Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Вступ

нуклеотидів і амінокислотними послідовностями білків – генетичний код,

який використовується живими системами для перекладу нуклеотид-

ного тексту в послідовність амінокислот у складі білка.

Наведене визначення гена є, однак, не зовсім точним. Крім білкових

генів, геном кожного організму містить також гени, кінцевими про-

дуктами яких є різноманітні молекули РНК. Але незалежно від типу

гена, первинним продуктом його активності (проміжним для білкових

генів) є молекула РНК. Під час транскрипції нуклеотидна послідов-

ність одного з ланцюгів ДНК за принципом комплементарності пере-

писується в нуклеотидну послідовність РНК – ДНК використовується

як матриця, на якій будується комплементарна РНК-репліка. Молеку-

ла РНК, що синтезується на білковому гені, використовується далі як

матриця для білкового синтезу (матрична або інформаційна РНК –

мРНК). Молекулярні механізми транскрипції та її регуляції у про- та

еукаріотів описано в розділах 5 і 6. Тісно пов'язаний із транскрипцією

процесинг еукаріотичних мРНК (остаточне “дозрівання” функціональ-

но-активної молекули) розглянуто в розділі 7.

Розділ 8 присвячено молекулярним механізмам кінцевого етапу екс-

пресії білкових генів – синтезу білків. Матрицею для білкового синтезу

є молекула мРНК, нуклеотидна послідовність якої за правилами гене-

тичного коду перекладається в амінокислотну послідовність білка під

час трансляції. При цьому знов використовується принцип комплеме-

нтарності: елемент послідовності мРНК упізнається комплементарною

ділянкою у складі особливої молекули РНК – транспортної РНК (тРНК),

яка несе на собі амінокислоту. Специфічне зв'язування певної тРНК із

відповідною амінокислотою є важливою передумовою трансляції. Про-

цес сканування матриці та синтезу амінокислотного ланцюга забезпе-

чується рибосомою – мультимолекулярним комплексом, основою якого

є рибосомні РНК (рРНК), зв'язані з рибосомними білками. Після закін-

чення синтезу на рибосомі амінокислотного ланцюга (або іноді під час

синтезу) відбувається його просторове укладання у специфічну білкову

структуру. Закономірності цього процесу також викладено в розділі 8.

Суттєвим моментом функціонування живої системи є не тільки ре-

алізація (експресія) генетичної інформації, а й збереження її та по-

двоєння з метою передачі наступному поколінню. Подвоєння інфор-

мації – реплікація – це відтворення молекули ДНК у двох ідентичних

дочірніх копіях. Головним механізмом реплікації є вже згадуваний

кілька разів принцип комплементарності: кожен з ланцюгів ДНК вико-

ристовується як матриця для синтезу комплементарної ДНК-репліки.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Спеціальні молекулярні системи забезпечують високу точність синте-

зу ДНК під час реплікації. Процеси виправлення помилок, які все ж

таки виникають під час цього процесу, а також пошкоджень у моле-

кулі ДНК, що з'являються під дією зовнішніх впливів, об'єднано під

назвою репарації ДНК. Молекулярні механізми реплікації та репарації

описано в розділі 9.

Розділ 10 присвячено молекулярним процесам, що приводять до

надзвичайно біологічно важливого “перетасування” генетичного ма-

теріалу – рекомбінації ДНК.

В останньому 11 розділі подано огляд деяких найважливіших ме-

тодів дослідження, використовуваних у молекулярній біології.

З метою полегшення сприйняття інформації в тексті відсутні поси-

лання. Перелік рекомендованої літератури наведено наприкінці кож-

ного розділу. Перелік літератури, наведений нижче, можна вважати

загальним до курсу в цілому.

Зображення структур макромолекул, якими проілюстровано книгу,

створено на основі атомних координат із Банку даних білкових

стр у ктур (PDB – Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/, відпо-

відні коди PDB наведено в підписах до рисунків) за допомогою про-

грамних пакетів PyMOL (http://www.pymol.org/) та UCSF Chimera

(http://www.cgl.ucsf.edu/chimera).

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

Албертс, Б., Брей, Д., Льюис, Дж. и др. Молекулярная биология клет-

ки : в 3 т. – М. : Мир, 1993.

Сингер М., Берг П. Гены и геномы : в 2 т. – М. : Мир, 1998.

Lewin, B. Genes VIII. Upper Saddle River. – New Jerеsy : Pearson

Prentice Hall, 2004.

Lodish, H., Berk, A., Zipursky, L.S. et al. Molecular cell biology.

– New York : W.H. Freeman and Company, 2000.

Weaver, R.F. Molecular biology. – New York : McGraw-Hill Compa-

nies, 2002.

Розділ 1

ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ОСНОВИ

МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ

All science is either physics or

stamp collection.

E. Rutherford

Незважаючи на високу складність живих систем, в основі їхнього

функціонування лежать такі самі закони фізики, які виконуються

для неживої природи – і жодних інших. Сьогодні таке твердження

може здаватися банальним, однак саме воно є базовим для сучасної

парадигми молекулярної біології. Цей розділ має на меті нагадати

деякі найважливіші фізичні закономірності, без розуміння яких

неможливо розглядати принципи структурної організації біологіч-

них макромолекул і взаємодії між ними.

Енергетика взаємодії між атомами й молекулами

Вільна енергія

Розглянемо спрощену модель полімерного ланцюга: мономерні еле-

менти, зображені як червоні кульки на рис. 1.1, що з'єднані гнучкими

перемичками. Нехай мономери при цьому є інертними – не здатними

до взаємодій між собою. Просторова форма – конформація – такого ла-

нцюга буде визначатися лише конфігурацією перемичок. Унаслідок те-

плового руху ланцюг буде постійно змінювати свою конформацію, тоб-

то буде реалізована так звана форма невпорядкованого клубка.

На рис. 1.1 цей стан невпорядкованого клубка зображено як стан 1

ліворуч (представлено кілька з великої кількості W

можливих конфо-

рмацій ланцюга). Певний компактний стан 2 (праворуч) може бути

реалізований значно меншою кількістю W

конформацій перемичок.

Відношення ймовірності f

знайти ланцюг у стані 2 до ймовірності f

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

стану 1 (константа рівноваги K між станами 2 і 1), очевидно, визна-

чається відношенням кількості відповідних конформацій:

Оскільки W

<< W

, то рівновага зсунута ліворуч – у бік клубка. Отже,

за інших однакових умов, імовірність знайти будь-яку систему в певно-

му стані визначається кількістю мікростанів (конфігурацій системи),

якими цей стан реалізується. Чим більша кількість мікростанів (у нашо-

му прикладі W

та W

), тим менш упорядкованим є даний стан системи:

зрозуміло, що ступінь упорядкованості значно зростає для стану 2.

Рис. 1.1. Клубок (1) і компактний стан (2)

полімерного ланцюга

Нехай тепер мономери здатні взаємодіяти таким чином, що при

утворенні контакту між ними в навколишнє середовище виділяється

тепло (знижується внутрішня енергія нашої системи). Як відомо

з термодинаміки, усі процеси за інших однакових умов відбуваються

в напрямку виділення тепла. Імовірність певного стану системи ви-

значається відношенням

ентальпії H (величина, яка за умов постій-

ного тиску та об'єму є еквівалентною внутрішній енергії системи) до

середньої кінетичної енергії теплового руху k

T (k

– константа Больц-

мана (Ludwig Boltzmann), Т – абсолютна температура). А саме, імовір-

Розділ 1. Фізико-хімічні основи молекулярної біології

ність є пропорційною до величини

exp



−





: менше значення ен-

тальпії відповідає зростанню ймовірності (принцип Больцмана). Якщо

зниження ентальпії при компактизації ланцюга є значним, то це мо-

же змінити конформаційну рівновагу на користь стану 2. Таким чи-

ном, у загальному вигляді маємо тепер записати:

22 2

11 1

exp( / )

WHkT

−

або, позначивши S = k

lnW і G = H – TS,

22 2

11 1

exp exp

exp

exp exp

HTS G

kT kT

HTS G

kT kT



−

−−





∆



== = = −





−



−−





, (1.1)

де ∆G = G

– G

Останнє дуже важливе співвідношення має універсальне значення.

У рівнянні (1.1) величина S, що залежить від кількості мікростанів,

є мірою невпорядкованості системи й називається

ентропією. Величина

GHTS=−

, (1.2)

яка була введена фундатором термодинаміки Гіббсом (Josiah Willard

Gibbs), називається

вільною енергією. Саме вона в загальному випад-

ку визначає ймовірність перебування системи в певному стані й, від-

повідно, напрямок, у якому відбувається той чи інший процес. Нас-

тупні твердження, що базуються на рівняннях (1.1), (1.2), виконують-

ся для будь-яких систем, у тому числі (і повною мірою ) для біологічних

та молекулярно-біологічних:

• Зміна стану системи відбувається в напрямку зниження віль-

ної енергії, або: процес може відбуватися тільки тоді, коли він

супроводжується зниженням вільної енергії.

• Рівноважний стан, що може бути стабільним скільки завгодно

довго, відповідає мінімуму вільної енергії.

• Зміна вільної енергії залежить від двох складових: зміни ен-

тальпії (внутрішньої енергії), яка супроводжується виділен-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

ням / поглинанням тепла; зміни ентропії, що характеризує

зростання впорядкованості / невпорядкованості в системі.

При цьому величина ентропійного внеску зростає з температурою

(рівняння (1.2)), тобто за високих температур переважними завжди

стають менш упорядковані стани.

Слід зробити також кілька інших важливих зауважень:

• Вільна енергія є величиною відносною: має сенс тільки різниця

між вільними енергіями різних станів тієї самої системи.

• Різниця між вільними енергіями двох станів системи вказує

тільки на напрямок перетворення одного стану в інший

і нічого не говорить про те, наскільки швидко та яким шляхом

буде відбуватися цей процес. Інакше кажучи, стан із меншою

величиною вільної енергії неодмінно має бути реалізованим,

але може виявитися, що на це потрібно дуже багато часу,

і тому практично даний процес не спостерігається.

• Енергія взаємодії між елементами системи (атомами, молеку-

лами) не обов'язково залежить тільки від ентальпійної складо-

вої, як у простому прикладі, що його ілюструє рис. 1.1. На-

справді, як буде показано нижче, вільна енергія взаємодій

може мати суттєву ентропійну складову або навіть залежати

тільки від ентропійних ефектів.

Рівновага утворення комплексів молекул у розчині

Перш ніж перейти до розгляду типів взаємодій між атомами

й молекулами, розглянемо ще один приклад рівноваги у простій,

але важливій для молекулярної біології системі. У розчині певного

об'єму містяться молекули двох типів (А і В), які здатні утворити

між собою комплекс С (рис. 1.2):

A+B C

!!!"

#!!!

(1.3)

(літерою K тут знову позначено константу рівноваги, у цьому випа-

дку – для процесу утворення / дисоціації комплексів ). Ентропійна

частина вільної енергії кожного компонента містить складову, яка

залежить від концентрації. Наприклад, вільну енергію G

компонен-

та А (що її в цьому випадку називають також хімічним потенціа-

лом) можна записати як

ln[A]GGRT=+

, (1.4)

Розділ 1. Фізико-хімічні основи молекулярної біології

де

– стандартна вільна енергія; R – універсальна газова стала, яка

є константою Больцмана в перерахунку на моль речовини: R = k

– число Авогадро (Amedeo Avogadro); квадратними дужками по-

значено молярну концентрацію А. Зміст рівняння (1.4) дуже простий:

є вільною енергією компонента А при його концентрації 1 моль/л;

зростання концентрації призводить до зниження ентропії (чим більше

молекул, тим менше доступних місць розташування для кожної з них,

тобто тим меншим є кількість мікростанів, див. наведене вище ви-

значення ентропії) і, відповідно, – до зростання вільної енергії.

Рис. 1.2. Взаємодія між молекулами А і В

з утворенням комплексу С

Записавши аналогічні вирази для компонентів В і С, знайдемо різни-

цю між правою та лівою частинами рівняння (1.3) ∆G = G

– G

[C]

[A][B]

GGRT∆=∆ +

, (1.5)

де ∆G

– різниця між відповідними стандартними вільними енергія-

ми, [A] і [B] –концентрації відповідних вільних компонентів у дисоці-

йованому стані. Процес зміни концентрацій у системі буде продов-

жуватись до моменту досягнення рівноваги – такого співвідношення

між концентраціями, коли вільна енергія комплексу дорівнюватиме

сумарній енергії вільних компонентів А і В, і ∆G = 0. (Можна показа-

ти, що загальна вільна енергія розчину буде мінімальною, коли різ-

ниця ∆G між правою і лівою частинами рівняння (1.3) дорівнює нулю.)

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Оскільки ∆G

– це константа, яка залежить від природи компонентів,

співвідношення концентрацій під логарифмом у рівнянні (1.5) також

є константним за рівноважних умов. Саме це співвідношення

і є в даному прикладі константою рівноваги, яка залежить тільки від

різниці стандартних вільних енергій:

[C]

exp

[A][B]



∆

==−





. (1.6)

Отже, якщо при утворенні комплексу вільна енергія знижується

(∆G

< 0), це сприяє взаємодії між компонентами. У випадку, що роз-

глядається, константу K називають також константою асоціації, або

константою зв'язування, а величину ∆G

– стандартною вільною енер-

гією зв'язування. Обидві константні величини є мірою спорідненості

компонентів, що утворюють комплекс: чим негативнішою є енергія

зв'язування (чим більше енергетично вигідних взаємодій реалізується

між компонентами), тим вище значення K і тим стабільнішим є ком-

плекс. Слід також зауважити, що ефективність утворення комплексу,

під якою можна розуміти, наприклад, частку компонента А у складі

комплексу – [C]/([C]+[A]), залежить від концентрації компонентів. Рів-

няння 1.6 є однією з форм запису відомого закону діючих мас, або

принципу Ле Шательє (Henry Le Chatelier), згідно з яким додавання

в систему одного з компонентів зсуває рівновагу в протилежний бік.

Рівняння 1.3 може означати також рівняння хімічної реакції, коли

внаслідок перебудови ковалентних зв'язків (див. нижче) у молекулах

А і В, утворюється нова молекула С. Тоді рівняння (1.4)–(1.6) і виснов-

ки з них також зберігають свою силу. У цьому випадку також знак

зміни стандартної вільної енергії вказує на напрямок, у якому відбу-

вається хімічна реакція. Варто підкреслити ще раз:

усі хімічні реакції

в живих системах відбуваються в напрямку зниження вільної енергії.

Тут може виникнути запитання: якщо, наприклад, вільна енергія

знижується при руйнуванні молекули С на А і В, але клітина має по-

требу саме в молекулі С, чи можливий синтез С? Відповідь є однозна-

чною: синтез С із молекул А і В є неможливим. Але можна використа-

ти “обхідний” шлях: спочатку хімічно модифікувати одну з молекул

(наприклад, утворити молекулу А') і тоді може виявитися, що утво-

рення С із А' і В супроводжується зниженням вільної енергії, тобто

є можливим. Повернемося до обговорення цього питання в розділі 2.

Розділ 1. Фізико-хімічні основи молекулярної біології

Ковалентний зв'язок між атомами в молекулах

Властивості ковалентного зв'язку

Ковалентний (або хімічний) зв'язок – це єдина сила, що підтримує

цілісність певної системи атомів, яка називається молекулою . Осно-

вою утворення ковалентного зв'язку є узагальнення електронів двох

атомів – ефект, що описується у квантовій механіці. Результатом уза-

гальнення є формування так званої молекулярної орбіталі, яка

“належить” двом атомам одночасно й на якій може міститися не більше

двох електронів (принцип заборони Паулі (Wolfgang Pauli)).

••

H C

Метан

Вода

Рис. 1.3. Структура молекул метану й води.

Показано пари електронів, які відповідають ковалентним зв'язкам.

Стрілки символізують зсув електронної щільності до атома оксигену

Наприклад, на зовнішньому електронному шарі атома карбону

знаходиться 4 електрони (рис. 1.3), максимально в цьому шарі може

бути 8 електронів. Він “доповнюється” електронами чотирьох атомів

гідрогену (по одному електрону на кожному атомі), і в результаті

утворюється молекула метану. Аналогічно доповнення зовнішнього

шару оксигену за рахунок двох атомів гідрогену призводить до утво-

рення молекули води (рис. 1.3). Між двома атомами, залежно від їх-

ньої природи, можливо також формування двох (іноді й трьох) моле-

кулярних орбіталей (по два електрони на кожній), тобто утворення

подвійного (чи потрійного) ковалентного зв'язку.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Головні властивості ковалентного зв'язку:

• Ковалентний зв'язок дуже міцний. Інакше кажучи, кожна моле-

кула (про це говорить сам факт її існування) знаходиться

в досить глибокій “потенційній ямі” – мінімумі вільної енергії.

• Кожен атом містить певну кількість електронів, які можуть

бути узагальненими з іншими атомами (або “вакансій” для

електронів на зовнішньому шарі). Тобто кожен атом може

утворити лише певну кількість ковалентних зв'язків – має певну

валентність (наприклад, валентність карбону дорівнює 4,

оксигену – 2, гідрогену – 1 (див. рис. 1.3)).

• Ковалентний зв'язок характеризується певною геометрією. По-

перше, кожен зв'язок має конкретну довжину (зазвичай 1–2 Å).

По-друге, електронні щільності різних орбіталей у молекулі

взаємодіють між собою, і в результаті кожен зв'язок певним

чином орієнтований у просторі відносно суміжних зв'язків.

Типові значення валентних кутів (кутів між зв'язками, що

йдуть від одного атома) становлять близько 109°або 120°.

Слід також зауважити, що ступінь узагальнення електронної пари

між двома атомами залежить від природи цих атомів. Наприклад,

у випадку зв'язку С–Н електронна щільність розподілена приблизно

рівномірно між двома атомами. Такий зв'язок називають неполяризо-

ваним. У випадку зв'язку О–Н, унаслідок високої електронегативності

оксигену (здатності відтягувати на себе електронну щільність), елект-

ронна пара зсунута до цього атома (поляризований зв'язок показано

стрілочками на рис. 1.3). У результаті в молекулі води на оксигені ви-

никає парціальний негативний (приблизно –2/3 від заряду електрона),

а на кожному гідрогені позитивний (+1/3) заряд. Іншим важливим

для біополімерів прикладом електронегативного атому є азот.

Механізм гнучкості полімерного ланцюга

Полімерний ланцюг містить велику кількість атомів, і в його складі пе-

вні мономерні одиниці з'єднані між собою ковалентними зв'язками.

У прикладі , наведеному на рис. 1.1, було припущено (і це справді так для

реальних полімерів), що такий ланцюг є дуже гнучким і здатен існувати

у великій кількості конформацій. Але в чому полягає механізм переходу

від однієї конформації до іншої? A priori можна уявити три можливості:

1) зміна довжини ковалентного зв'язку; 2) зміна валентних кутів;

3) обертання навкруг ковалентного зв'язку. За умов кімнатної (чи фізіоло-

гічної) температури (20–37 °С) ковалентний зв'язок є дуже жорстким що-

до повздовжніх деформацій: практично такі температури не здатні збу-