины

Интерлейкины 1–8

Колониестимулирующий фактор

Лекарственные препараты

Теофиллин

Гентамицин

Циклоспорин

Различные соединения

Тироксин

Витамин В12

Ферритин

Продукты распада фибрина

Tau-белок

Инфекционные заболевания

Хламидиоз

Герпес

Краснуха

Гепатиты А, В, С, D

Легионеллез

СПИД

Клещевой энцефалит

Рассмотренные нами варианты иммуноанализа представляют собой так

называемые гетерогенные методы, когда иммунокомплекс формируется на

поверхности, а непрореагировавшие и неспецифичные компоненты удаляют-

ся с помощью промывок. Существует другая группа методов, не требующих

разделения компонентов (гомогенные методы). В основе гомогенного ИФА

лежит потеря активности маркерного фермента в результате реакции АГ-АТ

либо, наоборот, восстанавление активности фермента в результате реакции

АГ-АТ. Как правило, эти методы не являются количественными и применя-

ются для получения ответа «да» – «нет» (например, диагностирование бере-

менности).

Иммуноанализ имеет свои ограничения: в случае диагностирования

инфекционного заболевания с помощью него невозможно различить антите-

ла индуцированные в результате прививки и в ответ на инфицирование; если

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 136

речь идет об особо опасных инфекциях, когда антитела не успевают образо-

ваться или не образуются вовсе; если поражается иммунная система (СПИД);

иногда он не в состоянии обеспечить необходимую чувствительность и т.д.

Незаменимыми и весьма эффективными в таких случаях являются ме-

тоды, основанные на детекции определенных нуклеотидных последователь-

ностей, – ДНК-гибридизационный анализ. Инфекционные агенты (бактерии,

вирусы и пр.) представляют собой живые организмы, их информация заклю-

чена в генетическом материале. Фрагмент ДНК, детерминирующий данный

биологический объект, имеет строго определенную нуклеотидную последо-

вательность и может служить диагностическим маркером. Процедура любого

гибридизационного анализа состоит в следующем:

1) иммобилизация одноцепочечной ДНК-мишени на твердой подложке

(мембранный фильтр, поверхность планшета и т.п.);

2) спаривание меченной комплементарной последовательности (ДНК-

зондом) с ДНК-мишенью при определенных условиях (температуре и ионной

силе);

3) удаление несвязавшегося ДНК-зонда;

4) детекция гибридных молекул зонд-мишень.

Таким образом, в процедуре ключевыми являются три компонента:

ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции полученных гибридов (рис. 3.8

Специфичность анализа определяется ДНК-зондами, а чувствительность –

методами детекции. В зависимости от ситуации используют зонды различной

длины (20–100 нуклеотидов). Они представляют собой продукты химическо-

го синтеза или клонирования.

Рис. 3.8. Один из вариантов проведения ДНК-гибридизаци-

онного анализа. В качестве метки используют изотопы, спе-

цифические гаптены, последовательности ДНК, белки

Для получения зондов клонированием проводят следующие процедуры:

1) расщепляют ДНК патогенного микроорганизма эндонуклеазой и клониру-

ют в плазмидном векторе; 2) проводят скрининг рекомбинантных плазмид с

использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штам-

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 137

мов; 3) плазмиды, гибидизующиеся только с ДНК патогенного штамма, ис-

пользуют для получения видоспецифичных зондов. Эти зонды дополнитель-

но проверяют на отсутствие перекрестной гибридизации с ДНК из различных

организмов и на модельных образцах для определения чувствительности метода.

Химический синтез олигонуклеотидов еще 20 лет назад представлял

собой сложную экспериментальную задачу, связанную с большими затрата-

ми времени и реактивов, поэтому олигонуклеотиды были достаточно дороги.

В настоящее время получение олигонуклеотидов осуществляется с помощью

автоматических синтезаторов, и исследователь должен только правильно оп-

ределить, какая именно нуклеотидная последовательность необходима для

решения поставленной задачи.

Во всех синтезаторах синтез осуществляется твердофазным методом,

т.е. первый нуклеозид иммобилизован на поверхности нерастворимых поли-

мерных частиц, а растущая цепочка экспонирована к реакционной смеси, в

которой находятся все необходимые реагенты. Частицы упакованы в коло-

ночных реакторах, через которые последовательно прокачиваются растворы

веществ, обеспечивающих протекание процессов синтеза. С целью создания

оптимальных гидродинамических параметров колонки частицы имеют сфе-

рическую форму и одинаковые размеры. Ключевыми мономерами для синте-

за являются четыре производных нуклеозид-фосфорамидита (рис. 3.9

), в ко-

торых все функциональные группы заблокированы защитными группами.

5'-гидроксильная группа каждого мономера защищена диметокситритильной

группировкой (DMTr), которая легко удаляется при кислотной обработке,

например, трихлоруксусной кислотой (ТХУ). По 3'-положению находится

метилированная фосфитамидная группа.

Рис. 3.9. Мономеры для твердофазного

фосфитамидного синтеза олигонуклеотидов

(синтоны)

Экзоцикличные аминогруппы, находящиеся в составе гетероцикличе-

ских оснований В (гуанина, аденина и цитидина) заблокированы группиров-

ками (ацильные остатки), которые удаляются в щелочных условиях по окон-

чании синтеза. Такие мономеры называются синтонами.

Схема химического синтеза олигонуклеотидов приведена на рис. 3.10

Рассмотрим несколько примеров проведения гибридизационного ана-

лиза (рис. 3.11

). На неподвижной матрице в качестве зонда иммобилизовали

20-звенный олигонуклеотид ЗI, комплементарный участку ДНК вируса гепа-

тита С. В качестве неподвижной фазы использовали поверхности планшетов

или полимерных частиц. Иммобилизацию проводили с помощью ковалент-

ной пришивки.

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 138

Рис.3.10. Схема химического

синтеза олигонуклеотидов: Р –

нерастворимый полимер или

стекло – частицы, на поверх-

ности которых фиксированы

первые нуклеотиды и расту-

щая олигонуклеотидная

цепь; В1, В2… – нуклеотид-

ные основания; DMTr –

диметок-ситритил

Рис. 3.11. Схема проведения твердофазного ДНК-гибридизационного анализа.

Для выявления гибридов использовали конъюгаты репортерного белка с авидином

или стрептавидином

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 139

В качестве ДНК-матрицы использовали синтетический 30-звенный

олигонуклеотид МI*, несущий на 3’-конце остаток биотина (*) (рис. 3.11

, ва-

риант А). После гибридизации и удаления непрореагировавших молекул (с

помощью промывок) обнаружение образовавшихся комплексов проводили с

помощью конъюгатов – стрептавидин-щелочная фосфатаза или стрептави-

дин-обелин. Известно, что стрептавидин из стрептококка или его аналог ави-

дин из белка куриных яиц обладают чрезвычайно высоким сродством к био-

тину (Кд = 10

–15

М). Эти белки состоят из 4 одинаковых субъединиц, каждая

из которых имеет сайт связывания с биотином.

Таким образом, стрептавидин (или авидин) часто используют в качест-

ве стабильного и специфического мостика для формирования межмолеку-

лярных комплексов, в том числе и при иммуноанализе. Образовавшиеся ком-

плексы со щелочной фосфатазой обнаруживали спектрофотометрически, из-

меряя оптическую плотность продукта ее реакции с субстратом. Комплексы с

обелином обнаруживали, измеряя интенсивность светового потока, возни-

кающего при добавлении ионов Са

. На этом же рисунке показан другой ва-

риант обнаружения гибридов (рис. 3.11

, вариант Б) с помощью наращивания

дуплекса ферментативным удлинением зонда с помощью Taq-полимеразы в

присутствии биотинилированного производного дезоксиуридинтрифосфата

(dUTP*).

Другой вариант проведения гибридизационного анализа показан на

рис. 3.12

. В данном случае при проведении ПЦР были использованы химиче-

ски синтезированные праймеры, имеющие на концах биотиновые группы. Полу-

ченные при этом биотинилированные ампликоны иммобилизовали на поверхно-

сти, предварительно активированной стрептавидином. Для обнаружения ам-

пликонов использовали зонд, состоящий из двух частей – химически синте-

зированного фрагмента, комплементарного определенному участку матрицы,

и поли-А-фрагмента, присоединенного с помощью терминальной трансфера-

зы. После гибридизации полученные дуплексы обнаруживали с помощью

обелиновой метки, представляющей собой химически синтезированный

конъюгат обелина с олигонуклеотидом dT

Рис. 3.12. Вариант проведения твердофазного ДНК-гибридиза-

ционного анализа. Специфический зонд содержит поли-А-

последовательность, метка представляет собой химический

конъюгат репортерного белка обелина с олигонуклеотидом dТ

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 140

Современные методы позволяют проводить диагностику на исходном

материале (клинические образцы крови, кала, мочи, смывах слизистых) без

дополнительной очистки. Если концентрация ДНК-мишени слишком мала, ее

амплифицируют с помощью ПЦР.

Первым сертифицированным методом такого рода был метод определения

Chlamidia и gonococci в 1988 г. Сейчас целый ряд фирм производят диагно-

стические наборы для обеспечения нужд медицинских аналитических лабо-

раторий. Некоторые коммерческие диагностикумы, производимые в США,

представлены в табл. 3.2

Таблица 3.2

Коммерческие инфекционные диагностикумы, производимые в США

Организм

Время

анализа

Чувстви-

тельность,

Специфич-

ность, %

Образец Производитель

Chlamydia trachomatis 4 ч 96 100

Вагинальный

мазок

Digene

Neisseria gonnorhoeae

1-2 ч

99,2

99,3

Моча

Becton Dickinson

Mycobacterium tuber-

culosis

3,5 ч 91 98 Слюна Gen-Probe

MRSA

1,5 ч 91,7 93,5 Мазок из носа Infectio Diag. Inc

Group A Streptococci

24 ч 94,8 100

Фаренгиальный

мазок

Gen-Probe

Group B Streptococci 1,5 ч 94 95,9

Вагинальный

мазок

Infectio Diag. Inc

Gardnerella, Trichomo-

nas vaginalis, and Can-

dida spp.

45 мин 82–95 98–100

Вагинальный

мазок

Becton Dickinson

E. coli O157:H7

8 ч

Вода

Qualicon, Inc

Приведенные данные показывают, что современные диагностикумы

являются высокочувствительными, скоростными и надежными.

В России также существует ряд фирм, производящих аналогичные ди-

агностические наборы, одним из крупнейших является ООО «Вектор-Бест»

(Новосибирск). Однако необходимо отметить, что, к сожалению, удельный

вес импортных диагностикумов на российском рынке значительно выше оте-

чественных.

Помимо обнаружения инфекционных агентов, ДНК-диагностика при-

меняется для выявления генов наследственных заболеваний. ДНК-анализ ис-

пользуют для выявления носителей генов заболеваний, а также для прена-

тальной и пресимптоматической диагностики генетических нарушений. Ра-

нее для определения специфических мутаций использовали биохимические

методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. ДНК-тесты

устанавливают мутации непосредственно в последовательности гена без экс-

прессии и изучения кодируемого белка. В настоящее время разработан целый