Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 161

Тотипотентность теоретически постулирована клеточной теорией,

сформулированной в независимых работах Шлейдена (1838), проведенных на

растительных объектах, и Шванна (1839) – на растительных и животных объ-

ектах.

Классические эксперименты были выполнены немецкими ботаниками

Фёхтингом (1878) и Рехингером (1893). Фехтинг выявил наличие полярности

у изолированных (даже очень тонких) фрагментов стеблей, которые во влаж-

ных условиях формировали в апикальной части почки, а в базальной – каллус

или корни. Рехингер определил, что даже минимальные размеры эксплантов

способны продуцировать почки и регенерировать целые растения, однако

этот размер ограничен. При культивировании фрагментов из почек тополя и

ясеня, из корней свеклы и турнепса на поверхности сырого песка он показал,

что с уменьшением толщины экспланта до 1,5 мм (не более чем 21-клеточный

слой) способность к регенерации перестает проявляться.

Термин «тотипотентность» как способность растительных клеток к

регенерации был введен Гебелем (1902), подтвердившим своими экспери-

ментами результаты Фёхтинга.

Описанные эксперименты относят к культивированию изолированных

тканей. И первой поддерживающей основой твердой среды был песок, а в ка-

честве питательного компонента использовали воду. Однако для успешного

воспроизводства методов культивирования in vitro необходимо использова-

ние многокомпонентных искусственных питательных сред и соблюдение

асептических условий.

Впервые такой подход был применен Габерландтом (1902). В качестве

питательной среды им был взят раствор минеральных солей по Кнопу, ис-

пользуемый с 1865 г. для песчаных культур, с добавлением источника угле-

водов сахарозы.

Вместе с тем для своих экспериментов Габерландт в качестве эксплан-

тов использовал только высокоспециализированные клетки (тычиночные во-

лоски традесканции, железистые волоски медуницы и крапивы, клетки серд-

цевины черешков водного гиацинта, замыкающие клетки устьиц лилейных,

палисадные клетки из листьев яснотки). В условиях культивирования такие

клетки оставались живыми в течение месяца, увеличивали размер, изменяли

форму, накапливали крахмал, но их деления не происходило. Это было свя-

зано не только с высокой специализацией клеток, но и с отсутствием в пита-

тельной среде веществ, способных индуцировать клеточное деление. Габер-

ландт писал, что у изолированных для культивирования тканей отсутствуют

стимулы, исходящие от целого организма или его частей.

Следует отметить, что в начале века успехов добились зоологи, рабо-

тавшие в области культивирования тканей животных. Благодаря работам

Гаррисона (1907), Карреля (1911) и других исследователей была создана ме-

тодика выращивания тканей животных на питательных средах природного

происхождения (плазме крови, зародышевой жидкости).

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 162

Выполненные в те годы работы по культивированию изолированных

тканей растений на экстрактах из растительных тканей не были продуктив-

ными. Лишь значительно позже, в 40–50-е гг., при использовании жидкого

эндосперма кокосового ореха – кокосового молока, было показано, что рас-

тительные экстракты могут оказывать стимулирующее действие на рост изо-

лированных органов и тканей в условиях культивирования, но только при их

добавлении к основному составу синтетических сред.

На фоне временных неудач по культивированию изолированных тка-

ней и клеток растений с начала века получил развитие метод культуры изо-

лированных зародышей, широко используемый в настоящее время для реше-

ния многих задач биологии и биотехнологии. В 1904 г. Ханниг провел ус-

пешную серию экспериментов по культивированию уже в асептических ус-

ловиях практически зрелых изолированных зародышей крестоцветных на

растворе минеральных солей и сахарозы. Однако зародыши, изолированные

из незрелых семян, в этих условиях не дифференцировались.

Практическое применение культуры изолированных зародышей для

преодоления несовместимости при отдаленной гибридизации было проде-

монстрировано работами Лайбаха (1925). Он вычленял зародыши из нежиз-

неспособных гибридных семян льна, завязавшихся в результате скрещивания

двух видов Linum perenne x Linum austriacum, и культивировал их на фильт-

ровальной бумаге или вате, смоченных раствором сахарозы. В результате

были выращены гибридные растения.

В Германии Котти (1922) и в США Роббинс (1922) постулировали не-

обходимость использования для культивирования меристематических кле-

ток, изолированных из кончиков корней или почек, более сложных по соста-

ву культуральных сред с добавлением аминокислот и дрожжевого экстракта.

Эти подходы были удачно реализованы в 30-е гг. в работах американ-

ского исследователя Филиппа Уайта и французского исследователя Роже

Готре, которых принято считать родоначальниками современных методов

культивирования изолированных органов и тканей растений. Успех работ

Уайта и Готре был определен оптимальным сочетанием объектов культиви-

рования и состава питательных сред.

Серия работ Уайта (1934) была посвящена выращиванию изолирован-

ных корней томатов, которые при периодических пересадках (пассировании)

отрезками кончиков корней на свежую среду могли расти неограниченно

долго.

Другое направление работ Уайта связано с изучением опухолей расте-

ний, для чего был использован метод культивирования изолированных тканей.

Большое значение имеют работы Уайта (1939; 1941), посвященные раз-

работке составов питательных сред. Среда Уайта, содержащая наряду со

смесью минеральных солей и витамины, в настоящее время широко исполь-

зуется для выращивания тканей многих культур. При культивировании ткани

табака на этой среде впервые удалось наблюдать спонтанное развитие зачат-

ков стеблевых почек и формирование побегов.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 163

Основные объекты культивирования в работах Готре – камбиальная

ткань стебля древесных и травянистых растений, ткань корнеплодов и клуб-

ней. В основе минерального состава среды была использована питательная

смесь Кнопа. Готре заменил жидкую среду на твердую – агаровую и ввел в

состав культуральных сред фитогормон ауксин – индолилуксусную кислоту

(ИУК). Наличие этих компонентов в среде способствует длительной проли-

ферации культивируемых каллусных тканей. В работах Готре каллусная

ткань, индуцированная из камбия, могла продолжать развитие в течение 18

месяцев.

После появления работ Р. Готре и Ф. Уайта метод культуры изолиро-

ванных тканей растений начал быстро развиваться во многих странах. Вво-

дили в культуру все новые и новые виды растений.

Ауксины были открыты в 20-е гг. как факторы тропизмов растений.

Природный ауксин в растениях представлен в основном в виде р-индолил-3-

уксусной кислоты (гетероауксином) – ИУК. Этот фитогормон был открыт в

1926 г. Вентом. В начале 30-х гг. Ф. Кегль выделил его в чистом виде и уста-

новил химическое строение. В 60-е гг. был выделен второй представитель

этого класса фитогормонов – фенилуксусная кислота (ФУК).

Другой класс фитогормонов – цитокинины – открыли в 1955 г. Скуг и

Миллер, изучая рост каллуса сердцевинной паренхимы табака. Путем ще-

лочного гидролиза ДНК животного происхождения они получили кинетин,

который оказался способным вместе с ауксином стимулировать деление кле-

ток кусочка ткани сердцевинной паренхимы и камбия табака. На среде с

ИУК без кинетина клетки не делились. В дальнейшем различные концентра-

ции и соотношения цитокининов и ауксинов стали использоваться для каллу-

согенеза и индукции морфогенеза в культуре изолированных тканей растений.

В 1957 г. впервые индуцирован морфогенез в культуре каллусной тка-

ни моркови и получены растения-регенераты. Успех достигнут благодаря ра-

ботам Бутенко и Стеварда. Огромная заслуга в развитии биотехнологических

работ в нашей стране принадлежит Р.Г. Бутенко из Института физиологии

растений РАН. Вместе со своими сотрудниками она создала мощную школу

по культуральным работам у растений, что значительно расширило возмож-

ности по реконструкции, именно генома растений [4

, 6].

В 1959 г. Никел и Тулик создали метод выделения и выращивания

больших масс клеточных суспензий, а вслед за этим Джонсон (1960), Павло-

вай и Бутенко (1969) разработали метод культивирования отдельной клетки с

помощью ткани-няньки.

В 1959 г. французский ученый Ж. Морель предложил метод культиви-

рования изолированных меристем, который он использовал для микрораз-

множения орхидей. Еще ранее этим же методом он получил безвирусные

растения картофеля. В нашей стране работы по микроразмножению мери-

стемным методом на гербере были выполнены в Институте физиологии АН

СССР под руководством Р.Г. Бутенко (1960, 1964).

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 164

В 1960 г. английским профессором Коккингом были впервые получены

с использованием ферментов изолированные протопласты и разработаны ус-

ловия для их культивирования. Через 10 лет, в 1970 г., в той же лаборатории

Пауэр с сотрудниками осуществили искусственное слияние протопластов и

таким образом открыли путь к созданию соматических гибридов.

В 1964 г. индийские ученые Гуха и Магешвари индуцировали андроге-

нез в культуре пыльников и использовали этот метод для получения гапло-

идных растений.

В 1971 г. Загорска и другими впервые получены, изучены и описаны

сомаклональные варианты табака.

Таким образом, открытие самой возможности роста клеток вне орга-

низма и регенерации из них растений, а также веществ, стимулирующих этот

процесс (фитогормонов), создало предпосылки для повышения эффективно-

сти растениеводства и селекции растений, а также новых возможностей ис-

пользования растений (промышленное производство БАВ, съедобные вакци-

ны и др.).

Наибольшее распространение в практике в настоящее время имеют ре-

зультаты исследований по тканевой и клеточной биотехнологии. Клетки и

ткани растений, выращиваемые на искусственных питательных средах в сте-

рильных условиях (в стекле), называют культурой изолированных тканей.

Любая ткань растений – это сообщество клеток, и если она изолирована

(выделена) из целого организма, то лишена его регулирующего воздействия

и питания. Следовательно, одним из принципов метода культуры тканей

(клеток) является воспроизведение in vitro условий, близких или идентичных

тем, в которых клетки находятся на материнском растении, для обеспечения

их полноценного питания и развития. Тогда при строгом соблюдении этих

условий в культуре тканей размножаются (регенерируют) идентичные ис-

ходному генотипу клетки и растения. Это одно из направлений использова-

ния. Однако если такие условия достигаются и воспроизводятся не в полной

мере, то клетка оказывается в относительно иных физико-химических усло-

виях, что приводит к временному и качественному изменению в реализации

ее генетической информации. Смещая в эксперименте временную реализа-

цию генетической информации (с помощью гормональных воздействий),

можно наблюдать ее модификацию, а под влиянием различных экстремаль-

ных трансформирующих факторов возможно ее изменение в нужном направ-

лении. Клетка в условиях культуры in vitro проявляет цитогенетическую не-

устойчивость, в результате этого возникают клетки с генетической гетеро-

генностью, появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые могут

быть исходным материалом для селекции.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 165

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тка-

ней должны включать все необходимые растениям неорганические элемен-

ты: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий,

кальций, магний, сера), микроэлементы – в микромолярных (железо, бор,

марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: ви-

тамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина,

мезоинозит и др.) [12

В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и

твердые питательные среды.

Для приготовления твердых питательные сред используют агар-агар

(0,7–1 %), который представляет собой полисахарид, получаемый из морских

водорослей. Обычная его концентрация – 8–10 г на литр среды. Агар обеспе-

чивает диффузию питательных элементов из среды в культивируемые ткани.

Вместо агара можно использовать биогели.

Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты

среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным кон-

центрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет спо-

собность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН

среды может варьировать от 5,2 до 6,6.

Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь не-

обходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутст-

вуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей

являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полно-

ценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим

ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения.

Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10

–3

М.

Наиболее значимы из них азот, фосфор, натрий, калий, магний, кальций и сера.

Микроэлементы составляют в среде концентрации 10

–6

М. Присутствие

их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым

данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 %

в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих

пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсут-

ствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некото-

рые макроэлементы.

Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому

что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстано-

вительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее сле-

дуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор.

Органические составляющие сред. Согласно многочисленным дан-

ным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей

подсолнечника, табака, топинамбура и др.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 166

В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют

аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспараги-

новую кислоту) или гидролизат казеина – источник аминокислот.

В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот зна-

чительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний

вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник

азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты,

гликокол, аспарагин, пролин.

Формы аминокислот также по-разному влияют на рост: D-формы –

токсичны, L-формы – пригодны. Аминокислоты, внесенные в питательную

среду в дополнение к нитратам, могут оказывать стимулирующее, угнетаю-

щее и формативное действие на рост культуры тканей. Это зависит как от

самой аминокислоты, так и от ее содержания в среде.

Очень часто исследователи заменяют смесь аминокислот гидрлизатом

казеина. Последний способен увеличивать содержание никотина в культурах

табака и подавлять биосинтез липидов во многих каллусных и суспензион-

ных культурах.

Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для

культивирования изолированных клеток и тканей растений, так как в боль-

шинстве случаев последние неспособны к автотрофному питанию.

Культуры тканей, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении

углеводного питания. При изолировании и помещении на питательную среду

кусочков хлорофиллоносных тканей они, как правило, теряют хлорофилл.

При выращивании на свету одни ткани остаются лишенными хлоро-

филла (галловая опухоль партеноциссуса, ткани сердцевинной паренхимы

табака и др.). Другие ткани зеленеют на свету, но не способны обеспечивать

себя полностью углеводами за счет фотосинтеза, и их необходимо выращи-

вать на питательной средах, содержащих сахар.

При помещении кусочка ткани, изолированного из растения, на пита-

тельную среду без сахара его содержание в ткани начинает уменьшаться.

Трата сахаров зависит от сезонных изменений в самой ткани (ткани,

взятые весной, теряют сахаров больше) и от содержания ауксинов в среде.

При образовании каллуса старая ткань быстро теряет сахара, а в новообра-

зующейся их количество возрастает. При помещении ткани на питательную

среду, снабженную сахаром, ткани поглощают и трансформируют сахара.

Количество поглощенного сахара и в особенности его превращения в другие

формы зависят как от источника сахаров в среде, так и от типа ткани.

Наилучшим источником углеродного питания для большинства тканей

является сахароза, обычно применяемая концентрация ее в питательной сре-

де составляет 2–5 %. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в

концентрации 3 %. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного пи-

тания можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. После сахаро-

зы наиболее употребляемым источником углеродного питания для культиви-

рования тканей растений является глюкоза. Из 33 исследованных культур

(травянистых и древесных) 85 % имели отличный и хороший рост на среде с

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 167

глюкозой. На третьем месте по эффективности использования культурами

тканей растений стоит фруктоза. Ее успешно используют для своего роста

культур фруктозу. Галактоза заметно отличается от глюкозы и фруктозы по

действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изучен-

ных культур почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные,

отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и

органов растений.

В отличие от изолированных корней, которые могут расти только на

среде с сахарозой, другие ткани, обладающие активными гидролитическими

ферментами, могут использовать для питания самые разнообразные сахара и

полисахариды. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от

ее происхождения. Перенос ткани с более бедной сахаром среды на более бо-

гатую обычно не вызывает нежелательных явлений, обратный перенос при-

водит к некрозам тканей.

Основное действие сахарозы состоит в увеличении уровня образования

метаболитов, использование исходно повышенных концентраций сахарозы

обычно приводит к росту выхода вторичных метаболитов в культурах. Влия-

ние изначально высоких концентраций сахарозы, вероятно, состоит в увели-

чении осмотического потенциала среды.

Необходимо отметить влияние условий стерилизации на действие са-

харов. При автоклавировании сахароза дает следы глюкозы и фруктозы, а в

среде с сахарозой, которая не подверглась специальной очистке, наблюдается

образование веществ, стимулирующих рост тканей.

Выращивание хлорофиллоносных и лишенных хлорофилла тканей на

свету или в темноте изменяет как содержание растворимых сахаров в ткани,

так и соотношение разных их групп. Различия в спектральном составе света

также сказываются на углеводном метаболизме тканей.

Витамины принадлежат к активным веществам, играющим существен-

ную роль в культуре тканей. Известно, что в процессе роста растения синте-

зируют необходимое им количество витаминов. Несмотря на это, исследова-

ния показывают, что при внесении витаминов в питательную среду рост тка-

ни улучшается. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катали-

зирующих многие метаболически важные реакции. Витамины делятся на во-

дорастворимые и жирорастворимые.

В состав сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиа-

мин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбино-

вую кислоту. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее дейст-

вие может определяться синергизмом между отдельными витаминами.

По наблюдениям Хендерсона, смесь витаминов наиболее активна после сла-

бого роста ткани в предыдущем пассаже.

Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности

ткани синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от

состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут

взаимодействовать синергически или антагонистически. Интересно, что кле-

точная суспензия, полученная путем помещения ткани в жидкую среду, при

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 168

пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем

сама ткань. Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит

к увеличению одиночных суспендированных клеток. Следует отметить, что в

каждом конкретном случае место отдельного витамина в сложной цепи мета-

болизма различно.

Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганиз-

мы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически

чистых компонентов среды.

Вместе с тем некоторые питательные среды содержат натуральные

биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое мо-

локо), каштана, картофельный отвар и др. Они являются поставщиками более

сбалансированных питательных компонентов по сравнению с искусственны-

ми средами.

В целях предотвращения возможного бактериального и грибного за-

грязнения в среды добавляют иногда такие антибиотики, как полиены (амфо-

терицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, ле-

вомицитин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат),

рифамгащин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании,

поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.

Наличие макро- и микроэлементов в составе культуральных сред опре-

деляется потребностями объектов культивирования. Широко применяемые в

настоящее время среды Гамборга В5 и Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 4.1,

табл. 4.2) содержат по сравнению со средами Уайта значительно большие ко-

личества калия, фосфора и микроэлементов [12, 14].

Таблица 4.1

Примеры составов наиболее употребляемых питательных сред

для культивирования растительных клеток тканей

Составные компоненты

Концентрация компонентов в среде, мг/л

Уайта

МС

В5

Нича

N6 (Chu)

NО

–

1 650

–

720

–

KNO

1 900

2 500

950

2 830

СаС1

·2Н

–

440

150

–

166

СаС1

–

166

–

MgSO

·7 H

750

370

250

185

КН

РО

170

400

(NH

)

–

134

–

463

Ca(NO

)

·4 H

300

–

200

–

NaH

·H

–

150

–

KC1

–

0,75

0,83

0,75

–

0,8

1,5

6,2

1,6

MnSO

·4 H

22,3

–

MnSO

·H

–

3,3

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 169

Продолжение табл. 4.1

Составные компоненты

Концентрация компонентов в среде, мг/л

Уайта

МС

В5

Нича

N6 (Chu)

ZnSO

·7 H

8,6

1,5

NaMoO

·2 H

–

0,25

–

MoO

0,001

–

CuSО

·5H

0,01

0,025

–

CoCl

·6H

–

0,025

–

Fe(SO

)

2,5

–

FeSO

·7 H

–

27,8

Nа

ЭДТА·2 H

–

37,3

Органические вещества:

Никотиновая кислота

0,5

Пиридоксин гидрохлорид

0,01

0,5

Тиамин гидрохлорид

0,01

0,1

0,5

Биотин

–

0,05

–

Инозит

–

100

–

Глицин

–

Фолиевая кислота

–

0,5

–

Сахароза

20 000

30 000

20 000

50 000

–

5,8

5,5

–

5,8

В настоящее время существует большое количество различных пропи-

сей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток.

Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов экс-

плантов. Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые бы-

ла составлена и предложена в 1962 г. Кроме того, в настоящее время широко

известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др. (табл. 4.1

), отличающиеся набором

отдельных составляющих компонентов и их соотношением. Существуют и

коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и

российскими фирмами.

Таблица 4.2

Состав среды Мурасиге-Скуга

Компоненты

Конечная кон-

центрация в

среде, М

Концентрация запасного

раствора, мг/л

Объем запасного

раствора на 1 л

среды, мл

NО

2,06·10

-2

33 000

KNO

1,88·10

-2

38 000

СаС1

·2Н

3,00·10

-3

8 800

MgSO

·7 H

1,50·10

-3

7 400

КН

РО

1,25·10

-2

3 400

5,00·10

-6

166

1,00·10

-4

1 246

MnSO

·4 H

9,99·10

-5

4 460

ZnSO

·7 H

2,99·10

-5

1 720

NaMoO

·2 H

1,00·10

-6

CuSО

·5H

1,00·10

-7

CoCl

·6H

1,00·10

-7

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 170

Продолжение табл. 4.2

Компоненты

Конечная кон-

центрация в

среде, М

Концентрация запасного

раствора, мг/л

Объем запасного

раствора на 1 л

среды, мл

FeSO

·7 H

1,00·10

-4

5 560

Nа

ЭДТА·2 H

1,00·10

-4

7 460

Мезоинозит

2,06·10

-2

10 000

Гидролизат казеина

Витамины:

РР

2,06·10

-2

500

2,06·10

-2

500

2,06·10

-2

500

Аминокислоты:

Глицин

2,06·10

-2

2 000

Источник углеводов:

Сахароза

8,80·10

-2

Добавление в виде порошка

30 г/л

Агар-агар

Предварительный разогрев

в воде до растворения

7 г/л

П р и м е ч а н и е. pH = 5,8

МС – самая универсальная среда, пригодная для образования и роста

каллуса, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Среда

Гамборга и Эвелега применима для бобовых растений и злаков. Среда Уайта

обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенера-

ции. Среда Нича рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыль-

ников.

–

Помимо источников углерода, азота и других минеральных компонен-

тов, среда для культивирования тканей многоклеточных организмов, таких

как растения, должна содержать специфические стимуляторы и регуляторы

роста: фитогормоны или их синтетические аналоги [11

]. Известно около

5 тыс. соединений, обладающих регуляторной активностью, однако на прак-

тике применяется лишь несколько десятков.

Известны три класса фитогормонов, действующих преимущественно

как стимуляторы (ауксины, гибберелины, цитокинины), и два класса фито-

гормонов, оказывающих главным образом ингибирующее действие (абсцизо-

вая кислота, этилен).

Ауксины – производные аминокислот: ИУК – триптофана, ФУК – фе-

нилаланина. Природный ауксин в растениях встречается в основном в виде

β-индолил-3-уксусной кислоты (гетероауксином) – ИУК, второй представи-

тель этого класса фитогормонов — фенилуксусная кислота, однако его роль в

фиторегуляции значительно меньше ИУК.