Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 101

Численность населения планеты составляет 6,6 млрд (на 2008 г.), в год

увеличиваясь примерно на 80 млн. По прогнозам ООН, к 2020 г. население

Земли возрастет с нынешних 6,6 до 7,5 млрд чел

., а к 2050 г. превысит

9 млрд чел. Уже сейчас продовольствия не хватает (около 800 млн чел. в ми-

ре голодают), а в дальнейшем эта проблема только обострится, так как уве-

личение производства продуктов питания стало отставать от прироста насе-

ления. Все возможные территории для землепользования уже освоены, тра-

диционные способы повышения продуктивности сельскохозяйственного

производства себя уже исчерпали, а дефицит продуктов питания продолжает

нарастать. Так что альтернативы применению генно-инженерных сельскохо-

зяйственных культур не видно.

Генетически модифицированные продукты стали одним из достижений

биологии ХХ в. Рост потребления таких продуктов считается одним из спо-

собов борьбы с голодом.

Ныне во многих странах мира практически невоз-

можно избежать употребления генетически модифицированных растений.

Так, с большой долей вероятности можно сказать, что практически все про-

дукты, произведенные с использованием кукурузного, соевого или хлопково-

го масла, содержат генетически измененный материал.

Биобезопасность трансгенных растений остается предметов острых

дискуссий в обществе. Как и все принципиально новое в нашей жизни,

трансгенные растения неоднозначно воспринимаются обществом. Противни-

ки трансгенных растений утверждают, что возделывание таких растений мо-

жет быть опасно как для человека, так и для окружающей среды. Большинст-

во этих страхов, скорее всего, порождено недостаточным пониманием сущ-

ности трансгенных растений и просто неприязнью ко всему новому. Но неко-

торые аргументы против ГМ-растений заслуживают подробного рассмотре-

ния. Так, противники ГМ-растений утверждают, что трансгенные растения

способны негативно влиять на окружающую среду: через так называемый

«горизонтальный перенос генов» в микроорганизмы; непредусмотренное

воздействие на организмы, живущие в агроценозе или рядом (нецелевое воз-

действие); утечку трансгенов с пыльцой к диким родственникам, отрица-

тельно влияющую на биоразнообразие.

Что касается возможности переноса ДНК из ГМ-растений в микроорга-

низмы, наука пока таких фактов в природе не обнаружила. Если бы это на

самом деле происходило так быстро и просто, как считают оппоненты генной

инженерии растений, то за миллионы лет эволюции гены всех организмов

совершенно перемешались бы.

Преимущество белковых токсинов, продуцируемых ГМ-растениями,

перед синтетическими пестицидами очевидно: большие и нестойкие молеку-

лы белков не накапливаются в природе – быстро распадаются до аминокис-

лот; кроме того, они более специфичны, т.е. уничтожают только определен-

ных вредителей (бактерии, грибы, насекомые). В отличие от этого, маленькие

молекулы химических пестицидов почти не обладают избирательностью, по-

ражая все в зоне применения, и из-за высокой химической стабильности мо-

гут проходить по пищевым цепям и накапливаться на их вершине. Ярким

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 102

примером является запрещенный ДДТ, который после применения по пищевым

цепям попадает на стол человека в концентрированном и неизмененном виде.

Несостоятельными являются и утверждения, что перенос какого-либо

трансгена с пыльцой придаст дикому виду такое преимущество, что он вы-

теснит все остальные. Дикие растения, широко используемые селекционера-

ми для выведения новых сортов в качестве донора нужных признаков, не вы-

тесняют окружающие. Все культурные растения не выдерживают конкурен-

ции с дикими, они зависят от человека и способны существовать только с его

помощью. Пока биоразнообразию в первую очередь угрожает не замена од-

ного сорта (или даже десяти сортов) на другой, а превращение природных

ландшафтов в сельскохозяйственные.

Даже гипотетическая опасность заноса трансгенов с пыльцой в дикие

популяции родственных перекрестноопыляемых видов в настоящее время

может быть снята получением трансгенных растений с трансформированны-

ми хлоропластами (транспластомные растения), пыльца которых не содержит

трансгенов.

Практически все развитые страны приняли закон о регулировании ген-

но-инженерной деятельности. США, являясь признанным лидером не только

в создании трансгенных растений, но и в их производстве, имеет жесткое го-

сударственное регулирование: от планирования лабораторных эксперимен-

тов до международного маркетинга ГМ-растений.

Согласно практике, принятой в США, такое регулирование осуществ-

ляется на каждой стадии создания и внедрения ГМ-растений: планирование

генно-инженерных экспериментов → полевые испытания → токсикологиче-

ская оценка продуктов урожая → экотоксикологическая оценка производства

ГМ-растений → …→ выпуск трансгенных продуктов на внутренний и внеш-

ний рынок. Основными инстанциями, регулирующими создание и внедрение

ГМ-растений в США, являются: комитеты биобезопасности учреждений,

создающих ГМ-растений (Institutional Biosafety Committee), Служба Инспек-

ции здоровья животных и растений (Animal and Plant Health Inspection Service –

APHIS) Министерства сельского хозяйства США (USDA), Администрация

пищевых продуктов и лекарственных средств (Food and Drug Administration –

FDA), Агентство охраны окружающей среды (Environmental Protection Agen-

cy – EPA).

В России в настоящее время к выращиванию на полях не разрешено ни

одно трансгенное растение, но разрешен экспорт генетически модифициро-

ванной продукции. В России разрешены только испытания трансгенных рас-

тений, которые проводятся на специальных полигонах под строгим контро-

лем. Основополагающим нормативным документом в сфере производства,

импорта и реализации ГМ-продуктов является Закон РФ «О государственном

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 103

регулировании в области генно-инженерной деятельности» от 05.07.1996 г.

№ 86-ФЗ. Статья 11 Закона прямо устанавливает: «Продукция (услуги), по-

лученная с применением методов генно-инженерной деятельности, должна

соответствовать требованиям экологической безопасности, санитарных норм,

фармакопейных статей, обязательным требованиям государственных стан-

дартов РФ».

На данный момент не обнаружено однозначных доказательств, что ге-

нетически модифицированные продукты способны принести вред человеку.

Хотя выгода от применения ГМ-растений очевидна, существует много про-

тивников трансгенных растений, убежденных в их опасности и использую-

щих в своих аргументах невозможность ученых дать полную гарантию безо-

пасности подобных продуктов. В каждой стране мира вопрос об использова-

нии трансгенных растений решается по-разному местными законодателями.

Примерно в 30 странах мира действует правило, согласно которому

упаковки продуктов, при изготовлении которых использовались достижения

генной инженерии, должны содержать информацию об этом, чтобы потреби-

тели самостоятельно делали свой выбор. Однако во многих случаях, напри-

мер, когда соя используется при производстве мясных полуфабрикатов, про-

изводители не сообщают об этом покупателям.

С 1 июня 2004 г. в Российской Федерации установлен новый допусти-

мый порог наличия таких примесей в 0,9 %, который требуется количествен-

но точно детектировать и указывать на упаковке.

В отличие от растений, где существует возможность получения целого

фертильного растения из одной трансформированной соматической клетки и

вегетативное размножение, получение трансгенных животных – очень слож-

ный и длительный процесс. Используемая стратегия состоит в следующем:

1. Клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки.

2. Оплодотворенные яйцеклетки с экзогенной ДНК имплантируют в

рецепиентную женскую особь (поскольку успешное завершение развития

эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно).

3. Отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток,

которые содержат клонированный ген во всех клетках.

4. Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках

зародышевой линии, и получают новую генетическую линию.

Эксперименты по генетической модификации многоклеточных орга-

низмов путем введения в них трансгенов требуют много времени. Тем не ме-

нее, трансгеноз стал мощным инструментом для исследования молекулярных

основ экспрессии генов млекопитающих и их развития, для создания модель-

ных систем, позволяющих изучать болезни человека, а также для генетиче-

ской модификации клеток молочных желез животных с целью получения с

молоком важных для медицины белков. Был даже предложен новый термин

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 104

«фарминг» (pharming), относящийся к процессу получения из молока транс-

генных домашних животных аутентичных белков человека или фармацевти-

ческих препаратов. Использование молока целесообразно потому, что оно

образуется в организме животного в большом количестве и его можно надаи-

вать по мере надобности без вреда для животного. Вырабатываемый молоч-

ной железой и секретируемый в молоко новый белок не должен при этом

оказывать никаких побочных эффектов на нормальные физиологические

процессы, протекающие в организме трансгенного животного, и подвергать-

ся посттрансляционным изменениям, которые, по крайней мере, близки к та-

ковым в клетках человека. Кроме того, его выделение из молока, которое со-

держит и другие белки, не должно составлять большого труда.

Несмотря на то, что первые трансгенные сельскохозяйственные живот-

ные были получены в 1985 г. введением экзогенной ДНК в пронуклеус зигот,

до настоящего времени не разработано эффективного метода, который бы

мог быть использован для создания генетически модифицированных живот-

ных независимо от вида и от целей эксперимента. Разработка новых эффек-

тивных методов переноса генов в эмбриональные и соматические клетки жи-

вотных, а также совершенствование существующих подходов остается акту-

альной задачей.

Среди большого разнообразия способов внедрения экзогенной ДНК в

геном животного можно выделить следующие, которые нашли широкое при-

менение в практике трансгеноза:

– метод микроинъекции,

– опосредованный ретровирусами перенос генов,

– использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток,

– перенос трансформированных ядер генеративных и соматических

клеток,

– использование спермиев и сперматогониев как переносчиков ДНК.

Среди других способов доставки экзогенной ДНК в организм животных

можно отметить использование липосом, аденовирусных векторов, а также

метод высокоскоростной инъекции. Однако эти методы не нашли широкого

применения вследствие их недостаточной стабильности, а также отсутствия

интеграции трансгена в геном.

Микроинъекции рекомбинантной ДНК в оплодотворенные ооциты

многоклеточных животных пока остаются наиболее популярным способом

введения чужих генов в организм животных. Несмотря на то, что метод тре-

бует высокой квалификации и дорогостоящего оборудования, простота и на-

дежность окупают все его недостатки.

Первой и наиболее хорошо разработанной экспериментальной системой

для получения трансгенных животных явилась мышь. Донорных самок мышей с

экспериментальной суперовуляцией скрещивают с самцами-производителями,

через 12 ч выделяют оплодотворенные яйцеклетки и помещают их в культу-

ру. Далее в больший их двух пронуклеусов (обычно мужской) инъецируют

рекомбинантную ДНК (рис. 2.17

). Пережившие инъекцию яйцеклетки переса-

живают самкам-реципиентам. Только часть трансплантированных ооцитов

продолжает развиваться до рождения детенышей.

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 105

а б

Рис. 2.17. Микроинъекция экзогенной ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки

млекопитающих под микроскопом (а) и схема эксперимента (б)

На частоту интеграции экзогенной ДНК при использовании метода

микроинъекции оказывают влияние такие факторы, как чистота вводимого

образца, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора для микро-

инъекции, качество эмбрионов, а также способ пересадки эмбрионов реципи-

ентам (нехирургический, хирургический, лапароскопический).

Трансгенных животных в потомстве идентифицируют различными ме-

тодами, чаще всего ПЦР, и скрещивают для получения трансгенных линий.

Некоторые из трансгенных животных оказываются мозаичными (половые

клетки не содержат экзогенной ДНК), поэтому при скрещивании трансген-

ным оказывается меньшая часть потомства первого поколения, чем расчет-

ные 50 %. В ряде случаев гомозиготные линии получить не удается, посколь-

ку 5–15 % трансгенных инсерций в гомозиготном состоянии летальны, так

как инсерция иногда нарушает жизненно-важные части генома.

Точный механизм, обеспечивающий интеграцию инъецированной ДНК

в хромосомы клетки-мишени, неизвестен, однако анализ структуры встроен-

ной ДНК позволяет выявить некоторые моменты. Интеграция происходит

случайным образом в один хромосомный локус, который может содержать от

одного до нескольких тысяч тандемных копий интегрированной ДНК. Около

30 % полученных первичных трансгенных животных, как правило, обнару-

живают ту или иную степень мозаичности, что может являться следствием

интеграции экзогенной ДНК после завершения первого цикла репликации.

Степень интеграции экзогенной ДНК в геном, т.е. число трансгенных

животных от общего числа родившихся животных, при использовании мето-

да микроинъекции в зависимости от вида животных колеблется в незначи-

тельных пределах 5–15 % [4

]. Наиболее важным с учетом затрат, требую-

щихся для получения одного трансгенного животного, является показатель

общей эффективности трансгеноза, который рассчитывается как отношение

числа полученных трансгенных животных к общему числу пересаженных

эмбрионов, выраженное в процентах. Величина этого показателя для млеко-

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 106

питающих также относительно постоянна и составляет в среднем от ~0,5 % у

свиней и коров до ~2 % у мышей.

Ретровирусные векторы также используются для получения транс-

генных животных. Инфицирование предимплантационных эмбрионов ре-

комбинантными ретровирусами – относительно несложная эффективная

процедура. Восьмиклеточную морулу (рис. 2.18

) освобождают от яйцевой

оболочки и помещают в культуральную чашку с фибробластами, продуци-

рующими рекомбинантный ретровирус. Инфицированные эмбрионы, дос-

тигшие стадии бластулы, имплантируют псевдобеременным самкам. В ре-

зультате формируются трансгенные организмы, мозаичные по числу и лока-

лизации встроек рекомбинантной ДНК в геном. Поэтому для получения чис-

тых линий далее необходим масштабный аутбридинг.

Недостатком метода является ограничение вставки экзогенной ДНК

~8 тнп, вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих

регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии, а в не-

которых случаях интеграция в исходный локус нестабильна.

Новые лентивирусные векторы (лентивирусы принадлежат семейству

ретровирусов) показали свою очень высокую эффективность при доставке

ДНК в ооциты и зиготы. Инъекция рекомбинантных лентивирусных конст-

рукций в перивителлиновое пространство свиных зигот и коровьих ооцитов

привело к появлению потомства с самой высокой на данный момент долей

трансгенных особей. В то же время лентивирусные векторы обладают всеми

недостатками ретровирусных: малый размер вставки экзогенной ДНК и

множественная интеграция в хозяйский геном, которая может привести к та-

ким нежелательным побочными эффектам, как активация онкогенов и инсер-

ционный мутагенез. Кроме того, для лентивирусных векторов наблюдается

высокая степень мозаичности получаемого трансгенного потомства и от-

дельные факты сайленсинга (инактивации) лентивирусных рекомбинантных

последовательностей в полученных трансгенных линиях.

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой не-

достаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по

репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необ-

ходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в

то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровиру-

сы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного,

что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использо-

вать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта.

И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирус-

ные векторы редко используются для создания трансгенных животных,

имеющих коммерческую ценность.

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 107

Рис. 2.18. Схема получения линии трансгенных мышей

с использованием ретровирусных векторов

Модифицированные эмбриональные стволовые клетки могут быть

использованы для получения трансгенных животных. Клетки, выделенные из

мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в куль-

туре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том

числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на ста-

дии бластоцисты (рис. 2.19

). Такие клетки называются плюрипотентными

эмбриональными стволовыми клетками (ES). В ES-клетки в культуре можно

ввести целевой трансген различными методами (трансфекция, электропора-

ция, ретровирусная инфекция и т.д.) без нарушения их плюрипотентности.

Практическое достоинство этой схемы заключается в том, что она дает

большие возможности для проведения селекции клеток по определенному

параметру. Это может быть число копий трансгена, его локализация или ха-

рактер экспрессии.

Зная последовательности, окружающие конкретный сайт для желаемой

интеграции, можно сконструировать вектор для встраивания целевой ДНК

путем гомологичной рекомбинации. Например, заменить какой-либо ген, ко-

дирующий легко идентифицируемый признак с целью селекции, убрав или

восстановив его функцию в полученной трансгенной клетке. Таким же обра-

зом получают так называемых нокаутных мышей (knock out) – мышей с на-

правленно инактивированным определенным клеточным геном для исследо-

вания его функций. Для осуществления гомологичной рекомбинации вектор

конструируют из фрагментов целевого гена, который планируется инактиви-

ровать, часть целевого гена при этом заменяется каким-либо селективным

маркером для проведения отбора клеток с интегрированной конструкцией.

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 108

Рис. 2.19. Получение трансгенных мышей методом реконструкции эмбрионов с

помощью генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток

(ES-клеток). ES-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши

Отобранные трансгенные ES-клетки можно культивировать и исполь-

зовать для получения трансгенных животных. Это позволяет избежать слу-

чайного встраивания трансгена, характерного для метода микроинъекций и

ретровирусных векторных систем.

Все получаемые по такой схеме животные являются мозаиками, поэто-

му необходима селекционная работа по получению чистых линий. Проблему

мозаичности первичных трансгенных животных можно преодолеть пересад-

кой ядер трансформированных ES-клеток в энуклеированные ооциты, кото-

рые затем продолжают свое нормальное развитие. В результате в каждой

клетке полученного животного будет содержаться трансген.

К сожалению, плюрипотентные ES-клетки, аналогичные мышиным,

пока не обнаружены у других млекопитающих и птиц, но поиски продолжаются.

Перенос ядер трансформированных генеративных и соматических

клеток в яйцеклетку, или соматический ядерный перенос (somatic nuclear

transfer), еще один способ, используемый в практике трансгеноза. Было пока-

зано, что ядра эмбриональных клеток различных животных при переносе в

энуклеированную яйцеклетку иногда способны обеспечивать развитие цело-

го нового организма. После непродолжительного культивирования даже ядра

из некоторых дифференцированных клеток способны обеспечивать развитие

до жизнеспособной особи. Так, например, знаменитая овечка Долли была

клонирована в 1997 г. слиянием культивируемых (3–6 пассажей) клеток эпи-

телия молочной железы (вымени) взрослого шестилетнего животного с ли-

шенной ядра яйцеклеткой (рис. 2.20

). Хотя нельзя исключить, что для клони-

рования случайно была взята недифференцированная клетка, присутствую-

щая в донорском эпителии.

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 109

Рис. 2.20. Клонирование овцы методом переноса ядра. Эпителиальные клетки мо-

лочной железы в культуре индуцируют для перехода в фазу G

(стадия, на которой

находится яйцеклетка). Затем осуществляют слияние такой клетки с энуклеированной

яйцеклеткой и выращивают эмбрионы до ранних стадий эмбриогенеза. После чего

эмбрионы имплантируют в матку суррогатной матери, где происходит дальнейшее

развитие. В эксперименте Я. Уилмута (I. Wilmut) по клонированию Долли было прове-

дено 277 слияний безъядерных яйцеклеток с клетками молочной железы в фазе G

из 29 выживших эмбрионов только один развился до жизнеспособного организма

Клонирование Долли из ядра дифференцированной клетки и трех дру-

гих овец из ядер эмбриональных клеток удалось осуществить благодаря пе-

реносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G

), и, возможно, осо-

бенностям эмбриогенеза этого животного. В зиготах овец в течение первых

трех делений, занимающих несколько суток, происходит только репликация

ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время

введенная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных

белков, а соответствующие гены эмбрионального развития связываются с

инициаторными эмбриональными белковыми факторами из цитоплазмы яй-

цеклетки.

Хотя технологиям клонирования еще очень далеко до совершенствова-

ния – клонированная Долли выявляла многие признаки преждевременного

старения, это очень многообещающая технология получения трансгенных

животных. Даже если имеются различные проблемы с первым поколением,

скорее всего, второе поколение не будет иметь недостатков, приобретенных

вследствие использования «старого» ядра для яйцеклетки.

Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание

любых трансгенных животных с помощью метода переноса ядер стало ре-

альным, – это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культу-

ре. В настоящее время ведутся активные поиски факторов репрограммирова-

ния дифференцированных клеток для индукции плюрипотентности. Если это

удастся, то генетическое изменение таких клеток и создание трансгенных ор-

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 110

ганизмов путем соматического ядерного переноса станет почти рутинной

процедурой, а пока это единичные удачные эксперименты.

Искусственные хромосомы как трансгенный вектор. Большинство

трансгенов представляют собой кДНК, небольшие гены (<20 тнп) или фраг-

менты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопи-

тающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифич-

ные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-

мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные ге-

ны и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в

обычные векторы. Учитывая все это, для трансгеноза стали использовать ис-

кусственные дрожжевые хромосомы (YAC), вмещающие фрагменты геном-

ной ДНК длиной от 100 до > 1 000 тнп и искусственные хромосомы человека

еще большей емкости (об искусственных хромосомах см. п. 2.1.4

). Данные

эписомальные векторы имеют еще одно преимущество – позволяют избежать

эффект положения гена при экспрессии экзогенной ДНК. Уровень экспрес-

сии встроенного гена очень зависит от его хромосомной позиции, например,

встраивание в неактивный хроматин (гетерохроматин) интактной хромосомы

приводит к инактивации гена.

С помощью искусственных дрожжевых хромосом (YAC), несущих не-

сколько родственных генов или один большой ген, были получены трансген-

ные мыши путем микроинъекции в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки

или трансфекцией ES-клеток. Трансгенные мыши, несущие кластер из пяти

функциональных генов β -глобина человека суммарной длиной примерно

250 тнп, экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время –

точно так же, как это происходит у человека. Такое соответствие обеспечи-

валось фланкирующими их последовательностями, которые содержат промо-

тор и другие важные регуляторные элементы. С помощью YAC-трансгеноза

были получены мыши, которые синтезировали только человеческие антите-

ла, являющиеся сложной тетрамерной конструкцией из двух пар разных по-

липептидных цепей.

Искусственные хромосомы человека (human artificial chromosome –

HAC), содержащие целиком иммуноглобулиновый локус человека с тяжелы-

ми и легкими цепями, были внедрены в бычьи фибробласты, которые затем

использовали для соматического ядерного переноса. Полученные трансхро-

мосомальные телята экспрессировали иммуноглобулины человека в своей

крови [5

]. Эта система стала важным шагом в направлении животной про-

дукции терапевтических поликлональных антител человека. Дальнейшие на-

блюдения за трансгенными животными показали, что рекомбинантные HACs

поддерживались в большинстве особей первого поколения в течение не-

скольких лет. Будут ли полученные искусственные хромосомы соответст-

вующим образом разделяться в процессе мейоза и наследоваться, еще только

предстоит выяснить.

Совсем недавно возникла новая перспективная технология для полу-

чения животных с выключенными генами – малые интерферирующие РНК

(миРНК, siRNA), которые используют для прицельного выключения генов