Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.1. Геном человека

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 121

ный методом произвольного секвенирования полного генома (более известный

как произвольное секвенирование методом дробления), который позволял со-

брать полный геном из частично секвенированных фрагментов ДНК при по-

мощи компьютерной модели.

Этим методом впервые был полностью секвенирован геном самореп-

лицирующегося свободно живущего организма – бактерии Haemophilus in-

fluenzae Rd. Копии ДНК бактерии были разрезаны на куски произвольной

длины от 200 до 1 600 п.о. Эти фрагменты секвенировали по несколько сот с

каждого конца. Кроме того, были секвенированы и более длинные фрагмен-

ты по 15–20 тыс. п.о. Полученные последовательности были внесены в ком-

пьютер, который их сравнивал, распределял по группам и по сходству. Пер-

выми идентифицировались неповторяющиеся последовательности, затем –

повторяющиеся последовательности фрагментов. Длинные фрагменты помо-

гали установить порядок часто повторяющихся, почти идентичных последо-

вательностей. Затем заполнялись пробелы между полученными основными

кусками ДНК. Секвенирование генома Haemophilus influenzae заняло один год и

при этом была определена последовательность 1 830 137 п.о. и 1 749 генов,

расположенных на 24 304 фрагментах. Это был несомненный успех, который

доказал, что новая технология может быть применима для быстрого и точно-

го секвенирования целых геномов. В 1996 г. картировали геном первой эука-

риотической клетки – дрожжевой, а в 1998 впервые секвенировали геном

многоклеточного организма – круглого земляного червя Caenorhabolits

elegans.

В феврале 2001 г. рабочий вариант генома человека (выполненный на

90 %) был одновременно опубликован в журналах «Nature» – результаты

HUGO и «Science» – результаты исследований компании Celera. Анализ по-

лученного варианта генома человека выявил около 25 тыс. генов. Ранее

предполагалось, что это количество должно достигать 140 тыс. (если исхо-

дить из постулата «один ген кодирует один белок»). В настоящее время

представляется возможным, что один ген может кодировать 5-6 белков. Мно-

гообразие белков, кодируемых одним и тем же геном, обеспечивается не-

сколькими механизмами: с помощью альтернативного сплайсинга, по-

сттрансляционных превращений белков – фосфорилирования, ацетилирова-

ния, метилирования, гликозилирования и многих других.

В 2003 г. был опубликован окончательный вариант полной последова-

тельности генома человека. Вся эта информация является доступной и нахо-

дится в Интернете на нескольких сайтах (см.: http://jbirc.jbic.or.jp/g-compass).

Однако до сих пор некоторые элементы генома не поддаются секвенирова-

нию современными технологиями, а наши знания о геноме остаются непол-

ными. Оказалось, что лишь 30 % генома кодируют белки и участвуют в регу-

ляции действия генов. Каковы функции остальных участков генома и есть ли

они вообще, остается совершенно неясным. Около 10 % генома составляют

так называемые Alu-элементы длиной около 300 п.о. Они появились неиз-

вестно откуда в ходе эволюции только у приматов. Попав к человеку, они

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.1. Геном человека

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 122

размножились до полумиллиона копий и распределились по хромосомам са-

мым причудливым образом. Что касается кодирующих участков ДНК, то при

чисто молекулярно-компьютерном анализе они были названы генами по су-

губо формальным критериям: наличию знаков пунктуации, необходимых для

прочтения информации и синтеза конкретного генного продукта. При этом

время и действие большинства потенциальных генов пока неясны, и для оп-

ределения их функций может потребоваться не меньше ста лет.

Сиквенс генома – это всего лишь последовательность из одних и тех же

четырех букв в бесконечной вариации. Взглянув на нее, никто не сможет

мгновенно вычислить ее функцию. Однако, вставив последовательность ос-

нований на правильное место в геноме, можно получить ключ к разгадке ее

функции. Карта генома – это графическая схема, позволяющая исследовате-

лям ориентироваться в геноме, искать в нем места, которые могут быть важ-

ны и интересны. В простейшем виде карта генома представляет собой линию,

по всей длине которой расположены различные ориентиры, помеченные бук-

вами и цифрами, дающие возможность исследователю идентифицировать от-

дельные признаки. Карта не одно и то же, что и последовательность основа-

ний генома. Расположение генов на карте можно вычислить без определения

последовательности оснований. Приблизительная локализация генов, нару-

шения в которых связаны с рядом наследственных заболеваний, была уста-

новлена задолго до секвенирования генома человека при исследовании на-

следования различных сцепленных признаков. Методы, которые использу-

ются при этом, подробно излагаются в курсе «Генетика». Здесь же мы затро-

нем лишь общие закономерности части из них.

Как проводится построение генетические карты? Предположим, что

необходимо выяснить расположение определенного гена, вызывающего за-

болевание, которое выражается определенными фенотипическими признака-

ми. Сначала обследуют несколько семей, представленных несколькими по-

колениями, члены которых страдают этим заболеванием, чтобы узнать, с ка-

кими другими генетическими признаками связана эта болезнь. Гены любых

признаков, имеющих тенденцию наследоваться вместе с предрасположенно-

стью к болезни, с большой долей вероятности могут быть локализованы на

одной хромосоме рядом с генами, вызывающими болезнь. Их выбирают в ка-

честве маркеров для искомого гена. Определив несколько маркеров с извест-

ным расположением на хромосоме, можно с большой точностью (до не-

скольких миллионов п.о.) установить расположение гена, вызывающего бо-

лезнь. Затем исследования фокусируются на части генома, несущей указан-

ный ген, и поисках гена, который имеет различную последовательность ос-

нований у здоровых и больных людей, или гена, функции которого могут

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.1. Геном человека

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 123

быть связаны с болезнью. Именно так были идентифицированы гены, свя-

занные с фиброзом мочевого пузыря и болезнью Гантингтона. Однако путь

этот долог и трудоемок, поэтому целью генетиков остается разработка более

детальных карт геномов, которые позволят с точностью находить последова-

тельности, нужные в каждом конкретном случае.

Существует два типа генетических карт – карты генетического сцепле-

ния и физические карты.

Карты генетического сцепления показывают порядок расположения

генов на хромосоме и относительные расстояния между ними. Впервые та-

кую карту составили в начале ХХ в. в лаборатории Колумбийского универ-

ситета, возглавляемой Томасом Г. Морганом (лауреат Нобелевской премии

по физиологии и медицине, 1933 г.). Объектом этих классических генетиче-

ских исследований были избраны плодовые мушки Drosophila melanogaster,

мелкие размеры и неприхотливость которых позволяли проводить экспери-

менты с сотнями мух. Кроме того, они быстро размножались и оказались

чрезвычайно плодовитыми – новое поколение появлялось через каждые

12 сут, и самка откладывала до 1 000 яичек. Плодовые мушки имеют 4 пары

хромосом, включая пару половых. Морган заметил, что если самца с белыми

глазами скрестить с красноглазой самкой, то у потомства глаза будут крас-

ными; но при скрещивании потомства друг с другом «белоглазость» прояв-

ляется вновь, но только у самцов.

Морган сделал вывод, что этот признак и

другие «ограниченные полом» признаки, например, дальтонизм у людей, ко-

торый поражает только мужчин, должны располагаться на Х-хромосоме. Это

была первая мутация, связанная с определенной хромосомой. В течение не-

скольких последующих лет были идентифицированы более 40 мутаций у

плодовых мушек, часть из которых оказались сцепленными друг с другом.

Сейчас различают четыре основных вида наследования: аутосомно-

доминантный, аутосомно-рецессивный (относится к 22-м парам неполо-

вых хромосом), а также Х-сцепленный доминантный и Х-сцепленный ре-

цессивный.

Схема эксперимента Моргана с белоглазыми мушками приведена на

рис. 3.1

. Этот эксперимент демонстрирует случай Х-сцепленного рецессив-

ного наследования. Итак, гены сцепленных признаков расположены на одной

хромосоме. Для определения сцепления генов группа Моргана скрещивала му-

тантов с нормальными мушками и полученное потомство снова и снова, пока

не получали достаточное количество мушек с сохранением мутации на опреде-

ленной хромосоме. Поскольку их расположение было известно, такие мутации

служили маркерами. Затем самцов с новой мутацией скрещивали с самками,

несущими эти маркерные мутации. Как уже было отмечено, белые глаза бы-

ли результатом мутации на Х-хромосоме. Если новая мутация постоянно

проявлялась у белоглазых мух, это означало, что и она расположена на

Х-хромосоме.

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.1. Геном человека

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 124

Рис. 3.1. Результаты скрещивания белоглазых мушек с красногла-

зым самцом. Черными треугольниками помечены Х-хромосомы,

несущие доминирующий признак красных глаз. Белыми перевер-

нутыми треугольниками обозначены Х-хромосомы, несущие рецес-

сивный признак белых глаз. Серые треугольники – Y-хромосомы

Однако встречались признаки, которые передавались вместе, но не все-

гда, например, признаки белого глаза и рудиментарного крыла. Этот эффект

объясняется происходящим во время мейоза кроссинговером (обменом меж-

ду генными участками хромосом). Если интересующие нас гены находятся

на одной и той же хромосоме, но располагаются далеко друг от друга, в ре-

зультате кроссинговера при образовании половых клеток они с большой ве-

роятностью попадут в разные клетки. Близко расположенные гены не будут

разделяться при кроссинговере. Таким образом, можно установить не только

нахождение гена на определенной хромосоме, но и приблизительно опреде-

лить взаимное расположение генов на ней, если учесть, как часто они прояв-

ляются в потомстве в результате скрещиваний. Пользуясь полученными ре-

зультатами, сотрудники лаборатории Моргана построили первую карту

Х-хромосомы плодовой мушки (рис. 3.2

). Позднее были построены первые

генетические карты и других 3 хромосом. По сути, они являются прототипом

современных генетических карт.

Карты Моргана были построены на генетических признаках, физически

видимых у исследуемых мушек. Сегодня гораздо более сложные карты сце-

пления генов строятся на определении наследования специфических после-

довательностей ДНК. В частности, для этого используется метод, основан-

ный на полиморфизме длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.1. Геном человека

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 125

Рис. 3.2. Примерный вид первой генетической карты, показывающей

расположение пяти признаков на хромосоме плодовой мушки

Для возникновения аллелей достаточно, чтобы два гомологичных гена

отличались всего одним нуклеотидом. Если вероятность появления такой за-

мены (мутации) больше 1 %, то говорят, что имеет место генетический поли-

морфизм. Замена всего одного нуклеотида может вызвать значительное из-

менение свойств кодируемого белка, по сравнению с нормальным. Однако

множество однонуклеотидных замен не приводит к синтезу измененных ген-

ных продуктов. Более того, замены, происходящие в некодирующих областях

(а в человеческом геноме они составляют около 90 %), не приводящие ни к

каким изменениям, распределены по всей длине хромосомы и представляют

собой полиморфные сайты, которые используются в качестве маркеров для

генетического маркирования. Но сначала эти полиморфные сайты нужно об-

наружить. Метод состоит в следующем. ДНК расщепляют с помощью опре-

деленной рестриктазы по специфическим местам. Если в сайте рестрикции

находится однонуклеотидная замена, рестриктаза его не узнает и расщепле-

ния не происходит. В то же время она по-прежнему узнает и расщепляет ин-

тактный сайт в другой хромосоме. Таким образом, в результате обработки

рестриктазой двух этих аллелей получается набор разных продуктов (фраг-

ментов ДНК разной длины), которые затем опознаются с помощью гибриди-

зации со специфичным зондом (см. пример на рис. 3.8

Явление встречающегося в популяции измененного сайта рестрикции,

приводящее к образованию специфического набора фрагментов ДНК, назы-

вается полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов. Полиморфные

сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они

присутствуют. В настоящее время идентифицированы тысячи ПДРФ-локусов,

благодаря чему значительно увеличилось число аллелей, которые можно ис-

пользовать для генетических исследований. Определение аллелей ПДРФ-

локуса, присутствующих на хромосомах данного индивидуума, называется

генотипированием (ДНК-типированием). Наследование ПДРФ-локусов проис-

ходит в соответствии с законами Менделя и можно проследить их передачу в

пределах родословной. Используя сцепление гена того или иного заболева-

ния с маркерным локусом, можно определить хромосомную локализацию

этого гена. С их помощью были изолированы гены таких наследственных за-

болеваний, как миодистрофия Дюшена и муковисцидоз.

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.1. Геном человека

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 126

Рис. 3.3. Карта генома хромосомы Micobacterium tuberculosis. На внешней окруж-

ности показано расположение генов, кодирующих соответствующие белки, общие

для штаммов CDC1551 (клинический) и H37Rv (лабораторный). Каждая из внут-

ренних окружностей отражает различия между этими штаммами. Например, вторая

окружность показывает локализацию синонимных замен, пятая – обнаруженные в

штамме CDC1551 вставки и т.д. [1] (с разрешения American Society for Microbiology)

Другим типом полиморфных локусов являются так называемые корот-

кие тандемные повторы (STR, от англ. short tandem repeats). Дело в том, что

по геному человека равномерно распределены примерно 100 000 блоков ди-

нуклеотидных повторов, содержащих до 40 CA/GT-элементов. Любой такой

блок, локализованный в определенном участке хромосомы, передается из по-

коления в поколение с сохранением числа повторяющихся элементов. В ге-

номе встречаются также повторы (AT)

, (ATG)

(ATCG)

. Чтобы идентифи-

цировать полиморфные STR-локусы, проводят скрининг геномной библио-

теки человека, содержащий вставки небольшого размера (около 1 000 п.о.),

используя подходящий олигонуклеотидый зонд. Для (CA)

-повторов обычно

используют зонд (CA)

. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы

установить длину повтора и нуклеотидные последовательности фланкирую-

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.1. Геном человека

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 127

щих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последо-

вательности однокопийными, проводят гибридизацию с комплементарными

им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются

в геноме один раз, то синтезируют пару комплементарных им праймеров и

осуществляют амлификацию СА-повторов. Далее, используя эту пару прай-

меров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученных от большого числа ин-

дивидуумов. Длина ПЦР-продуктов (применяют примерно 200 п.о.) опреде-

ляется с помощью полиакриламидного гель-электрофореза. Если длина ам-

плифицированного таким образом сегмента одинакова для всех исследуемых

образцов ДНК, значит повтор не полиморфен и наоборот, если образуются

ПЦР-продукты разной длины, это указывает на полиморфизм по данному

STR (STR-полиморфизм, STRP).

Различающиеся по длине повторы данного локуса представляют собой

аллели, которые встречаются с частотой 20 % и более. Использование STRP-

локусов для картирования геномов, по сравнению с ПДРФ-локусами, имеет

ряд преимуществ:

1) для их идентификации нужна информация о нуклеотидной последо-

вательности только пары праймеров, которая может храниться в компьютер-

ной базе данных;

2) эти локусы равномерно распределены в геноме;

3) их частоты очень высоки, что обеспечивает высокую гетерозиготность;

4) они без труда идентифицируются после ПЦР-амплификации.

Физическая карта целой хромосомы или ее области дает непосредст-

венное представление о расположении генов в ДНК, что облегчает их иден-

тификацию и характеристику. Существующие в настоящее время, после за-

вершения секвенирования генома человека, геномные карты совмещают чер-

ты обоих типов карт. Созданы электронные сайты, где специалисты могут

получить информацию о содержании различных хромосомных карт, включая

их полное графическое изображение, о методах исследования генома и про-

граммном обеспечении. На рис. 3.3

. показана карта хромосомы Micobacte-

rium tuberculosis. Сравнение последовательностей клинического штамма

CDC1551 и лабораторного H37Rv позволило выявить мутации (замены и

вставки), ответственные за патогенность клинического образца, что в свою

очередь позволяет улучшить метод диагностирования, понять механизм воз-

никновения заболевания и предложить соответствующую эффективную те-

рапию [1

С результатами секвенирования генома человека связаны надежды на

возможность лечения генетических заболеваний. К настоящему времени в

мире идентифицировано множество генов, ответственных за болезни челове-

ка, в том числе болезнь Альцгеймера, болезнь Гоше, атаксию, муковисцидоз,

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.1. Геном человека

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 128

мышечную дистрофию Дюшенна, дистонию, гемофилию А и В, фенилкето-

нурию, серповидно-клеточную анемию, талассемию, синдром хрупкости

Х-хромосомы, наследуемый рак молочных желез и яичников и др. Структуры

этих генов расшифрованы, и сами они клонированы. Это позволяет прово-

дить эффективную раннюю и даже пренатальную диагностику и лечение.

Тестирование будущих родителей на высокий риск генетического за-

болевания теперь может осуществляться для постоянно растущего числа ге-

нов. При этом типичным подходом является использование исследований

при помощи гибридизации или ПЦР-анализа. Можно протестировать здоро-

вого человека из семьи, где встречался, например, кистозный фиброз, и опре-

делить, есть ли у него копия дефектного гена или нет. Если неблагополучно-

го сочетания генов избежать не удалось и оба потенциальных родителя яв-

ляются носителями рецессивного дефекта, они должны сами решать, риско-

вать ли им, чтобы иметь детей. В любом случае раннее начало профилакти-

ческого лечения ребенка позволит предотвратить начало заболевания или

отодвинуть начало его проявления.

В настоящее время в практику медико-генетического консультирова-

ния введены десятки систем для генодиагностики наиболее распространен-

ных наследственных заболеваний. Установленная последовательность генома

поможет идентифицировать новые гены и выявить среди них те, что обу-

словливают предрасположенность к тем или иным заболеваниям.

Как было отмечено ранее, в ходе выполнения проекта «Геном человека»

были установлены последовательности целого ряда организмов – бактерий,

среди которых немало патогенных, дрожжей, круглого червя Caenorhabolits

elegans (нематоды), дрозофилы, мухи, москита, мыши, крысы, собаки, шим-

панзе, рыбы-собаки и растений – арабидопсиса, тополя и двух видов риса.

Полученная информация (большую часть которой еще предстоит осмыслить)

открыла новые возможности для развития сравнительной геномики. Оказа-

лось, к примеру, что из 269 генов человека, мутации которых приводят к бо-

лезням, 177 генов имели родственные гены в геноме дрозофилы. Сравнение

мышиного генома с человеческим показало, что около 200 геномных блоков

у человека и мыши содержат одинаковые гены (хотя и в разных хромосомах).

Количество генов у нематоды только в 4-5 раз меньше, чем у человека, и

часть из них также являются общими. Это позволяет изучать функции новых

генов человека и последствия мутаций известных генов, прослеживая изме-

нение свойств организма в опытах с экспериментальными животными и экс-

траполируя полученные результаты на человека.

В процессе прочтения генома был выявлен еще один механизм генети-

ческого разнообразия, так называемый однонуклеотидный полиморфизм

(фактор СНП, по английской транскрипции). СНП – это изменение «буквы»

генетического кода без «последствий для здоровья». Считается, что у челове-

ка СНП встречается с частотой 0,1 %, т.е. каждый человек отличается от дру-

гих одним нуклеотидом на каждую тысячу нуклеотидов. У шимпанзе, пред-

ставляющей собой более древний вид и к тому же гораздо более гетероген-

ный, число СНП при сравнении двух разных особей достигает 0,4 %. Но если

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.1. Геном человека

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 129

различия в СНП не сказываются на здоровье особей, то чем они интересны и

важны? Оказалось, что практическое значение СНП велико. Известно, что

самые распространенные лекарства эффективны не более чем для четверти

нуждающегося населения. Минимальные генетические отличия, обусловлен-

ные СНП, определяют эффективность лекарств и их переносимость в каждом

конкретном случае.

Например, в одном из генов, кодирующих синтез рецептора адренали-

на, выявлено 13 СНП, которые могут комбинироватьcя друг с другом, давая

8 192 различных варианта (гаплотипа). Среди астматиков довольно популяр-

но лекарство албутерол, которое взаимодействует с указанным рецептором

адреналина и подавляет приступ удушья. Однако из-за разнообразия гапло-

типов людей лекарство действует не на всех, а некоторым больным оно во-

обще противопоказано. Это обусловлено СНП: люди с последовательностью

букв в одном из генов ТЦТЦЦ (Т – тимин, Ц – цитозин) не реагируют на ал-

бутерол, если же концевой цитозин заменен на гуанин (ТЦТЦГ), то реакция

есть, но частичная. Для людей же с тимином вместо концевого цитозина в

этом участке – ТЦТЦТ – лекарство токсично!

Необходимо отметить, что развитие и достижения геномики человека,

в свою очередь, обеспечили новые возможности для развития целого ряда

других научных направлений (рис. 3.4

Рис. 3.4. Связь геномики человека

с другими научными направлениями

Определение нуклеотидной последовательности человека является со-

бытием исторического масштаба, но между тем необходимо знать не только

порядок следования звеньев в цепи ДНК и не только взаимное расположение

генов и их функции. Важно выяснить характер связей между ними, который

определяет, как гены будут работать в конкретных условиях – внешних и

внутренних: ведь многие болезни человека обусловлены не дефектами в самих

генах, а нарушениями их согласованных действий, системы их регуляции.

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 130

Успехи современной медицины в огромной мере зависят от того, уда-

стся ли вовремя обнаружить специфические инфекционные агенты (вирусы,

бактерии, паразитические микроорганизмы) или изменения в содержании

важных биологически активных белков или низкомолекулярных соединений

в организме. Надо ли говорить, что профилактику и лечение любого заболе-

вания существенно облегчает ранняя и точная диагностика. Современные ме-

тоды молекулярной диагностики обладают высокой специфичностью и чув-

ствительностью и при этом являются достаточно продуктивными, эффектив-

ными и недорогими для рутинного применения.

По оценкам специалистов, объем мирового рынка иммунодиагностиче-

ских тестов в 1993 г. составил 3,4 млрд дол., в 2000 г. – около 5 млрд дол.

В 1994 г. объем мирового рынка ДНК-диагностических тестов был примерно

80 млн дол., к 2000 г. – 600 млн дол., к 2004 г. – 2 млрд дол.

Любой диагностический тест должен быть высокоспецифичным в от-

ношении молекулы-мишени, чувствительным для определения малых коли-

честв мишени и достаточно простым и надежным, позволяющим получать

однозначные результаты в условиях обычной медицинской лаборатории.

Различают два основных метода молекулярной диагностики – иммуноди-

агностика, основанная на сродстве антитела к антигену, и ДНК-диагностика,

основанная на гибридизации нуклеиновых кислот (спаривании комплемен-

тарных фрагментов ДНК)

и ПЦР.

–

В основе любого иммунодиагностического исследования лежит высоко

специфичное и эффективное взаимодействие антиген – антитело (рис. 3.5

Таким образом, связывание антитела с антигеном-мишенью (появление в об-

разце комплексов АТ~АГ) свидетельствует о наличии анализируемого антигена

(инфекционного агента или целевого биологически активного соединения).

Задача состоит в том, чтобы о своем наличии такие комплексы «сооб-

щали» каким-либо визуальным сигналом, т.е. необходимо каким-то образом

«пометить» антитело. Долгое время в качестве меток в иммуноанализе ис-

пользовали радиоактивные изотопы. Они обеспечивали высокую чувстви-

тельность анализа, однако обладали рядом недостатков: нестабильностью

(использовали высокоактивные короткоживущие изотопы), невозможностью

автоматизации анализа, опасностью для персонала лабораторий и производ-

ства. Альтернативой радиоиммуноанализу стал так называемый иммунофер-