Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

структури білка. Але ще цікавішою є можливість зміни структурної

форми за фізіологічних умов – саме в цьому сенсі будемо далі розу-

міти конформаційну рухливість білка.

Хоча нативна молекула білка – тверде тіло, вона є досить малень-

кою. Тобто, на відміну від макроскопічних твердих тіл, молекула білка

знаходиться під дією теплового руху як частин власної молекули, так

і оточуючих молекул. Невеличкі конформаційні зміни, перш за все

зміни кутів обертання основного ланцюга та бокових залишків на пе-

ремичках між елементами вторинної структури, можуть зумовити

тимчасових взаємних зсувів ділянок вторинної структури. Але якщо

ці структурні блоки залучені до формування спільного (і щільного) гід-

рофобного ядра, взаємодія між ними швидко відновить вихідну кон-

формацію (у випадку, коли немає додаткових факторів, що можуть

порушити баланс вільної енергії). Ще більша рухливість притаманна

мультидоменним і субодиничним білкам: окремі домени (субглобули)

можуть деформуватися і, що більш важливо, рухатися відносно один

одного. Отже, в основі конформаційної рухливості білка лежить взає-

мний зсув великих структурних блоків (субодиниць, доменів або еле-

ментів вторинної структури) за рахунок невеликих локальних дефор-

мацій. Іноді відбуваються також локальні перебудови вторинної стру-

ктури в різних структурних станах білка – руйнування або утворення

спіралей тощо. Найрадикальнішою структурною зміною є утворення

просторової структури у згаданих неструктурованих білках за умов

їхньої взаємодії з іншими молекулами. Зрозуміло, що структурні пе-

ребудови змінюють форму робочої поверхні молекули, тобто впли-

вають на виконання білком своїх функцій.

Припустимо, що організація білка дозволяє існування двох струк-

турних станів – А і В. Загалом можливо, що обидва стани не розріз-

няються за величиною вільної енергії – тоді половину часу білок про-

водить в одному стані, другу – в іншому. Але, як правило, вільна

енергія одного зі станів (наприклад, А) є нижчою, тоді конформацій-

на рівновага зсунута саме до нього (рис. 2.17, ліворуч).

Як можна перемкнути цю рівновагу на користь стану В (якщо,

наприклад, саме він має виконувати якусь функцію)? Типовий шлях

такого перемикання полягає у використанні певної сполуки (ліганду).

Як ліганд може виступати органічна низькомолекулярна сполука,

іон, інший білок – залежно від конкретної системи. На рис. 2.17 по-

казано ситуацію, коли ліганд має спорідненість саме до форми В і не

має такої до форми А. Це означає, що вільна енергія знижується при

зв'язуванні ліганду з формою В, але зростає при зв'язуванні з фор-

Розділ 2. Білки

мою А, тобто зв'язування з А просто не відбувається. Головним є те,

що у присутності ліганду здійснюється зміна балансу вільної енергії:

стан В (точніше, комплекс BL) стає переважним – його вільна енергія

є нижчою , ніж вільна енергія стану А.

Ліганд

Рис. 2.17. Схема структурних переходів у молекулі білка,

опосередкованих лігандом. G – шкала вільної енергії

Результатом такої фіксації одного зі структурних станів за рахунок

зв'язування з лігандом є зміна робочої поверхні білка. При цьому ро-

боча поверхня часто розташована зовсім в іншому місці відносно ді-

лянки зв'язування ліганду. Ліганд (або його відсутність) виступає ли-

ше сигналом, регулятором, який перемикає структурні, а відповідно,

і функціональні стани. Регуляція такого типу отримала назву алосте-

ричної регуляції (від

άλλος – інший).

Принципи функціонування білків

За вдалим визначенням А.В. Фінкельштейна, усі різноманітні опе-

рації, які виконують білки, можна описати трьома словами:

ЗВ'ЯЗАТИ – ТРАНСФОРМУВАТИ – ВІДПУСТИТИ

Звичайно, не обов'язково кожний білок здійснює всі три операції.

Може виконуватися лише одна з них – зв'язування. Так працюють

імуноглобуліни: з надзвичайно високою селективністю зв'язують ан-

тиген (точніше, антигенний детермінант – невеличку ділянку на пове-

рхні чужорідної для організму молекули). Константа зв'язування є на-

стільки високою, що практично взаємодія є нерівноважною (немож-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

лива дисоціація комплексу). Далі цей комплекс просто руйнується пе-

вними клітинами імунної системи.

Операцію зв'язування з іншими білками й молекулами небілкової

природи виконують білки, що залучені до утворення різноманітних клі-

тинних структур. У цьому випадку зв'язування може змінюватись дисо-

ціацією (наприклад, при утворенні / руйнуванні філаментів цитоскеле-

та), що часто супроводжується структурними змінами в молекулі білка.

Операції зв'язати–відпустити виконують численні регуляторні білки

(транспортні білки, рецептори, фактори транскрипції тощо). Для їхнього

функціонування також часто велике значення мають структурні пере-

будови за механізмом, показаним схематично на рис. 2.17: певний лі-

ганд, виконуючи роль хімічного сигналу, індукує або блокує спорідне-

ність білка-регулятора до певної молекули-мішені. Конкретні приклади

такого типу будуть досить часто зустрічатися в наступних розділах.

Найважливіший для живих систем функціональний клас білків – фе-

рменти, або ензими (enzymes), які здійснюють каталіз усіх численних

біохімічних реакцій, виконуючи три операції: зв'язують субстрати,

сприяють їхній трансформації, відпускають продукти реакції.

Механізм ферментативного каталізу

Енергетичну схему хімічної реакції (рис. 1.6) було розглянуто

в розділі 1. На рис. 2.18 ту саму схему доповнено ефектами, що

є наслідком присутності ферменту. Уповільнення реакції зумовлено

високим значенням вільної енергії активації – у відсутності ферме-

нту реакція практично не відбувається (червоний шлях на рис. 2.18).

Відповідно, каталітична дія ферменту полягає у зниженні цього

енергетичного бар'єра. Оскільки бар'єр, як будь-яка вільна енергія,

має дві складові – ентальпійну та ентропійну (див. розділ 1), фер-

мент здійснює зниження енергії активації двома шляхами (як пра-

вило, обидва мають значення).

• Ентропійний каталіз. Перше, що робить фермент – зв'язує

субстрати у своєму активному центрі за рахунок спорідненос-

ті до них (перша зелена стрілка вниз). Але головне полягає

в тому, що субстрати зв'язуються не аби як, а в певній, най-

більш сприятливій для реакції, взаємній орієнтації та в певній

орієнтації щодо хімічних груп активного центру. Це означає,

що з великої кількості орієнтацій обирається лише одна: вза-

ємодії субстратів з активним центром компенсують ентропій-

ні витрати на впорядкування субстратів.

Розділ 2. Білки

• Ентальпійний каталіз. На шляху перебудови системи кова-

лентних зв 'язків субстратів обов'язково існує проміжна висо-

коенергетична сполука – інтермедіат (див. розділ 1). Саме до

нього активний центр ферменту має високу спорідненість

(вищу, ніж до субстратів), реалізуючи з ним певні взаємодії.

Слова “висока спорідненість” означають, що зв'язаному в ак-

тивному центрі інтермедіату відповідає значно нижча енер-

гія, ніж вільному (рис. 2.18). Саме за рахунок цієї високої спо-

рідненості до інтермедіату активний центр і знижує енталь-

пійну складову енергії активації: бар'єр (зелена стрілочка вго-

ру) залишається, але стає значно нижчим – таким, що його

можна швидко подолати за рахунок теплових флуктуацій.

Інтермедіат

Продукти

Су

страти

реакції

Активний центр

ферменту

∆

– енергія

активації

∆G – сумарний

енергетичний

ефект реакції

Енергія

зв'язування

інте

медіат

Рис. 2.18. Енергетична схема ферментативної реакції.

G – шкала вільної енергії

Наступні дві зелені стрілочки вниз на рис. 2.18 показують закін-

чення процесу: з бар'єру система спускається униз по градієнту віль-

ної енергії – у стан продуктів реакції; далі (і це також важлива подія)

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

продукти, які не мають спорідненості до активного центру (вільна

енергія дисоційованого продукту є нижчою, ніж зв'язаного) звільня-

ють активний центр для інших субстратів.

Для успішного виконання завдання каталізу по обом шляхам ак-

тивний центр ферменту має бути дуже жорстким – мати чітко за-

фіксовану у просторі й часі структуру. Для цього, власне, і потрібна

твердість глобули, яка несе на собі активний центр. І для цього зовсім

не потрібна (навпаки – шкідлива) конформаційна рухливість ферменту.

Білковим ферментам деяких простих реакцій (наприклад, протеазам

на рис. 2.15) конформаційна рухливість практично не притаманна.

Але ферменти часто мають вирішувати складніше завдання: дис-

кримінувати субстрати – здійснити перетворення лише одного суб-

страту з певного набору аналогів. Типовий сценарій подій у цьому

випадку включає в якості “дійових осіб” принаймні дві структурні

форми ферменту, і, відповідно, його активного центру (рис. 2.19).

У відкритій формі активний центр має невисоку спорідненість до

субстратів певного типу (завдяки чому є можливим швидкий перебір

варіантів) і не здатен каталізувати хімічне перетворення. Якщо на-

решті зв'язується потрібний субстрат, він спрацьовує як ліганд на

рис. 2.17 – індукує перетворення ферменту в закриту форму. Такий

процес було названо Кошландом (Daniel E. Koshland) індукованою

відповідністю (induced fit). Закрита форма жорстко фіксує субстрат,

каталітичний центр спрацьовує, і здійснюється хімічна реакція.

У результаті ліганд змінюється, – і відбувається зворотне перетво-

рення білка у відкриту форму із звільненням продуктів.

Рис. 2.19. Структурні перебудови ферменту при дискримінації субстратів

Повертаючись до загальної схеми реакції, зображеної на рис. 2.18,

варто ще раз зауважити: з ферментом чи без, реакція може відбува-

тися тільки в напрямку зниження вільної енергії. Протилежний на-

прямок може бути здійсненим лише за умови використання “обхідних

шляхів” і особливих механізмів – також за участю білків.

Розділ 2. Білки

Механізми використання енергії гідролізу АТР

Джерелом енергії для всіх процесів, що її потребують, у живих сис-

темах є нуклеозидтрифосфати (див. розділ 3). Найчастіше використо-

вується аденозинтрифосфат (adenosine triphosphate, ATP). Ця сполу-

ка, яка утворюється при перенесенні протонів через мембрану хлоро-

пластів (фотосинтез) чи мітохондрій (окислювальне фосфорилювання),

схематично показана на рис. 2.20.

рибоза

Аденін

–

OPO P O P O CH

–

рибоза

Аденін

–

OPO P O CH

–

OPOH

–

+ H

ATP

ADP P

Рис. 2.20. Гідроліз АТР

Вона складається з азотистої основи (аденіну), пентозного цукру

(рибози) та трьох залишків фосфорної кислоти. Гідроліз АТР приво-

дить до відщеплення одного з них – залишається аденозиндифосфат

(adenosine diphosphate, ADP) і неорганічний фосфат Р

(рис. 2.20).

Звичайно, як будь-яка інша реакція, гідроліз АТР потребує каталізу

(за участю досить широкого класу ферментів – АТРаз). Роль АТР як

джерела енергії зумовлена тим, що ця реакція супроводжується до-

сить великим зниженням вільної енергії.

Зв'язок між фосфатними залишками, який руйнується при пере-

творенні АТР на ADP, іноді так і називають – макроергічним. Ця на-

зва не має викликати помилкового уявлення, що цей зв'язок за-

ощаджує надзвичайно велику енергію. По-перше, в цьому зв'язку

немає нічого особливого. По-друге, загальна кількість ковалентних

зв'язків не змінюється в ході реакції – фосфатний залишок перено-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

ситься на молекулу води (рис. 2.20). Змінюється тільки вільна енер-

гія набору хімічних сполук, які зображені на рис. 2.20. Причому го-

ловний внесок у цю зміну дають концентраційні (тобто ентропійні)

ефекти, а не хімічні перебудови молекул.

Скориставшись рівнянням (1.5), різницю вільних енергій продуктів

і субстратів реакції, зображеної на рис. 2.20, можна записати як

[ADP][P ][H ]

[ATP][H O]

GGRT∆=∆ +

де у квадратних дужках – молярні концентрації відповідних компо-

нентів, ∆G* – стандартна зміна вільної енергії, RT = 0,6 ккал/моль

(див. розділ 1). Оцінки показують, що величина ∆G* = +4,8 ккал/моль

(тобто є позитивною – стандартна вільна енергія зростає). Проте, ця

величина не має великого сенсу: енергетичний ефект реакції ∆G до-

рівнює ∆G* при концентраціях усіх компонентів 1 моль/л. Але кон-

центрації води та протонів зберігаються постійними як у буферному

розчині in vitro, так і в клітині; причому вони значн о відрізняються

від 1 моль/л (у розведеному розчині [H

O] = 55,5 моль/л, при рН 7,0

[Н

] = 10

–7

моль/л). Отже, відношення цих концентрацій – також по-

стійна величина, і можна ввести іншу, більш змістовну, стандартну

вільну енергію реакції

[H ]

[H O]

GGRT

∆=∆+

і записати

[ADP][P ]

[ATP]

GGRT∆=∆ +

Підстановка значень концентрацій води й протонів дає

∆G

= –7,3 ккал/моль, що вказує на енергетичну вигідність реакції

гідролізу. Головний внесок дає той факт, що в реакції народжуєть-

ся вільний протон: за законом діючих мас, підтримання на дуже

низькому рівні загальної концентрації протонів має зсувати рівно-

вагу в бік їхнього утворення.

Але в клітинах концентрації усіх компонентів, що залишилися

в останньому рівнянні, також підтримуються на певних рівнях:

Розділ 2. Білки

3÷8 ммоль/л АТР; 0,2÷1 ммоль/л ADP; 2÷8 ммоль/л неорганічного фос-

фату. Підстановка цих значень дає реальний енергетичний ефект від

гідролізу АТР: ∆G = –12 ÷ –16 ккал/моль.

Ця енергія використовується двома шляхами: 1) для хімічної мо-

дифікації субстратів, які самі по собі не можуть вступити в певну ре-

акцію (головним чином, маються на увазі реакції синтезу), оскільки

вона супроводжувалась би зростанням вільної енергії; 2) для вико-

нання механічної роботи молекулярними машинами.

Модифікація субстратів. Розглянемо хімічну реакцію

A+B C, 0G∆>! .

Оскільки утворення С супроводжується зростанням вільної енергії,

цей процес є неможливим. Типовий спосіб, яким жива система вирі-

шує цю проблему, виглядає так:

A+ATP AP+ADP, 0

AP+B C+P , 0

∆<

Тут, власне, немає гідролізу АТР: відбувається перенесення фосфа-

тного залишку на молекулу А (фосфорилювання). Реакція відбуваєть-

ся, оскільки супроводжується зниженням вільної енергії. Для розра-

хунку цієї величини можна скористатися енергіями гідролізу: щоб за-

гальна вільна енергія реакції була негативною, енергія гідролізу АТР

має бути вищою за абсолютною величиною, ніж енергія гідролізу спо-

луки АР, обидві величини негативні. Далі здійснюється друга енерге-

тично вигідна реакція – утворення сполуки С з вилученням неоргані-

чного фосфату – тут знову енергія гідролізу АР має бути вищою за аб-

солютною величиною, ніж (негативна) енергія гідролізу С. З певними

модифікаціями (наприклад, часто переноситься не фосфат, а адено-

зинмонофосфат АМР) саме така схема використовується для здійс-

нення хімічних реакцій синтезу, зокрема синтезу біополімерів.

Молекулярні машини – білкові молекули чи, частіше, макромолеку-

лярні комплекси, утворені за участю білків, які здатні здійснювати

спрямовані рухи. Робота таких машин забезпечує переміщення клі-

тинних структур та органел (наприклад, розходження хромосом при

клітинному поділі), зміну форми клітин, активне переміщення клітин,

активний транспорт через мембрану проти градієнтів концентрації,

м'язові скорочення, переміщення полімераз уздовж матриці при син-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

тезі біополімерів тощо. Усе це потребує енергії, джерелом якої також

є АТР (або інші нуклеозидтрифосфати).

Узагалі машина – це пристрій для перетворення тієї чи іншої фор-

ми енергії в рух. Звичайна механічна машина перетворює будь-яку

енергію в механічну, умовою заощадження механічної енергії при

цьому є висока інерція (маса) частин машини і певна їхня жорстка

взаємна орієнтація. Точніше, конструкція машини зумовлює рухи її

частин тільки по певних заданих траєкторіях.

Молекулярна машина, на відміну від макроскопічної механічної

машини, по-перше, маленька, тобто піддається тепловому руху своїх

власних частин і зовнішніх молекул, що робить неможливим заоща-

дження механічної енергії. По-друге, вона побудована з полімерів,

а це означає, що її частинам притаманна конформаційна рухливість.

Проте внаслідок того, що молекула білка має певну досить жорстку

просторову організацію, конструкція молекулярної машини допускає

не будь-які, а певним чином спрямовані у просторі рухи її частин.

Саме ці особливості молекулярної машини й використовуються для її

роботи. Основні принципи цієї роботи:

• Конформаційна рухливість молекулярної машини забезпе-

чує їй можливість існувати в кількох структурних станах

(двох-трьох), які розрізняються головним чином на рівні

просторового розташування великих структурних блоків –

доменів або субодиниць.

• Структурні стани мають різну спорідненість до певних лігандів.

Взаємодії з лігандами (факторами) фіксують певні стани.

• Хімічні реакції, які каталізуються машиною, приводять до

заміни лігандів , а відповідно – і до переходу в інший струк-

турний стан.

• Рушійною силою для переміщення блоків є тепловий рух:

блоки рухаються хаотично (хоча й у відповідності з конструк-

цією машини); зв'язування лігандів та заміна їх унаслідок ре-

акцій каналізують ці рухи в певних напрямках.

• Результатом структурних перебудов є переміщення структур-

них блоків у просторі та / або зміна характеру взаємодії ма-

шини зі своїм оточенням – рух або всієї машини, або віднос-

ний рух її частин.

Загальний принцип перемикання структурних станів є точно та-

ким, що його було зображено на рис. 2.17 – для фіксації станів вико-

ристовується енергія зв'язування з лігандом. Як ліганд часто вико-

ристовується саме АТР та продукти його гідролізу. Реакція гідролізу

Розділ 2. Білки

(тут відбувається саме гідроліз, як зображено на рис. 2.20) є просто

засобом змінити ліганд – і перемкнути структурні стани. Вільна енер-

гія гідролізу визначає ймовірність проходження реакції (див. рівнян-

ня (1.6)), а відповідно й імовірність перемикання конформацій білка.

Типовий елементарний “такт” роботи молекулярної машини зображе-

но на рис. 2.21: структурна форма А зв'язує АТР з високою спорідне-

ністю; спрацьовує АТРазний каталітичний центр – ADP, що виникає

внаслідок гідролізу, має підвищену спорідненість до форми В – відбу-

вається структурна перебудова. Потім ADP витісняється новою моле-

кулою АТР, і цикл повторюється.

ATP

ADP

B P

A-ATP

B-ATP

B-ADP

A-ADP

Рис. 2.21. Схема роботи молекулярної машини. Праворуч:

рівні вільної енергії структурних станів з різними лігандами

Приблизно за такою схемою працює, наприклад, актоміозиновий

комплекс у м'язових (і не тільки) клітинах (рис. 2.22). Міозиновий фі-

ламент складається з молекул міозину – великого білка досить склад-

ної структури. Від основи цього філаменту відходять глобулярні доме-

ни міозину – головки (показано лише одну). Головка має спорідненість

до АТР і містить АТРазний каталітичний центр. Зв'язування АТР фік-

сує головку в структурному стані, який не має спорідненості до філа-

менту, що складається з молекул іншого білка – актину. Після гідролі-

зу АТР нові ліганди – ADP і неорганічний фосфат – фіксують інший

стан: головка зв'язується з актином, відхиляючись ліворуч. Третій

стан головки індукується окремою молекулою ADP після дисоціації

фосфату: зміщення головки праворуч без втрати зв'язку з актином.

У результаті актиновий філамент зсувається разом із головкою. Далі

ADP витісняється новою молекулою АТР, і все повторюється. Актино-