Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 81

В последнее время все больше растет потребность общества в разнооб-

разных белковых препаратах. Особенно быстрыми темпами увеличивается

применение фармацевтических белковых препаратов в диагностике и тера-

пии заболеваний человека и животных. Это не только антитела и их произ-

водные, но многие белки из крови человека (цитокины, ростовые гормоны,

интерлейкины, интерфероны и др.). На современном рынке присутствует

около ста препаратов на основе белков человека, и это количество растет год

от года. Все эти белки произведены in vitro при использовании генетически

модифицированных клеточных культур, полученных генно-инженерными

методами, в основном это бактериальная культура E. coli, дрожжевые

Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris или культуры клеток млекопитающих.

Пока наиболее экономически эффективной и хорошо охарактеризован-

ной системой остается бактериальная. Однако благодаря прокариотическому

типу данной системы эукариотические белки в ней плохо процессируются и

продукция в ней ограничивается простыми структурами (пептиды, неболь-

шие белки), где посттрансляционные модификации отсутствуют или не нуж-

ны для биологической функции. Кроме того, высокий уровень синтеза часто

приводит к аггрегациии рекомбинантных белков в виде плохо растворимых

телец включения (inclusion bodies), что делает необходимым этап ренатура-

ции рекомбинантного белка для перевода в биологически активную форму.

Также необходимым этапом является удаление бактериальных токсинов,

присутствующих в данной системе. При этом общая продуктивность бакте-

риальной системы остается довольно низкой – 0,1–1,5 мг/л [1

Дрожжи как эукариотический организм не имеют этих недостатков, но

практический опыт показывает, что большое количество синтезируемого

продукта теряется вследствие деградации целевого белка в среде. Кроме то-

го, в дрожжах, особенно в Saccharomyces cerevisiae, гликопротеины подвер-

гаются гипергликозилированию, в результате которого формируются N-гликаны

с очень высоким содержанием маннозы, которые кардинально отличаются от

N-гликанов млекопитающих или человека. Ситуация может быть улучшена

использованием метилотрофных дрожжей P. pastoris в качестве экспресси-

онной системы. Белковая продукция в дрожжах может достигать 6,4 г/л, но

обычно находится в диапазоне 100–200 мг/л. Несмотря на эти ограничения,

43 % рекомбинантных белков, существующих на рынке, продуцируются в

бактериях или дрожжах.

Большинство фармацевтических биотехнологических продуктов, одна-

ко, продуцируются в различных культурах клеток млекопитающих, напри-

мер, NSO, BNK, CHO. Как типы, наиболее близкие человеческим клеткам,

эти системы дают высокий уровень продукции функциональных рекомби-

нантных белков с корректным N-гликозилированием и другими посттрансля-

ционными модификациями. Уровень продукции культур клеток млекопи-

тающих приблизительно составляет 1–3 г/л. Этот «золотой стандарт» требует

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 82

дорогой инфраструктуры и компонентов сред. Кроме того, существует риск

вирусной или онкогенной контаминации. Все это приводит к сверхвысокой

стоимости конечного продукта, приблизительно варьирующей от 0,3 до

10 тыс. дол. США за грамм в зависимости от количества синтезируемого

белка, и к необходимости искать более дешевые альтернативы продукции

целевого белка, которым могут стать целые трансгенные растения или жи-

вотные.

Растительные клеточные культуры. Растения всегда были основ-

ным источником биопродуктов для человека, снабжая население пищей, во-

локнами, древесиной и лекарствами. В области фармацевтики растения ис-

пользуют для получения огромного количества вторичных метаболитов с

разнообразными терапевтическими эффектами: ранозаживляющие, антимик-

робные, противовоспалительные, психоактивные и др. Растения выработали

эти субстанции в процессе эволюции, чтобы защитить себя от патогенов и

хищников или привлекать опылителей. Современные биотехнологические

методы позволяют продуцировать эти продукты предсказуемым образом в

клеточных культурах из соответствующих лекарственных растений. Иногда

это единственный путь производить препараты в промышленных масштабах,

например, когда исходное растение сложно для культивирования или очень

редко встречается в природе. В качестве успешных примеров можно привес-

ти алкалоиды, паклитаксел (противоопухолевый препарат) и шиконин (анти-

микробный и противовоспалительный).

Растительные клетки как эукариотическая система обладают всеми

чертами для продукции биологически активных сложных белков. Как резуль-

тат, доля биологически активной формы в синтезированном растительными

клетками рекомбинантном тотальном белке бывает очень высока. Так, на-

пример, в сравнительном исследовании экспрессии анти-CEA scFv, клетки

табака синтезировали, несомненно, наибольшее количество функционально

активного белка (92 %) от тотального рекомбинантного по сравнению с

E. coli (12 %) и P. pastoris (40 %).

Животные клеточные культуры существуют с 50-х гг. прошлого ве-

ка, когда были выделены в клеточную культуру HeLa клетки и CHO клеточ-

ная линия. Больше пятидесяти лет развития позволило производству на осно-

ве животных клеточных культур достигнуть выдающихся успехов. По дан-

ным за 2007 г. приблизительно шестая часть наиболее популярных лекарств

являются биотехнологическими продуктами. Девять из десяти наиболее по-

пулярных биотехнологических лекарственных препаратов, продающихся в

США, произведены в клеточной культуре клеток млекопитающих и, по край-

ней мере, продажи 23 белковых препаратов превышают один биллион долла-

ров.

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 83

Дрожжи являются очень привлекательный системой экспрессии, по-

зволяющей сочетать дешевизну прокариотического культивирования с эука-

риотическим процессингом белков. Дрожжевая система экспрессии имеет

следующие преимущества. Во-первых, дрожжи являются одноклеточным ор-

ганизмом, генетика и физиология которого детально изучены и который

можно выращивать как в небольших лабораторных колбах, так и в промыш-

ленных культиваторах. Во-вторых, выделены и охарактеризованы несколько

сильных промоторов этих дрожжей, а для систем эндогенных дрожжевых

экспрессирующих векторов могут использоваться природные так называе-

мые 2 µм-плазмиды. В-третьих, в клетках дрожжей осуществляется большое

число посттрансляционных модификаций. В-четвертых, лишь очень немно-

гие из собственных дрожжевых белков секретируются в среду; таким обра-

зом, если гетерологичный белок секретируется

клеткой, то его очистка не со-

ставит большого труда. В-пятых, поскольку дрожжи уже многие годы ис-

пользуют в хлебопечении и пивоварении, Департамент по контролю качества

пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) вклю-

чил обычные пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae в список «организ-

мов, признанных безопасными». Таким образом, использование этих орга-

низмов для получения белков, применяемых в медицине, не требует допол-

нительных экспериментов, необходимых при работе с неразрешенными к

применению микроорганизмами. Некоторые белки, синтезированные в

S. cerevisiae, уже используются в качестве вакцин и фармацевтических пре-

паратов, а также для диагностики.

В дрожжевых клетках гликозилируются только секретируемые белки,

поэтому для получения рекомбинантных белков, которые для перехода в ак-

тивную форму должны подвергнуться N- или О-гликозилированию, необхо-

димо использовать системы секреции. Для этого перед кДНК, которая коди-

рует интересующий исследователя белок, нужно поместить так называемый

пре-про-α-фактор – лидерную (сигнальную) последовательность гена а

фак-

тора спаривания дрожжей. Синтезируемый рекомбинантный белок сможет в

этом случае эффективно секретироваться дрожжами.

К сожалению, белки млекопитающих подвергаются избыточному гли-

козилированию в клетках S. cerevisiae, что сильно меняет их иммуноген-

ность. Использование других видов дрожжей, особенно метилотрофных

Pichia pastoris иногда помогает решить данную проблему.

Бакуловирусы инфицируют только беспозвоночных, в том числе мно-

гих насекомых. В ходе инфекционного процесса образуются две их формы.

Одна представлена отдельными вирионами, которые высвобождаются из ин-

фицированной клетки хозяина, как правило, клетки средней кишки, и спо-

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 84

собны инфицировать другие клетки этого органа. Вторая состоит из множе-

ства вирионов, заключенных в белковый матрикс. Белок этого матрикса на-

зывается полиэдрином, а сама структура – полиэдроном. Синтез полиэдрина

начинается через 36–48 ч после инфекции и продолжается 4-5 сут, пока зара-

женные клетки не лизируют и хозяйский организм не погибнет. После этого

множество таких частиц высвобождается и попадает в среду, где от инакти-

вации их защищает белковый

матрикс. Если восприимчивый хозяйский орга-

низм проглатывает такую частицу, то полиэдрин солюбилизируется и высво-

бождаются вирионы, способные инициировать новый инфекционный цикл.

Промотор гена полиэдрина чрезвычайно сильный, а цикл развития ви-

руса не зависит от наличия самого гена. Следовательно, замена последнего

генома чужеродного белка с последующей инокуляцией полученным реком-

бинантным бакуловирусом культуры клеток насекомого может привести к

синтезу большого количества гетерологичного белка, который благодаря

сходству систем внесения посттрансляционных модификаций у насекомых и

млекопитающих будет близок (а возможно, и идентичен) к нативной форме

целевого рекомбинантного белка. Исходя из этого, на основе бакуловирусов

были разработаны векторы для экспрессии генов, кодирующих белки млеко-

питающих и вирусов животных.

Наиболее широко используется вирус множественного ядерного поли-

эдроза Autographa californica (AcMNPV). Этот бакуловирус инфицирует бо-

лее 30 других видов насекомых, а также хорошо растет в культуре многих

клеточных линий. Линии клеток, обычно использующиеся для работы с ре-

комбинантным AcMNPV, получают из гусениц Spodoptera frugiperda. Про-

мотор полиэдрина в этих клетках чрезвычайно активен, и при их заражении

бакуловирусом дикого типа синтезируются большие количества белка.

Так, полученный в бакуловирусной системе экспрессии поверхностный

белок ВИЧ был первым белком, использовавшимся для создания вакцины

против СПИДа. Но пока данная система не получила широкого распростра-

нения, вероятно, вследствие трудоемкости процедуры и высокой стоимости

получаемого продукта.

Задачей селекционеров во все времена было получение хозяйственно

ценных растений, животных, микроорганизмов. Основными методами тради-

ционной селекции являются отбор, гибридизация, мутагенез, полиплоидия с

целью получения нужного признака, который кодируется новым геном или

новым комплексом генов. Существенное продвижение в понимании того, как

функционируют гены, расшифровка геномов и развитие методологии генной

инженерии позволили перейти от длительных и трудоемких методов тради-

ционной селекции к прямому генетическому конструированию нужных при-

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 85

знаков у конкретного организма. При создании трансгенного организма но-

вый генный комплекс конструируется в пробирке и напрямую вводится в ор-

ганизм, фактически таким методом получения нового признака ученые про-

сто ускоряют эволюцию.

Новые методы селекции – это сочетание молекулярных и традицион-

ных методов. Необходимо отметить, что старые методы также остаются ши-

роко востребованными при создании новых организмов. Выяснилось, что

трансформированные с идентичной конструкцией ДНК трансгенные клоны,

полученные параллельно в одном и том же опыте, значительно различаются

по уровню экспрессии введенного гена, поскольку работает эффект положе-

ния и копийности гена. И необходимо проводить дальнейший отбор с анали-

зом наследования полученного признака, используя традиционные методы

селекции. Генно-инженерные манипуляции с геномом, сформировавшимся в

процессе длительной эволюции, могут нарушать, в какой-то степени, сбалан-

сированные генные комплексы и, соответственно, жизнеспособность полу-

ченных трансгенных организмов. Например, встраивание селективного гена,

нужного только для отбора трансгенных растений, может нарушить первич-

ную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инакти-

вацию. Это событие, по-видимому, не так редко, особенно с учетом того, что

трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эу-

хроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может

перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обыч-

но нежелательной фенотипической мутации. Появляется необходимость

дальнейшего скрещивания и отбора для удаления нежелательных побочных

мутаций у трансгенов. Иногда имеется необходимость удаления маркерных

генов вообще, так что для получения новых организмов применяется сочета-

ние старых и новых методов селекции.

В настоящее время практическая генно-инженерная биотехнология

развивается по двум основным направлениям. Первое направление, полу-

чившее не очень удачное название «молекулярное разведение (или селек-

ция)» (molecular breeding), специализируется на решении новыми методами

традиционных селекционно-генетических проблем повышения продуктивно-

сти хозяйственно ценных организмов и их защиты от различных биотических

и абиотических стрессовых факторов. Второе направление, названное «моле-

кулярным производством» (molecular farming), специализируется на полу-

чении и использовании трансгенных организмов в качестве биореакторов,

продуцирующих ценные для промышленности и медицины органические со-

единения.

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 86

Возможность получения трансгенных растений основана на тотипотентно-

сти их некоторых клеток, т.е. способности в определенных условиях под дей-

ствием фитогормонов дифференцироваться с образованием полноценного

растения. Таким образом, из сконструированных генно-инженерными методами

отдельных клеток можно получить фертильные растения, все клетки которых

несут чужеродный генный комплекс (трансгенные растения). Если такое рас-

тение цветет и дает жизнеспособные семена, то желаемый признак передает-

ся последующим поколениям. Кроме того, многие растения легко размножа-

ются вегетативно. Существующими приемами микроклонального размноже-

ния in vitro из микроскопических кусочков ткани (эксплантов) можно быстро

получить

за короткий промежуток времени генетически однородный поса-

дочный материал с высоким коэффициентом размножения, что важно для по-

следующего применения трансгенного организма.

Для создания трансгенного растения необходимо трансформировать

культивируемые клетки, их протопласты или клетки в составе органов, отде-

лить от нетрансформированных клеток и получить из отдельных клеток це-

лые трансгенные растения (рис. 2.12

). К настоящему времени для трансфор-

мации растений разработано несколько эффективных систем переноса ре-

комбинантной ДНК в клетки и экспрессирующих векторов, которые работа-

ют в ряде растительных клеток.

Векторы на основе Ti-плазмид. Бактерии рода Agrobacterium иногда

называют природными генными инженерами за их способность переносить

свою плазмидную ДНК в клетки зараженных растений, интегрировать ее в

геном организма-хозяина и вызывать стабильную трансформацию этих кле-

ток введенными генами. Все они приводят к образованию у двудольных рас-

тений корончатых галлов – трансформация индуцирует образование опухо-

лей, похожих на раковые. Инфекционным агентом является так называемая

Ti-плазмида (tumor-inducing plasmid) в 200–250 тнп (рис. 2.13

), которая со-

держит все гены, необходимые для инфекционного процесса.

Рис. 2.12. Схема получения трансгенного растения трансформацией эксплантов

(кусочки органа растения, например фрагменты тканей семядоли)

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 87

Рис. 2.13. Схема Ti-плазмиды. Указаны основные гены и их группы. Сайт

инициации репликации (ori) обеспечивает удвоение плазмиды при делении

клетки Agrobacterium. Колечками обозначены левая и правая фланкирующие

последовательности Т-ДНК

После присоединения Agrobacterium, несущей Ti-плазмиду, к расти-

тельной клетке, часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (Т-ДНК

(transferred DNA), 12–24 тнп в зависимости от штамма), транспортируется в

клетку, по-видимому, с помощью механизма, аналогичного конъюгации. При

этом Т-ДНК транспортируется в одноцепочечной форме, и именно в такой

форме она встраивается в хромосомную ДНК растения. С переносимой Т-ДНК

остаются связанными два кодируемых Ti-плазмидой белка, способствующие

ее вырезанию, и третий белок покрывает оболочкой переносимую одноцепо-

чечную ДНК, предохраняя от деградации. Все белки содержат сигнал ядер-

ной локализации (NLS), который обеспечивает перенос Т-комплекса из ци-

топлазмы в ядро растительной клетки. Введенные гены Agrobacterium акти-

вируются в растении, программируя разрастание ткани (формируется галл),

которая начинает синтезировать и секретировать опины. Опины – продукты

конденсации амино- и кетокислот или аминокислот и сахаров Agrobacterium –

используют как источник углерода и азота, причем другие исследованные поч-

венные микроорганизмы не способны использовать данные соединения. Таким

образом, Agrobacterium генетически трансформирует растительные клетки в

«биологические фабрики» по производству для себя «продуктов питания».

Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не использу-

ется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых не-

возможно получить целое растение. Для этих целей применяют небольшие век-

торные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами из перено-

симой Т-области, которая ограничена 24-нуклеотидными повторами. Вместо

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 88

онкогенов встраивают последовательности клонируемой чужеродной ДНК и

селективный маркер. Наличие сайта инициации репликации E. coli в составе

Ti-вектора позволяет проводить в кишечной палочке все стадии сборки гене-

тической конструкции. В качестве селективного маркера используют гены

устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые дают возможность

отбирать трансформированные клетки растений. После введения целевой

ДНК рекомбинантным Ti-вектором трансформируют клетки агробактерий,

несущих модифицированную Ti-плазмиду-помощницу с удаленной Т-областью,

но содержащую все необходимое для переноса в растительные клетки T-ДНК

части с рекомбинантной плазмиды. Такие вектора получили название бинар-

ных, поскольку только вместе с плазмидой-помощницей они составляют па-

ру из двух элементов для полноценного функционирования системы перено-

са генов в растительную клетку с помощью агробактерий.

Генетически модифицированные растения получают простой инкубацией

любых частей растения с суспензией рекомбинантных агробактерий. Во всех

случаях достигается высокоэффективный перенос рекомбинантной ДНК в

геном трансформируемых клеток. Интеграция рекомбинантной ДНК проис-

ходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно

транскрибируемых генов (эухроматин).

Для внедрения больших фрагментов ДНК в клетки растений путем вве-

дения фланкирующих Т-область последовательностей из Ti-плазмиды в со-

став векторов для клонирования больших фрагментов ДНК получены соот-

ветствующие космидные векторы, а также векторы на основе искусственных

бактериальных хромосом (ВАС), получившие название TAC (transformation-

competent bacterial artificial chromosomes). ТАС-векторы могут быть репли-

цированы как в клетках Е. coli, так и агробактерий, что

позволяет с помощью

рекомбинантных агробактерий вводить в клетки растений фрагменты ДНК

длиной более 150 тнп.

Другие векторы для конструирования трансгенных растений c пря-

мым введением чужеродных генов в виде очищенной ДНК в растительные

клетки также разработаны, поскольку эффективные системы переноса генов

в растительный геном с помощью агробактерий работают не для всех видов

растений. Эти векторы в основном предназначены для сборки эффективной

экспрессионной генной конструкции в E. coli с последующим введением в

растительную в клетку очищенной ДНК. Наиболее известные способы дос-

тавки рекомбинантной ДНК в растительные клетки приведены в табл. 2.1

(подробно о способах доставки ДНК в клетки см. п. 2.1.6

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 89

Таблица 2.1

Методы введения рекомбинантной ДНК в растительные клетки

Метод

Комментарий

Использование Ti-плазмид

Высокоэффективная система, но применима не

для всех видов растений

Бомбардировка микрочастицами

(биобаллистика)

Эффективный и дешевый способ для широкого

круга растений (см. п. 2.1.6)

Использование вирусных

векторов

Пока неэффективный способ доставки ДНК в

растительные клетки

Микроинъекции

Имеют ограниченное применение, поскольку

единовременно можно сделать инъекцию лишь в од-

ну клетку

Введение ДНК в протопласты с

трансфекционными реагентами

Применяются только для введения генов в про-

топласты (клетки с удаленной клеточной стенкой), из

которых могут быть регенерированы жизнеспособ-

ные растения

Электропорация

Слияние с липосомами

Растительные векторы отличаются главным образом различными сиг-

нальными и регуляторными последовательностями, которые обеспечивают

эффективную транскрипцию генов в растительных тканях, и различными се-

лективными маркерами. Наиболее важными из регуляторных последователь-

ностей являются проксимальный участок промотора, связывающий РНК-по-

лимеразу; участок, кодирующий 5'-конец мРНК, необходимый для связыва-

ния с рибосомой и инициации трансляции, и эукариотический сигнал поли-

аденилирования на 3'-конце мРНК. Среди эукариотических организмов эти

конститутивные сигнальные элементы оказались, к счастью, высококонсер-

вативными и достаточно универсальными, так что растительные клетки в ос-

новном правильно экспрессируют чужеродные гены не только растений дру-

гих видов, но и млекопитающих, дрожжей и других эукариот. Но для обеспе-

чения достаточного уровня работы чужеродного гена необходимы сильные

регуляторные и сигнальные элементы экспрессии, в которых ключевыми яв-

ляются промоторы, хорошо работающие именно в клетке-мишени. Как и в

других системах, для конструирования растительных векторов популярны

элементы экспрессионной системы вирусов. В настоящее время одним из

наиболее широко используемых промоторов для двудольных является силь-

ный конститутивный 35S-промотор, выделенный из вируса мозаики цветной

капусты (ВМЦК, CaMV) из группы каулимовирусов. Также для двудольных

широко используется nos-промотор гена нопалин-синтазы агробактерий, хотя

он намного слабее 35S; для однодольных – промоторы гена алкогольдегидро-

геназы кукурузы (Adh) и гена актина 1 риса (Act).

Во многих векторах для трансформации растений как селективный, так

и целевой гены находятся под контролем все того же классического

35S-промотора. Наличие рядом двух копий 35S-промотора может отрица-

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ

2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 90

тельно сказываться на уровне экспрессии, поскольку множественные копии

этого вирусного промотора в геноме могут быть одной из причин «замолка-

ния» трансгена (явление сайлесинга (gene silencing) в ряду поколений, см.

п. 2.3.3

). В этой связи в настоящее время ведется как поиск новых, более эф-

фективных промоторов, так и создание их химерных форм. Особенно нужны

эффективные тканеспецифичные и индуцибельные промоторы для тканеспе-

цифичной и/или индуцированной экспрессии трансгена. Экспрессия под

сильными конститутивными промоторами, с одной стороны, приводит к

большому количеству целевого белка, с другой – к синтезу этого белка во

всех тканях растения, что может отрицательно сказаться на жизнеспособно-

сти и стабильности трансгенного растения и часто нежелательно для иссле-

дователей.

Векторы для трансформации хлоропластов высших растений

(транспластомные векторы) относятся к интегративным векторам. Хлоропла-

сты содержат полноценную генетическую систему, сходную с прокариотиче-

скими, т.е. все компоненты, необходимые для экспрессии генетической ин-

формации, включая белоксинтезирующий аппарат. Геном хлоропластов (пла-

стом) размером 130–160 тнп заключает в себе более 100 различных генов.

Векторы для трансформации хлоропластов предназначены для интеграции

чужеродной ДНК в пластом с помощью гомологичной рекомбинации. Пред-

ставляют собой кольцевые молекулы ДНК, содержащие кроме обычного век-

торного набора два участка длиной по 1-2 тнп, гомологичные последователь-

ностям ДНК хлоропластов, в которую и происходит встраивание. Экспресси-

онная кассета между этими гомологичными последовательностями состоит

из 5'-некодирующей области с промотором, регулирующим транскрипцию

(иногда включает последовательность лидерного пептида перед множествен-

ным клонирующим сайтом для целевой ДНК) и 3'-некодирующей регулятор-

ной области с терминатором транскрипции, стабилизирующей структуру

мРНК, что является одним из условий достижения высокого уровня экспрес-

сии трансгена в хлоропластах. Для получения эффективной транскрипции

клонированного гена часто используют сильный Prrn-промотор оперона ри-

босомальных рРНК (rrn). В зависимости от размера хлопластной ДНК расте-

ния данная векторная система позволяет вводить в геном хлоропластов

фрагменты ДНК длиной до 50 тнп, содержащие до 20–30 генов. В геноме

хлоропластов описано, по крайней мере, около 20 сайтов, по которым уда-

лось получить продуктивную интеграцию вектора.

Получение транспластомных растений, содержащих генетически изме-

ненные хлоропласты, является одним из перспективных направлений, по-

скольку хлоропласты не переносятся с пыльцой, а значит, устраняется опас-

ность распространения трансгенов с пыльцой среди перекрестно опыляемых

растений близких видов. Кроме того, сама пыльца трансгенных растений ме-