Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

163

Останні два елементи, Inr та DPE, як правило, присутні (якщо при-

сутні) одночасно. Наприклад, приблизно 14 % промоторів дрозофіли

містять усі три елементи, 29 % – тільки ТАТА-бокс, 26 % – тільки DPE

разом з Inr, 31 % не містять жодного з трьох елементів . У останньому

випадку промотор визначається іншими, більш специфічними еле-

ментами послідовності. Зокрема, досить часто зустрічається так

званий GC-бокс, що розташований, як правило, трохи вище

(upstream) відносно положення ТАТА-боксу.

Базальні фактори транскрипції

Послідовність збирання преініціаторного комплексу може бути різ-

ною, але всі базальні фактори мають бути присутніми у складі РІС

для подальшого запуску транскрипції.

TFIID – один із найважливіших базальних факторів, який визначає

впізнання стандартних елементів базального промотора (якщо вони

присутні). Основою структури TFIID є

ТВР (TATA-box Binding Protein)

– білок зі специфічною спорідненістю до ТАТА-боксу. Досить широкий

β-шар у складі ТВР взаємодіє з маленьким жолобком ДНК, наслідком

чого є суттєва деформація подвійної спіралі з її розкручуванням та

значним вигином у протилежний від білка бік (див. рис. 3.18). Саме

з цього протилежного боку (усередині вигину) розташовуються інші

білкові компоненти преініціаторного комплексу, які обгортаються

промотором (див. нижче). Отже, вигин ДНК, який індукується ТВР,

організує промотор і зв'язані з ним елементи в єдиний компактний

комплекс і підтримує його стабільність. Досить часто (але не обов'яз-

ково) зв'язування TFIID ініціює збирання РІС.

Із ТВР у складі TFIID зв'язані так звані ТВР-асоційовані фактори

(

TAFs – TBP Associated Factors) – вісім або більше білків (конкретний

склад факторів варіює для різних промоторів). TAFs взаємодіють з ТВР

і між собою, деякі з них здатні також взаємодіяти з ДНК. Зокрема,

TAF

ІІ

150 (або його аналог, 150 – молекулярна вага в кілодальтонах) упі-

знає DPE (рис. 6.4), тобто забезпечує зв'язування TFIID із базальним

промотором, у складі якого відсутній ТАТА-бокс. Якщо у промоторі не-

має також і DPE, інші TAFs здійснюють білок-білкові взаємодії з фак-

торами транскрипції, що зв'язані з іншими елементами послідовності.

Наприклад, GC-бокс упізнається транскрипційним фактором Sp1

(Specificity p

rotein 1), який, у свою чергу, рекрутує TAF

ІІ

110, що стає

компонентом TFIID через взаємодію з TAF

ІІ

250 (рис. 6.4).

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

164

TBP

TAF

110

Sp1

TBP

TAF

250

TAF

150

TAF

250

TAF

150

TAF

250

TAF

150

ТАТА

DPE GC

Рис. 6.4. Взаємодія TFIID з базальним промотором через ТВР

(якщо присутній ТАТА-бокс), через один з TAFs (якщо присутній DPE),

через інший TAF, що взаємодіє з транскрипційним фактором,

зв'язаним із GC-боксом

Білок TAF

ІІ

250 є практично обов'язковим компонентом TFIID

(як і ТВР), виконуючи роль основного фактора збирання, з яким взає-

модіють інші TAFs. Крім того, TAF

ІІ

250 містить у своєму складі бромо-

домен і гістон-ацетилтрансферазну активність (розділ 4): відповідно,

здатен як впізнавати ацетильовані гістони в зоні промоторів , так

і здійснювати таке ацетилювання.

TFIIA – гетеродимерний білок, кофактор, що стабілізує комплекс

ТВР з ДНК. Відповідно, цей фактор можна було б вважати ще одним

TAF. У системах in vitro TFIIA не є необхідним для ініціації транскрип-

ції, проте його відсутність у клітинах дріжджів є летальною.

TFIIB – мономерний білок із мультидоменною структурою . Два

С-кінцеві домени взаємодіють із ДНК по обидва боки від сайта

зв'язування ТВР, із внутрішнього боку вигину, який індукується

цим білком (рис. 6.5). Таким чином, два білки, які взаємодіють та-

кож між собою, зв 'язуються з ДНК кооперативно, взаємно підси-

люючи спорідненість до неї.

Два С-кінцеві домени TFIIB мають різну структуру і взаємодіють

з різними елементами ДНК (маленьким та великим жолобками). Така

асиметрія (існування двох альтернативних варіантів зв'язування

з ДНК) відіграє роль у визначенні напрямку транскрипції. Це пов’я-

зано з тим, що N-кінцева частина TFIIB (практично не має регулярної

вторинної структури) взаємодіє з РНК-полімеразою ІІ. Таким чином,

саме TFIIB визначає положення полімерази на ДНК відносно старто-

вої точки в одній із двох можливих орієнтацій ферменту.

Витягнута N-кінцева частина TFIIB взаємодіє з РНК-полімеразою

в зоні активного центру, після початку транскрипції здійснює взаємодії

з РНК-ДНК гібридом, а також блокує канал виходу РНК. Тобто TFIIB

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

165

певною мірою виконує функції, аналогічні до функцій бактеріального

σ-фактора (розділ 5). Відповідно, TFIIB має бути звільненим при пере-

ході від ініціації до елонгації транскрипції (див. нижче).

TBP

TFIIB

Рис. 6.5. Комплекс із ДНК ДНК-зв'язувального домену ТВР

і С-кінцевої частини TFIIB у двох проекціях (1D3U)

TFIIF – гетеродимер, взаємодіє з РНК-полімеразою ІІ (у зоні актив-

ного центру), з ДНК, з базальними факторами TFIIЕ та TFIIН. Після

первинного плавлення ДНК при ініціації транскрипції TFIIF здійснює

взаємодії з нематричним ланцюгом, стимулює роботу TFIIН (див. ни-

жче), запобігає абортивній ініціації. Після завершення ініціації TFIIF

разом з іншими базальними факторами дисоціює від РНК-полімерази,

але може реасоціювати з нею під час елонгації – у випадку зупинки

ферменту. Його роль як фактора елонгації транскрипції полягає

стимуляції продовження руху полімерази.

TFIIЕ – гетеродимер, стимулює роботу TFIIН, взаємодіє з транскри-

пційним міхуром при ініціації транскрипції.

TFIIН – найбільший із базальних факторів, складається з 10 суб-

одиниць, має молекулярну вагу, порівняну з такою РНК-полімерази.

TFIIН – єдиний базальний фактор, що має ферментативні активності.

Перша з них – АТР-залежна ДНК-

геліказна (гелікази – helicases –

ферменти, що розкручують подвійну спіраль). Частина TFIIН взаємо-

діє з ДНК нижче від активного центру полімерази (по ходу транскри-

пції). Імовірно, конформаційні зміни білка, зумовлені гідролізом АТР,

викликають обертання подвійної спіралі навкруг своєї осі, а оскільки

вище від активного центру ДНК є жорстко зафіксованою, таке обер-

тання призводить до локального плавлення дуплекса в зоні стартової

точки. РНК-полімераза ІІ є єдиною з полімераз, яка потребує такої ге-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

166

ліказної активності при ініціації транскрипції, – інші РНК-полімерази,

еукаріотичні та бактеріальні, утворюють транскрипційний міхур зав-

дяки певним ДНК-білковим взаємодіям, яким сприяє негативна над-

спіралізація (див. розділ 5).

Друга ферментативна активність TFIIН –

кіназна, за рахунок якої

здійснюється фосфорилювання С-кінцевого домену РНК-полімерази

при переході від ініціації до елонгації транскрипції. У дефосфорильова-

ній формі (форма А РНК-полімерази), на стадії збирання преініціатор-

ного комплексу, CTD взаємодіє з базальними факторами транскрипції;

після фосфорилювання певних залишків Ser (форма О РНК-поліме-

рази) ця взаємодія порушується.

Медіатор. Ефективне збирання преініціаторного комплексу є мож-

ливою лише за участі ще одного структурного модуля – медіатору

(mediator), який містить понад 20 субодиниць (склад варіює для різних

промоторів – певний мінімальний набір субодиниць доповнюється

більш специфічними за рахунок взаємодії з транскрипційними факто-

рами). Цей мультибілковий комплекс має витягнуту структуру, яку

можна розділити на три частини: голова (h, head), середня частина

(m, middle) і хвіст (t, tail). Медіатор здійснює лише білок-білкові взаємодії:

голова й середня частина взаємодіють з РНК-полімеразою, середня час-

тина та хвіст – зі специфічними факторами транскрипції, що зв'язані

на проксимальних і дистальних елементах промотора (рис. 6.6).

актори

ранскрипції

Медіатор

TBP

TAFs

CTD

RNAP

Рис. 6.6. Схема взаємного розташування елементів

у складі преініціаторного комплексу РНК-полімерази ІІ.

Стрілкою позначено напрямок транскрипції

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

167

Таким чином, медіатор є засобом передачі “активаційних сигналів”

з регуляторних елементів послідовності на РНК-полімеразу: збільшен-

ня кількості взаємодій підсилює ефективність збирання РІС.

Ініціація транскрипції РНК-полімеразою ІІ

Збирання преініціаторного комплексу є першою подією процесу

ініціації. Схему будови комплексу наведено на рис. 6.6: ДНК (базаль-

ний промотор) довжиною приблизно 70 пар основ обгортає білкові

компоненти РІС. При цьому промоторна ДНК зв'язана головним чи-

ном із базальними факторами транскрипції, не з полімеразою: зажим,

що формується щелепами полімерази (рис. 6.1) не дозволяє розмісти-

тися дволанцюговій ДНК у щілині поблизу від активного центру.

На першому етапі ініціації утворюється закритий преініціаторний

комплекс (рис. 6.7).

Медіатор

Закритий

комплекс

Відкритий

комплекс

РНК

АТР

Локальне плавлення

НК, синтез

первинного

ранскрипту

Фосфорилюванн я

CTD, очищення

промотора

Елонгація

Рис. 6.7. Процес ініціації транскрипції РНК-полімеразою ІІ

Наступна подія – утворення відкритого комплексу – локальне плав -

лення ДНК за рахунок геліказної активності TFIIH. Нематричний лан-

цюг після цього захоплюється фактором TFIIF, матричний – занурю-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

168

ється в активний центр, де взаємодіє також із N-кінцевою частиною

TFIIВ. Починається синтез короткого первинного транскрипту, коро-

тка гібридна подвійна спіраль стабілізується тим самим N-кінцевим

доменом TFIIВ, який при цьому блокує канал виходу РНК.

На наступному кроці спрацьовує кіназна активність TFIIH: від-

бувається фосфорилювання, яке є точкою перемикання ініціації на

елонгацію. CTD втрачає зв'язок із базальними факторами транс-

крипції, які дисоціюють від полімерази – відбувається очищення

промотора. РНК-полімераза продовжує синтез РНК, а частина базаль-

них факторів може залишатися на базальному промоторі й ініцію-

вати зв'язування іншої полімерази.

Після термінації транскрипції (розділ 7) РНК-полімераза зв'язується

з TFIIF, який рекрутує специфічну фосфатазу – відбувається дефос-

форилювання CTD, і полімераза вступає в новий робочий цикл.

РНК-полімерази І і ІІІ

Ініціація транскрипції генів рибосомної РНК

Система ініціації транскрипції РНК-полімеразою І виглядає значно

простіше. Промотор кожного кластера генів рибосомної РНК (рис. 6.8,

див. також рис. 4.6) містить два елементи послідовності: кор-елемент

у зоні стартової точки та UCE (Upstream C

ontrol Element) на відстані

приблизно 100 пар основ від старту. Ініціація залежить від двох

транскрипційних факторів: UBF (Upstream B

inding Factor) і SL1,

останній позначають іноді як TFIB.

Зв'язування UBF є передумовою ініціації, але цей фактор не має ви-

сокої специфічності щодо елементів промотора: він зв'язується будь-де

в межах рибосомного кластера. Димери UBF містять у своїй структурі

HMG-бокси (див. рис. 3.17), які сприяють вигинам ДНК. У результаті

зростає імовірність наближення у просторі двох елементів промотора,

з якими специфічно взаємодіє SL1. Цей фактор є аналогом фактора

TFIID РНК-полімерази ІІ: він містить ТВР і певний специфічний набір

асоційованих з ним факторів, від яких і залежить спорідненість SL1 до

промотора рибосомного кластера. SL1 рекрутує до промотора РНК-

полімеразу І, яка починає синтез попередника рРНК.

Отже, для РНК-полімерази І виконується та сама закономірність,

що й для РНК-полімерази ІІ: незалежно від присутності чи відсутності

ТАТА-боксу (який відсутній у промоторі RNAPI), ТВР має бути обов'яз-

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

169

ковим компонентом преініціаторного комплексу, сприяючи організа-

ції промоторної ДНК навкруг полімерази. Ця закономірність зберіга-

ється також і для РНК-полімерази ІІІ.

UBF

SL1

RNAP I

–

100

UCE

Кор

Кодуюча ділянка

Рис. 6.8. Ініціація транскрипції РНК-полімеразою І

Ініціація транскрипції РНК-полімеразою ІІІ

Промотори генів тРНК і 5S рРНК, які транскрибуються РНК-полі-

меразою ІІІ, знаходяться всередині кодуючої частини гена (рис. 6.9).

Два елементи промотора гена тРНК, так звані бокси А і В, упізнають-

ся фактором TFIIIC, який рекрутує TFIIIВ, який, у свою чергу, викли-

кає зв'язування полімерази. Фактор TFIIIВ містить у своєму складі

ТВР і кілька специфічних для РНК-полімерази ІІІ TAFs.

Усередині гена 5S рРНК замість боксу В присутній інший елемент –

бокс С, що впізнається фактором TFIIIА. Далі цей білок рекрутує

TFIIIC і формування преініціаторного комплексу продовжується так

само, як і на гені тРНК.

Описані події відбуваються однократно. Коли починається транс-

крипція, полімераза витісняє TFIIIC (і TFIIIА), що знаходиться попере-

ду від неї. TFIIIВ при цьому залишається на місці, рекрутуючи нову

полімеразу для нового раунду транскрипції.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

170

Ген тРНК Ген 5S рРНК

Бокс А Бокс В Бокс А Бокс С

TFIIIC

TFIIIA

TFIIIB

TBP

RNAPIII

Рис. 6.9. Ініціація транскрипції РНК-полімеразою ІІІ.

Механізми активації транскрипції

Кілька десятків тисяч еукаріотичних генів (зрозуміло, що йдеться

головним чином про білкові гени, які транскрибуються РНК-полі-

меразою ІІ) потребують диференційної активації / репресії в певні

моменти залежно від типу клітин, стадії розвитку, зовнішніх умов

тощо. Як і в прокаріотів (розділ 5), ключовими елементами системи

регуляції транскрипції є регуляторні цис-елементи послідовності

(проксимальні й дистальні елементи промоторів) і транс-регулятори –

білкові транскрипційні фактори (ТФ, під якими будемо розуміти спе-

цифічні, не базальні, фактори транскрипції). Проте кількість еукаріо-

тичних генів є значно більшою, і вони не об'єднуються в оперони, коли

кілька генів перебували б під контролем одного транскрипційного

фактора. Зрозуміло, що кожен ген не може контролюватися своїм

особливим фактором транскрипції: фактор також є продуктом певно-

го гена, який також має контролюватися певним фактором.

Другою особливістю еукаріотів є та обставина, що ДНК клітинного

ядра організована у складні хроматинові структури (розділ 4), тобто

виникає проблема доступності регуляторних елементів послідовності

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

171

(а також базальних промоторів) до транскрипційних факторів,

РНК-полімерази та елементів її преініціаторного комплексу. Отже, акти-

вація транскрипції потребує перебудов структури хроматину в напрям-

ку деконденсації хроматинової фібрили та визволення цис-елементів

від нуклеосом. Для реалізації таких перебудов є два основні інструме-

нти, які діють у тісній координації один з одним: система посттран-

сляційних модифікацій гістонів і АТР-залежні фактори ремоделюван -

ня хроматину, що здійснюють репозиціювання нуклеосом.

Транскрипційні фактори

Відповіддю на необхідність регулювати окремо активність великої

кількості генів лімітованим набором факторів транскрипції

є принцип

модульності будови еукаріотичних промоторів. Цей

принцип ілюструє рис. 6.10: три регуляторні (наприклад, проксима-

льні) елементи послідовності мають спорідненість до трьох транскри-

пційних факторів, із трьох пар такої взаємодії можна скласти шість

комбінацій. Насправді таких пар значно більше, і кількість можливих

комбінацій – практично нескінченно велика. Кожен промотор може

мати свій власний набір модулів, який відрізняє його від інших про-

моторів, і, відповідно, власний набір досить великої кількості транс-

крипційних факторів, потрібних для активації гена.

AD – активаційний

омен

-зв'язуючий

омен

Рис. 6.10. Модульний принцип взаємодії

транскрипційних факторів із промоторами

Із принципом модульності тісно пов'язаний принцип кооператив-

ності

взаємодії транскрипційних факторів із цис-елементами, що

знаходяться поряд. Кожен з ТФ зазвичай має порівняно невисоку

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

172

спорідненість до відповідних елементів послідовності. Але якщо два

цис-елементи розташовані поруч, і два ТФ здатні взаємодіяти між со-

бою, спорідненість кожного до них підвищується (рис. 6.11): стабіль-

ність комплексу значно зростає (експоненціально, див. рівняння (1.6))

завдяки сумі невеликих знижень вільної енергії при взаємодії кожно-

го окремого ТФ. Приклад на рис. 6.11 показує лише один “елемен-

тарний акт” кооперативної взаємодії кількох ТФ із промотором.

Сла

кі сайти

зв'язування

Кооперативна

взаємодія

Рис. 6.11. Приклад кооперативної взаємодії

двох транскрипційних факторів із ДНК (1A02)

Крім того, більшість факторів транскрипції мають у своїй струк-

турі принаймні два домени: той, що взаємодіє з ДНК, і так званий

активаційний (AD, Activation D

omain), який використовується для

взаємодії з іншими білками (рис. 6.10). Активацйні домени зв'язують

білкові кофактори (коактиватори), у результаті на дистальних і про-

ксимальних елементах промотора формується складний мультибіл-

ковий комплекс –

енхансосома (enhanceosome). До складу енхансо-

сом часто входять також гістон-ацетилтрансферази та фактори ре-

моделювання хроматину (див. нижче).

Різні елементи енхансосоми діють синергічно, підвищуючи зага-

льну стабільність комплексу. З іншого боку, відсутність кількох еле-

ментів може зумовити дестабілізацію та розпад енхансосоми, де

спорідненість до ДНК кожного окремого елемента є невисокою.