Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

143

рюються замість двох зруйнованих. Аналогічно, пересування полі-

мерази назад буде супроводжуватись руйнуванням пари в гібриді

на 3'-кінці РНК (3'-кінцевий нуклеотид при цьому опиняється у вто-

ринному каналі) і пари ДНК позаду від міхура з одночасним утворен-

ням пари ДНК попереду та гібрида позаду.

Різниця між кінцевими результатами двох рухів – в енергії взаємо-

дій РНК-полімерази з нуклеїновими кислотами. У вихідному претранс-

локаційному стані (положення і + 1, рис. 5.10) реалізуються певні нук-

леопротеїнові взаємодії, що зумовлює знаходження системи в локаль-

ному мінімумі вільної енергії. Із двох інших локальних мінімумів, що

відповідають положенням і та і + 2, другий є більш глибоким, оскільки

для нього реалізуються найсприятливіші взаємодії між активним

центром та 3'-кінцем РНК. Максимуми енергії (бар'єри) між мінімума-

ми на рис. 5.10 відповідають проміжним станам при пересуванні по-

лімерази (часткове порушення взаємодій, конформаційні зміни полі-

мерази). Ці максимуми є досить невисокими, тобто легко долаються за

рахунок теплової енергії. Отже, полімераза спонтанно переміщується

вперед, і система опиняється в більш глибокому мінімумі вільної енергії

(рис. 5.10), звідки починається наступний елонгаційний цикл.

Якщо напрямок переміщення полімерази визначається положен-

ням мінімумів на шкалі вільної енергії, швидкість переміщення зале-

жить від висоти максимумів вільної енергії: чим нижчим є максимум,

тим легше він долається. Висота максимумів залежить від послідов-

ності пар основ у складі гібрида, а також може змінюватись під дією

додаткових факторів (фактори елонгації, шпильки в мРНК тощо).

Під час елонгації здійснюється також

редагування помилок.

Забезпечити стовідсоткову точність операцій з такими невеликими

молекулами, як нуклеотиди, практично неможливо. Зокрема, джере-

лом (одним із основних) помилкового приєднання нуклеотидів під час

транскрипції є таутомерія азотистих основ. Спонтанні перебудови

електронних систем гетероциклів приводять до того, що кожна основа

існує у вигляді двох таутомерних форм: аміно- чи іміноформи для A, C;

енольної чи кетоформи для G, U, T (рис. 5.11). Рівновага зсунута в

бік аміно- та кетоформ, які присутні у складі подвійних спіралей

(див. рис. 3.1) і для яких реалізуються правила комплементарності

A-T, G-C. Але спарювання основ підпорядковується іншим правилам

для мінорних таутомерних форм: наприклад, іміноформа А та аміно-

форма С утворюють між собою два водневі зв'язки, що може відбутися

під час упізнання матриці нуклеозидтрифосфатом. Тоді після хімічної

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

144

реакції, у результаті швидкого повернення до мажорної таутомерної

форми, у складі ДНК-РНК гібрида на 3'-кінці транскрипту залишить-

ся некомплементарна пара нуклеотидів.

Нестабільність гібрида на 3'-кінці у випадку, коли щойно приєдна-

ний нуклеотид є помилковим, приводить до зміни енергетичного ба-

лансу між різними позиціями РНК-полімерази відносно матриці

(рис. 5.10). Найсприятливішою (такою, що відповідає найнижчому

мінімуму енергії) тепер є позиція і, оскільки при цьому гібрид стає

стабільним по всій довжині. Відповідно, відбувається зворотний рух

полімерази з виходом 3'-кінця транскрипту у вторинний канал. При

цьому ніщо більше не фіксує 3'-кінець транскрипту, і всі позиції по-

заду від і (і, і–1, і–2, ...) є майже ізоенергетичними (варіації залежать

від стабільності гібрида, тобто від послідовності нуклеотидів). Отже,

зворотний рух відбувається на невизначену випадкову відстань.

Аміно-

форма

Іміно-

форма

Кето-

форма

Енольна

форма

Рис. 5.11. Таутомерні форми азотистих основ

Коли 3'-кінцевий фрагмент транскрипту опиняється у вторинному

каналі, з полімеразою в тому ж вторинному каналі взаємодіє особливий

фактор елонгації транскрипції, який можна назвати фактором реда-

гування, і який існує у двох варіантах: GreA та GreB (еукаріотичним

аналогом цих факторів є фактор TFIIS, див розділ 6). Gre-фактори,

через конформаційні зміни РНК-полімерази, індукують нуклеазну ак-

тивність її активного центру. У результаті відбувається відщеплення

3'-кінцевого фрагмента транскрипту і в активному центрі залишаєть-

ся новий 3'-кінець (зі стабільною нуклеотидною парою гібрида), який

використовується для відновлення елонгаційного процесу. Загальна

точність процесу транскрипції дорівнює приблизно 10

–6

(частота по-

милково включених нуклеотидів, що залишаються у складі РНК).

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

145

З викладеного видно, що РНК-полімераза є одним із прикладів мо-

лекулярної машини (див. розділ 2). Конформаційна рухливість полі-

мерази забезпечує їй можливість існувати в кількох структурних ста-

нах. Ці стани мають різну спорідненість до певних лігандів (NTP, пари

основ у складі РНК-ДНК гібрида, фактори елонгації). Взаємодії

з лігандами фіксують певні стани. Хімічні реакції, які каталізуються

машиною, приводять до заміни лігандів, а відповідно – і до переходу

в інший структурний стан. Рушійною силою для переміщення поліме-

рази є тепловий рух: структурні блоки полімеразного комплексу

рухаються відповідно до конструкції машини; зв'язування лігандів

та їхня заміна внаслідок реакцій каналізують ці рухи в певних на-

прямах. Результатом структурних перебудов є переміщення поліме-

рази вздовж матриці з одночасним синтезом транскрипту із серед-

ньою швидкістю 40 нуклеотидів/с.

Термінація транскрипції

Як уже йшлося, швидкість пересування РНК-полімерази під час елон-

гації визначається висотою максимумів вільної енергії (див. рис. 5.10).

Якщо ці максимуми (по обидва боки від мінімуму, що відповідає

позиції і + 1 на рис. 5.10) за певних причин виявляться досить ви-

сокими, полімераза опиниться в енергетичній пасці й зупиниться

на досить довгий час.

UAAUCCCACA

G-C

A-U

C-G

G-C

C-G

G-CAUUUUUUU

U C

U G

НК Сигнал термінації

РНК

Рис. 5.12. Типовий сигнал термінації

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

146

Саме це й відбувається під час термінації транскрипції на певних

елементах послідовності. Прокаріотичний сигнал термінації являє

собою інвертований повтор (паліндром – послідовність ДНК, що чи-

тається однаково в обох ланцюгах у напрямках 5'-3'), безпосередньо

фланкований polyТ послідовністю (близько 7 нуклеотидів). Відповідно,

у матричному ланцюзі розташована polyА послідовність, а у складі

транскрипту – polyU. Інвертований повтор у складі транскрипту

утворює дволанцюгову шпильку (рис. 5.12), а ДНК-РНК гібрид за

шпилькою складається з порівняно менш стабільних А-U пар.

Загальний сценарій термінації виглядає наступним чином. Порівняно

нестабільний гібрид ускладнює елонгацію транскрипції, а шпилька –

зворотний рух полімерази. Під час зупинки полімерази (приблизно

на 60 с) здійснюються зумовлені взаємодіями зі шпилькою структурні

перебудови полімерази, руйнування гібрида, відновлення подвійної

спіралі ДНК і визволення транскрипту.

-фактор

Рис. 5.13. ρ-Залежна термінація

У кількох бактеріальних оперонах термінація залежить від так зва-

ного фактора ρ. Цей фактор (моногексамер) зв'язується з РНК-транс-

криптом у певних С-збагачених ділянках. Після цього починається

АТР-залежне пересування ρ-фактора вздовж транскрипту в напрямку

5'-3' зі швидкістю, яка є нижчою за швидкість руху полімерази. Сиг-

нал термінації в цьому випадку, як правило, нічим не відрізняється від

описаних вище термінаторів і зумовлює зупинку полімерази. У результа-

ті ρ-фактор дожинає полімеразу і, продовжуючи рух уздовж РНК,

руйнує гібридну подвійну спіраль (працює як геліказа (helicase) – так

називаються ферменти, що АТР -залежно руйнують подвійні спіралі

нуклеїнових кислот). Результатом є колапс транскрипційного міхура

(відновлення подвійної спіралі ДНК) і визволення транскрипту.

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

147

Регуляція транскрипції

Зрозуміло, що гени та оперони (див. розділ 4) не транскрибуються

постійно, а вмикаються / вимикаються в певні моменти залежно від

зовнішніх умов, стадій клітинного циклу тощо. Головними елемента-

ми, взаємодія між якими приводить до активації чи репресії транс-

крипції, є так звані цис- і транс-елементи. Цис-елементи – це регуля-

торні елементи послідовності ДНК, які фізично зв'язані з даним геном

чи опероном; у прокаріотів часто називаються операторами

і розташовані в безпосередній близькості до промоторів. Транс-

елементи – білкові фактори транскрипції, що вільно дифундують

(транспортуються) у просторі клітини, шукаючи свій цис-елемент,

з яким вони мають специфічну спорідненість. Якщо зв'язування

транс-елемента з оператором приводить до активації транскрипції

(часто за рахунок прямих білок-білкових взаємодій транскрипційного

фактора з РНК-полімеразою, які підвищують її спорідненість до про-

мотора), кажуть, що фактор є активатором і здійснює позитивну ре-

гуляцію. Якщо фактор блокує зв'язування РНК -полімерази (часто за

рахунок зниження доступності промотора), його називають репресо-

ром і кажуть про негативну регуляцію.

Ці загальні принципи регуляції, які, ускладнюючись, зберігаються

також в еукаріотів (розділ 6), реалізуються на стадії ініціації. Крім того,

для регуляції використовуються інші моменти процесу транскрипції.

Найтиповіші механізми регуляції в прокаріотичних системах проілю-

стровано нижче на конкретних прикладах.

Лактозний оперон

Лактозний оперон (lac-оперон) E. coli став у свій час, завдяки дослі-

дженням Жакоба і Моно (François Jacob, Jacques Monod), першою де-

тально вивченою системою регуляції транскрипції. До складу оперона

(рис. 5.14) входять три структурні гени, що кодують ферменти, залу-

чені до утилізації (катаболізму) лактози. Транскрипція всіх трьох генів

здійснюється з одного промотора (синтезується єдина, так звана

поліцистронна, молекула мРНК, яка має три послідовні відкриті рам-

ки зчитування). Промотор оточують дві однакові операторні ділянки

(lac-оператори), що мають спорідненість до lac-репресора, і сайт зв'я-

зування CAP (Catabolite A

ctivator Protein).

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

148

Промотор lac-оперона є слабким – має досить низьку власну спорід-

неність до РНК-полімерази. Навіть якщо в середовищі є лактоза, але

присутня також глюкоза (кращий харчовий субстрат для бактерій),

транскрипція lac-оперона майже не здійснюється. Зниження рівня

глюкози приводить до підвищення внутрішньоклітинної концентрації

сАМР (циклічного аденозинмонофосфату), зв'язування якого з САР ін-

дукує конформаційну перебудову білка та появу його специфічної

спорідненості до відповідного сайта на ДНК (див. структуру комплек-

су на рис. 3.13, б). Взаємодія САР із РНК-полімеразою підсилює її спо-

рідненість до промотора – САР рекрутує полімеразу, яка далі розпо-

чинає синтез мРНК (рис. 5.14).

Оператор

Структурні гени

Промотор

САР-сайт

сАМР

САР

Зниження

рівня

глюкози,

зростання

рівня сАМР

Рибосоми

RNAP

Рис. 5.14. Позитивна регуляція lac-оперона

катаболітним активаторним білком САР

Описаний сценарій позитивної регуляції реалізується лише за тієї

умови, що lac-оператори не взаємодіють з lac-репресором. У разі

відсутності лактози (коли відповідні ферменти її утилізації напевно

не потрібні) гомодимери репресора (незалежно від можливої присут-

ності САР) зв'язуються з обома операторами (рис. 5.15, див. також

рис. 3.22) і при цьому взаємодіють між собою: утворюється тетрамер-

ний комплекс, що утримує петлю ДНК (рис. 5.15). Усередині петлі

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

149

розташований промотор, і це абсолютно запобігає зв'язуванню з ним

РНК-полімерази. Коли з'являється лактоза, її невелика кількість пере-

творюється на алолактозу, яка спрацьовує як індуктор lac-оперона:

зв'язування алолактози з репресором індукує втрату його споріднено-

сті до оператора. Унаслідок руйнування петлі РНК-полімераза зв'язу-

ється з промотором і оперон починає працювати.

репресор

Рис. 5.15. Негативна регуляція lac-оперона lac-репресором.

На вставках: структура димеру репресора в комплексі з оператором (а, 1JWL)

і тетрамерний комплекс із двома операторами (б, 1LBG)

Антитермінація

У системах антитермінації (кілька генів бактеріофага λ, гени рибо-

сомної РНК E. coli) активатори транскрипції запобігають упізнанню

РНК-полімеразою сигналів термінації, що знаходяться всередині ко-

дуючої частини гена. У відсутності факторів ген є неактивним: наяв-

ність термінуючого сигналу приводить до термінації транскрипції та

визволення нефункціонального РНК-продукту. Для певних генів опи-

сано два механізми активації. У першому випадку білок-активатор

упізнає специфічний сайт перед сигналом термінації у складі мРНК.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

150

Зв'язуючись із транскриптом, білок взаємодіє також із РНК-поліме-

разою і впливає на неї таким чином, що термінатор стає непомітним

для ферменту (рис. 5.16, а). У другому випадку транскрипційний фак-

тор упізнає регуляторну ділянку поряд із промотором, взаємодіє з по-

лімеразою і запобігає впізнанню термінатора, що міститься відразу за

стартом транскрипції (рис. 5.16, б).

Термінатор

RNAP

Рис. 5.16. Два механізми антитермінації: фактор транскрипції

запобігає впізнанню термінатора РНК-полімеразою

Атенюація

Із використанням сигналів термінації пов'язана також система

атенюації (attenuation – послаблення), яка використовується, зокрема,

для регуляції активності триптофанового оперона (trp-оперона) E. coli.

Оперон містить 5 структурних генів, що відповідають за синтез аміно-

кислоти Trp, перед ними знаходяться промотор, оператор і лідерна по-

слідовність, з якої розпочинається транскрипція (рис. 5.17, а).

Атенюація використовує ту обставину, що прокаріотична транс-

крипція тісно пов'язана з трансляцією. Лідерна частина РНК містить

стартовий кодон, що впізнається рибосомою, і чотири елементи по-

слідовності: ділянка 1 містить два сусідні триптофанові кодони, ді-

лянки 2–3 і 3–4 є попарно комплементарними, за ділянкою 4 розта-

шована оліго-U послідовність (рис. 5.17, б). Отже, шпилька 3–4, флан-

кована оліго-U, є сигналом термінації транскрипції. Коли концент-

рація Trp є низькою (є потреба в Trp і оперон має бути активним),

рибосома зупиняється на триптофанових кодонах ділянки 1 (оскіль-

ки відсутня й триптофаніл-тРНК). У цьому випадку утворюється

шпилька 2–3 (ділянка 3 не залучається до утворення термінуючої

шпильки), і РНК полімераза продовжує синтез повноцінної мРНК.

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

151

Рибосоми зв'язуються зі стартовими кодонами, що відповідають

структурним генам, і синтезуються відповідні білки.

У разі високого рівня Trp рибосома швидко проходить через ділян-

ку 1 на ділянку 2 і зупиняється на стоп-кодоні. У результаті утворюється

шпилька 3–4 – формується сигнал термінації, РНК-полімераза зупиняє

транскрипцію після синтезу короткої нефункціональної лідерної РНК.

1234

промотор

оператор

ідер

Структурні гени

Стартовий кодон

Висока

концентрація Trp

Низька

концентрація Trp

Низька

концентрація Trp

РН

Висока

концентрація Trp

а б

Рис. 5.17. (а): Схема trp-оперона, на якому синтезуються два

РНК-продукти залежно від внутрішньоклітинної концентрації Trp. (б):

Лідерна РНК і два варіанти спарювання основ у її складі

залежно від розташування рибосоми

trp-Оперон перебуває також під контролем trp-репресора. Алосте-

ричним регулятором репресора є сам Trp: у комплексі з ним репресор

набуває конформаційної форми, що має високу спорідненість до опе-

ратора. При зниженні концентрації Trp репресор дисоціює й ефектив-

ність ініціації транскрипції підвищується в ~70 разів. Атенюація

є додатковим, менш ефективним механізмом регуляції: ефективність

транскрипції підвищується в ~10 разів у відсутності Trp за рахунок

атенюації (у присутності Trp ~10 % РНК-полімераз долають сигнал тер-

мінації й продовжують працювати, у разі відсутності Trp – практично

всі). Сумісна дія атенюації та негативного контролю за рахунок реп-

ресора дозволяє змінювати активність оперона в ~700 разів залежно

від внутрішньоклітинної концентрації Trp.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

152

Регуляція транскрипції бактеріофага λ

Після проникнення в бактеріальну клітину лінійна ДНК бактеріо-

фага

λ (довжиною приблизно 50 тис. пар основ) замикається в кіль-

це бактеріальною лігазою (ligase – АТР-залежний фермент, що ката-

лізує утворення фосфодіефірного зв'язку між 5'- та 3'-кінцевими ну-

клеотидами). Геном фага містить гени, що відповідають за синтез

білків головки та хвоста фагової частинки, реплікацію фагової ДНК,

лізис бактерії, рекомбінацію (вбудовування фагової ДНК у бактеріа-

льний геном), і кілька регуляторних генів, що кодують фактори

транскрипції (рис. 5.18).

Гени

рекомбінації

Гени

голівки

Гени хвоста

Гени

ізису

cIII

cII

cro

Гени

реплікації

Рис. 5.18. Циркулярна ДНК бактеріофага λ.

Стрілочками позначено промотори та напрямок транскрипції:

зелені – сильні промотори, червоні – такі, що потребують активації

Існують два шляхи розвитку фага : лізогенія – лінеаризація фагової

ДНК, вбудовування її в бактеріальний геном і блокування більшості

генів фага; лізис (після інфекції або шляхом вирізання фагової ДНК із

бактеріального геному та її циркуляризації після лізогенії) – активація

реплікації фагової ДНК і синтезу білків оболонки, збирання фагових

частинок та руйнування клітини.